一種人類結腸癌細胞外基質體外模型及其製備方法
2023-06-16 04:29:31
一種人類結腸癌細胞外基質體外模型及其製備方法
【專利摘要】本發明提供一種人類結腸癌細胞外基質體外模型及其製備方法，該模型為凍幹、無菌、無細胞毒性物質殘留的多孔膜狀，其完全去除細胞成分、並完整保留細胞外基質的成分和結構。製備方法包括：取離體4小時以內的人類結腸癌或直腸癌組織，前置處理；在恆溫搖床中採用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液滅菌；在清洗槽可振蕩的恆溫超聲波清洗器中使用5～100mmol/L氫氧化鈉溶液清洗30～90min進行脫細胞；將材料放於冷凍乾燥機中，按照預先設計的凍幹流程進行冷凍乾燥成型；在無菌的狀態下完成包裝。該方法得到的人類結腸癌細胞外基質體外模型將結直腸癌細胞外基質分離出來單獨研究，構建出結直腸癌微環境和EMT研究的理想體外和動物體內模型。
【專利說明】一種人類結腸癌細胞外基質體外模型及其製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學基礎研究【技術領域】，具體涉及一種人類結腸癌細胞外基質體外模 型的製備方法，以及利用該製備方法得到的人類結腸癌細胞外基質體外模型。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤不僅僅是基因突變造成的腫瘤細胞自主性的增殖或克隆，而是腫瘤細 胞、間質細胞等多種不同類型的細胞成分與特殊的微環境之間相互作用、相互影響的複雜 的發展過程，針對腫瘤細胞本身的研究並不能完全揭示腫瘤的發生發展機制。腫瘤微環 境是一個複雜的綜合系統，由細胞外基質（extracellular matrix，ECM)、間質細胞、各種 肽類因子（生長因子，趨化因子，細胞因子，抗體）及其代謝物組成，控制著腫瘤細胞與間 質細胞之間、細胞與ECM之間的複雜的相互作用。在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤微環境 也在發生階段性的變化，表現為細胞外基質成分的改變，出現活化的成纖維細胞，微血管 密度增加和炎症細胞數量增多等，腫瘤細胞通過上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT)機制對微環境的改變進行應答，失去上皮細胞特徵獲得間質細胞特徵，從 而獲得侵襲性，實現侵潤和轉移。近年來，腫瘤微環境和上皮間質轉化成為腫瘤研究領域最 受關注的兩個焦點問題。揭示腫瘤微環境和EMT的分子機制對於闡明腫瘤發生發展機制以 及尋找新的治療靶點具有重要的科學意義。
[0003] ECM構成了細胞外微環境的主要部分。它是由多種不溶性細胞外大分子按一定比 例和結構建成的複雜的有機的統一整體。它是細胞的生存及活動的場所，具有連接、支持、 保水、抗壓、保護等物理學功能，並且可以通過整合素或其他細胞表面受體與細胞直接發生 作用，調節細胞的生長、代謝、功能、遷移、增殖和分化，進而調整整個組織器官功能。
[0004] 研究顯示，不同的組織，不同的發育階段，不同的病理情況下ECM的組成、結構和 物理學特性均存在顯著差異。近年來，對乳腺癌、卵巢癌等實體腫瘤的研究提示，在腫瘤的 發生發展過程中，ECM發生了類似胚胎發育時的重塑過程，並且，這種重塑過程和腫瘤形成 同時發生。ECM重塑表現在ECM的分子組成、結構和物理學特性等方面的改變。在乳腺癌 中，I 型膠原、FN、骨粘連蛋白（secreted protein, acidic and rich in cysteine，SPARC) 等ECM分子的表達增高；特別值得關注的是，某些僅在胚胎發育時期表達的ECM蛋白，如細 胞粘合素 C(tenaScin-C，TNC)在腫瘤進展期又重新表達。TNC是一種多功能蛋白，在正常成 人組織中低水平表達，在胚胎發育、傷口癒合和腫瘤組織中表達上調。ECM的張力和硬度也 對其功能具有重要影響，可以調節上皮細胞的生長、分化和遷移。多項研究顯示，乳腺癌ECM 中膠原組成和結構發生改變，導致了 ECM的硬度增加 。Paszek MJ等比較了乳腺癌組織和正 常乳腺組織ECM硬度的差異，發現乳腺癌的進展伴隨著ECM硬度的增加，減少ECM的硬度可 以減輕乳腺癌的惡性程度。Levental等的研究顯示，乳腺癌組織中膠原纖維變直並和腫瘤 邊緣垂直，與正常組織存在明顯差異，其中I型膠原表達顯著增加，交聯程度顯著提高。
[0005] 目前的研究認為，在腫瘤進展過程中，腫瘤細胞、間質細胞通過自分泌或者旁分泌 方式釋放多種蛋白酶，特別是金屬基質蛋白酶（MMPs)的水解作用是導致的ECM重構的主要 原因，細胞通過整合素信號通路粘附並水解ECM成分，腫瘤相關纖維母細胞進一步合成新 的ECM分子。另一方面，ECM的重構也會作用於腫瘤細胞，Levental KR等認為，ECM硬度 的增加會影響整合素的表達，通過整合素向細胞傳遞信號，促進腫瘤進展。最新的研究提 示，ECM重構可能是腫瘤上皮間質轉化（EMT)的重要誘導機制。Sume等的體外實驗研究顯 示，FN - EDA的表達可以誘導TGF0信號通路，進而誘發EMT的發生。Mathias RA等通過 對MDCK細胞EMT相關的分泌型蛋白組學分析，發現IV型膠原和laminin5的表達下調，誘 發了 RAS誘導的EMT過程。在腫瘤發生過程中，EMT是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的關 鍵分子事件。通過EMT，腫瘤細胞由具有極性的上皮細胞形態轉變為失去極性，具有高遷移 能力間質細胞形態，從而實現局部浸潤和遠處轉移。E-鈣黏蛋白（E- Cadherin，ECad)用於 維持正常細胞間連接的穩定性，其表達水平與EMT的發生以及腫瘤的侵襲能力呈負相關， 是EMT的關鍵分子，可以作為EMT的分子標誌。EMT過程涉及TGF- β -Smad、Ras/Raf/MAPK、 P38MAPK、Src激酶、Rho激酶、PI3K、Wnt/ β -catenin等多種信號通路。研究表明，表皮生 長因子（FGF)、轉化生長因子-β (TGF-β)、胰島素樣生長因子（IGF)、血管內皮細胞生長因 子（VEGF)和成纖維細胞生長因子（FGF)等生長因子以及Twist、Snail、Slug、NF2icB等多 種轉錄因子具有誘導EMT的作用。
[0006] 到目前為止，所有的ECM相關研究均是通過對腫瘤組織中相關基因或蛋白的表達 水平的研究，或者採用腫瘤細胞在加入ECM成分的三維培養環境中的體外實驗研究，存在 很大的片面性：1.沒有將ECM分離出來單獨研究，不能擺脫細胞或者肽類因子等其他因素 的幹擾，故不能真實反映 ECM的變化特徵；2.由於無法真實的模擬體內ECM，基於體外培養 環境的研究並不能確切的反映組織內ECM對細胞的作用。因此，目前對腫瘤ECM的研究結 果，還遠遠不能揭示腫瘤ECM重構的特點、過程及其對細胞的作用。EMT的研究也存在相似 的不足：在腫瘤組織中，EMT的發生在時間和空間上均呈暫時性和偶然性發生，常規病理學 分析無法檢測EMT。目前大多數探索性研究來自於對EpH4/EpRas、NMuMG、MDCK、MCF-10A和 UM1863等永生化細胞系基於二維或三維培養環境的體外研究，同樣，這些研究也不能真實 反映體內情況。因此，建立理想的腫瘤ECM體外模型對於深入揭示ECM對腫瘤細胞、間質細 胞的作用，揭示腫瘤細胞EMT分子機制具有至關重要的意義。但是，到目前為止，還沒有一 項研究能夠構建出真實反映 ECM的體外模型。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是針對以上現有技術的不足，提供一種人類結腸癌細 胞外基質體外模型的製備方法，該製備方法得到的人類結腸癌細胞外基質體外模型將結直 腸癌細胞外基質分離出來單獨研究，構建出結直腸癌微環境和EMT研究的理想體外和動物 體內模型，可根據不同研究的需要進行細胞學和動物體內實驗，對於揭示結直腸癌發生發 展機制具有重要的科學意義；並且，有可能鑑定出針對腫瘤微環境和EMT的新的分子靶點。
[0008] 本發明所採用的技術方案為：
[0009] -種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)結腸癌組織標本的前置處理：取離體4小時以內的人類結腸癌或直腸癌組織 (手術切除的腫瘤組織），使用純水衝洗3遍；
[0011] (2)滅菌：採用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液法滅菌，該步驟在恆溫搖床中進行，其 中過氧乙酸的體積百分含量為0. 05?0. 2 %，滅菌時間為1?2h，搖床振蕩頻率為30? 600rpm，溫度範圍為4?40°C，然後在磷酸鹽緩衝液中清洗2?5次，每次15min，檢測清洗 後的磷酸鹽緩衝液的pH值，當pH達到6. 5-7. 5後，以流動的注射用水清洗材料，檢測電導 率達到1. 5um/s以下時終止；
[0012] (3)脫細胞：在清洗槽可振蕩的恆溫超聲波清洗器中進行，首先將材料置入清洗 槽中，在清洗槽中注入氫氧化鈉溶液，開啟清洗器，清洗時間為30?90min，氫氧化鈉溶液 濃度為5?100mm 〇l/L，然後關閉清洗器，將氫氧化鈉溶液傾出，注入磷酸鹽緩衝液，開啟清 洗器，清洗時間為10?30min，PBS清洗重複2?5次，檢測清洗後的磷酸鹽緩衝液的pH值， 當pH達到6. 5-7. 5後，流動的注射用水清洗材料，檢測電導率達到1. 5um/s以下時終止；
[0013] (4)成型：將材料放於冷凍乾燥機中，按照預先設計的凍幹流程進行冷凍乾燥：預 凍至-25?50°C，保溫0. 5?4小時，升溫至15°C，保溫4?12小時，升溫至15°C，保溫 0. 5?4小時，升溫至25°C，保溫4小時；
[0014] (5)包裝滅菌：在無菌的狀態下進行包裝，一層採用特衛強紙、另一層採用聚乙烯 塑料，包裝完成後採用環氧乙烷進行滅菌。
[0015] 所述步驟（2)中過氧乙酸的體積百分含量為0. 1 %，滅菌時間為lh。
[0016] 所述步驟（2)中搖床振蕩頻率為100?300rpm，進一步優選為200rpm。
[0017] 所述步驟（3)中氫氧化鈉的清洗時間為60min，氫氧化鈉溶液濃度為5?20mmol/ L、進一步優選為10mmol/L。
[0018] 所述步驟⑶中磷酸鹽緩衝液的清洗時間為20min。
[0019] 所述步驟（3)中清洗槽振蕩頻率為100?300rpm，超聲波頻率為20?80KHZ。
[0020] 所述步驟（3)中清洗槽振蕩頻率為200rpm，超聲波頻率為20?50KHZ (進一步優 選為35?50KHZ，最優為45KHZ)。
[0021] 所述步驟（4)中預先設計的凍幹流程為：預凍至-25°C，保溫2小時，升溫至15°C， 保溫8小時，升溫15°C，保溫2小時，升溫至25°C，保溫4小時。
[0022] 利用上述人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法得到的人類結腸癌細胞外 基質體外模型，為凍幹、無菌、無細胞毒性物質殘留的多孔膜狀，其完全去除細胞成分、並完 整保留細胞外基質的成分和結構。
[0023] 本發明中注射用水的使用標準依照國家藥典中規定。
[0024] 本發明中所述的清洗槽可振蕩的超聲波清洗機是將傳統超聲波清洗機的清洗槽 與機械震蕩器相結合，使清洗槽能夠在超聲波清洗的同時發生機械震蕩，實現了機械振蕩 與超聲波清洗同時聯合發揮作用。
[0025] 與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果：
[0026] 本發明病毒滅活採用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液結合搖床，脫細胞採用低濃度氫 氧化鈉溶液結合機械振蕩和超聲波清洗，提高了病毒滅活、脫細胞工藝的效率，大大降低了 工藝耗時，簡化了工藝流程，整個製備過程僅使用過氧乙酸-乙醇、氫氧化鈉兩種溶液，並 且濃度均遠遠低於現有的製備技術，使製備的材料完全去除了細胞成分，完整保留了細胞 外基質的成分和結構，無細胞毒性物質殘留；並且，在成型工藝中通過採用特殊的凍幹流 程，保留天然ECM三維結構，孔隙不壓縮，適合於進行多種細胞學和動物體內實驗。應用脫 細胞結直腸癌細胞外基質作為結腸癌細胞系或間質細胞的三維培養環境，能夠更真實地模 擬體內腫瘤ECM與癌細胞或間質細胞的相互關係，可以深入揭示ECM對細胞的作用機制。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1所示的是本發明實施例3中的光學顯微鏡圖；
[0028] 圖2所示的是本發明實施例3中的掃描電鏡圖；
[0029] 圖3所示的是本發明實施例3中的透射電鏡圖；
[0030] 圖4所示的是本發明實施例3中的Masson染色圖；
[0031] 圖5所示的是本發明實施例5中的光學顯微鏡圖；
[0032] 圖6所示的是本發明實施例5中的電鏡圖；
[0033] 圖7所示的是本發明實施例5中的細胞劃痕實驗圖。
【具體實施方式】
[0034] 以下結合實施例對本發明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示 性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有說明，本發明使用的所有科學和技術術語 具有與本發明所屬【技術領域】人員通常理解的相同含義。
[0035] 實施例1 :人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備
[0036] 1.結腸癌組織標本的前置處理
[0037] 收集I?IV期結直腸癌標本及相應正常組織各30例，具體的病例資料信息如表1 所示。取lcmXlcmX lcm大小的新鮮結腸癌組織，使用純水衝洗3遍。所述的新鮮組織是 指手術切除的腫瘤組織，離體4小時以內。
[0038] 2.滅菌
[0039] 採用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液法滅菌，該步驟在恆溫搖床中進行，其中過氧 乙酸的體積百分含量為〇. 1 %，滅菌時間為lh，搖床振蕩頻率為200rpm，溫度範圍為4? 40°C，然後在磷酸鹽緩衝液中清洗2?5次，每次15min，檢測清洗後的磷酸鹽緩衝液的pH 值，當pH達到6. 5-7. 5後，以流動的注射用水清洗材料，檢測電導率達到1. 5um/s以下時終 止。該步驟中磷酸鹽緩衝液的配製方法為稱7. 9gNaCl、0. 2gKCl、0. 24gKH2P04、l. 8gK2HP04， 溶於800ml蒸餾水中，用HC1調節溶液的pH值至7. 4,然後加蒸餾水定容至1L。
[0040] 2.脫細胞
[0041] 該步驟在清洗槽可振蕩的恆溫超聲波清洗器中進行，首先將材料置入清洗槽 中，在清洗槽中注入氫氧化鈉溶液，開啟清洗器，清洗時間為60min，氫氧化鈉溶液濃度為 10mm 〇l/L，然後關閉清洗器，將氫氧化鈉溶液傾出，注入磷酸鹽緩衝液，開啟清洗器，清洗時 間為20min，PBS清洗重複2?5次，檢測清洗後的磷酸鹽緩衝液的pH值，當pH達到6. 5-7. 5 後，流動的注射用水清洗材料，檢測電導率達到1. 5um/s以下時終止。該步驟中清洗槽振蕩 頻率為200rpm，超聲波頻率為45KHZ。該步驟中磷酸鹽緩衝液的配製方法同步驟2。
[0042] 3.成型
[0043] 該將已用注射用水清洗潔淨的產品放於冷凍乾燥機中，按照預先設計的凍幹流程 進行冷凍乾燥：預凍至_25°C，保溫2h，升溫至15°C，保溫8h，升溫至15°C，保溫2h，升溫至 25°C，保溫4小時。
[0044] 4.包裝滅菌
[0045] 在無菌的狀態下進行包裝，一層採用特衛強紙、另一層採用聚乙烯塑料，包裝完成 後採用環氧乙烷進行滅菌。
[0046] 表1患者病理資料
[0047]
[0048]
【權利要求】
1. 一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在於包括以下步驟： (1) 結腸癌組織標本的前置處理：取離體4小時以內的人類結腸癌或直腸癌組織，使用 純水衝洗3遍； (2) 滅菌：採用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液法滅菌，該步驟在恆溫搖床中進行，其中過 氧乙酸的體積百分含量為0. 05?0. 2%，滅菌時間為1?2h，搖床振蕩頻率為30?600rpm， 溫度範圍為4?40°C，然後在磷酸鹽緩衝液中清洗2?5次，每次15min，檢測清洗後的磷 酸鹽緩衝液的pH值，當pH達到6. 5-7. 5後，以流動的注射用水清洗材料，檢測電導率達到 1. 5um/s以下時終止； (3) 脫細胞：在清洗槽可振蕩的恆溫超聲波清洗器中進行，首先將材料置入清洗槽中， 在清洗槽中注入氫氧化鈉溶液，開啟清洗器，清洗時間為30?90min，氫氧化鈉溶液濃度為 5?100mm 〇l/L，然後關閉清洗器，將氫氧化鈉溶液傾出，注入磷酸鹽緩衝液，開啟清洗器， 清洗時間為10?30min，PBS清洗重複2?5次，檢測清洗後的磷酸鹽緩衝液的pH值，當pH 達到6. 5-7. 5後，流動的注射用水清洗材料，檢測電導率達到1. 5um/s以下時終止； (4) 成型：將材料放於冷凍乾燥機中，按照預先設計的凍幹流程進行冷凍乾燥：預凍 至-25?50°C，保溫0. 5?4小時，升溫至15°C，保溫4?12小時，升溫至15°C，保溫0. 5? 4小時，升溫至25°C，保溫4小時； (5) 包裝滅菌：在無菌的狀態下進行包裝，一層採用特衛強紙、另一層採用聚乙烯塑 料，包裝完成後採用環氧乙烷進行滅菌。
2. 根據權利要求1所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（2)中過氧乙酸的體積百分含量為0. 1 %，滅菌時間為lh。
3. 根據權利要求1所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（2)中搖床振蕩頻率為100?300rpm。
4. 根據權利要求1所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（3)中氫氧化鈉的清洗時間為60min，氫氧化鈉溶液濃度為5?20mmol/L。
5. 根據權利要求1所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（3)中磷酸鹽緩衝液的清洗時間為20min。
6. 根據權利要求1所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（3)中清洗槽振蕩頻率為100?300rpm，超聲波頻率為20?80KHZ。
7. 根據權利要求6所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（3)中清洗槽振蕩頻率為200rpm，超聲波頻率為20?50KHZ。
8. 根據權利要求1所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模型的製備方法，其特徵在 於：所述步驟（4)中預先設計的凍幹流程為：預凍至_25°C，保溫2小時，升溫至15°C，保溫 8小時，升溫至15°C，保溫2小時，升溫至25°C，保溫4小時。
9. 一種通過權利要求1-8中任一權利要求所述的一種人類結腸癌細胞外基質體外模 型的製備方法得到的人類結腸癌細胞外基質體外模型，其特徵在於：為凍幹、無菌、無細胞 毒性物質殘留的多孔膜狀，其完全去除細胞成分、並完整保留細胞外基質的成分和結構。
【文檔編號】C12N5/071GK104195099SQ201410436867
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】趙博, 王振軍 申請人:首都醫科大學附屬北京朝陽醫院