一種雞黃病毒及其滅活疫苗的製作方法
2023-06-16 02:11:36
專利名稱：一種雞黃病毒及其滅活疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種雞黃病毒及其滅活疫苗，屬於獸醫傳染病學領域。
背景技術：
2010年8月以來，我國福建、廣東、山東等地的蛋雞或(和)種雞發生一種以採食量和產蛋率迅速下降及低死亡為特徵的疫病，俗稱為雞產蛋驟降症，雞黃病毒病。患病的高產蛋率(如85%以上)蛋雞和種雞，發病後4飛天從產蛋率迅速下降至20% 30%，嚴重的於發病後7 10天停產。據不完全統計，該病自發生以來對我國養雞業造成的經濟損失高達3000 萬元。由於該病為新發疫病，目前國內外尚無預防該病的疫苗。
發明內容
本發明的目的在於提供一種雞黃病毒及其滅活疫苗，該疫苗能夠有效控制雞黃病毒病，使目前我國大量養雞生產者減少損失、提高養殖效益。本發明的雞黃病毒(CXid flavivirus) FQ-Cl株，已於2011年5月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，其簡稱CGMCC，保藏登記號為CGMCC NO. 4905。本發明的顯著優點
本發明首次提出了用雞黃病毒FQ-Cl株製備針對雞黃病毒的滅活疫苗，該疫苗的研究和製備解決了我國當前該病無法進行有效預防的缺陷，可有效解決當前雞黃病毒發病率高、造成雞隻產蛋驟降的損失。用雞黃病毒FQ-Cl株製備滅活疫苗，工藝簡單、操作方便，且製備出的疫苗抗原性好、安全性高，對外界環境無任何不良影響，容易通過安全評價。本發明製備的雞黃病毒滅活疫苗不會對雞隻產生任何不良反應，實驗安全性高， 而且對免疫雞隻體內能夠誘導高水平的中和抗體，說明免疫後雞隻能夠有效抵抗雞黃病毒病毒的攻擊。目前，雞黃病毒病在我國的福建、廣東、山東等省均有流行，該疫苗的製備、生產、 應用和普及將為我國有效防控該病提供有力保障。
圖1為FQ-Cl株病毒PCR鑑定；其中1、DNA分子量；2、黃病毒；3、AIV; 4,EDSV ； 5、NDV ;6、IBV ;7、ARV ;8、ILTV ;9、IBDV ； 10、陰性對照；
圖2為病毒系統進化分析。
具體實施例方式實施例1
本發明的雞黃病毒FQ-Cl株，是通過如下方式獲得的
於2010年12月，福清市某蛋雞場210日齡的蛋雞群發生急性的嚴重產蛋下降，但未見CN 102229916 A
說明書
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雞隻死亡，使用抗菌藥物和抗病毒藥物治療無明顯效果。我們通過捕殺致死的發病蛋雞組織中分離到1株病毒，通過實驗室檢測排除了禽流感病毒、雞產蛋下降症候群病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞關節炎病毒、雞傳染性法氏囊病毒，經黃病毒特異性RT-PCR鑑定及測序分析表明，FQ-Cl株病毒為為黃病毒科黃病毒屬病毒。(1)病料的處理從表現產蛋異常的蛋雞中無菌採集其出血卵泡，按常規方法勻漿、反覆凍融3次，4°C，12 000 r/min離心10 min，取上清液，_80°C凍存備用。(2)病原禽胚分離培養將勻漿的病料經尿囊腔接種9日齡SPF雞胚3枚，每枚0. 2 mL，接種後置37°C下恆溫孵化，連續觀察7天。結果，SPF雞胚接種病料後第3天全部死亡， 經無菌檢查為陰性。以SPF雞胚傳接4代，均可100%致死，獲得的病毒SPF雞胚適應毒株即命名為FQ-Cl株。(3) FQ-Cl株病毒的鑑定
分別經禽流感病毒、雞產蛋下降症候群病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞關節炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病毒、鴨黃病毒特異性PCR或 RT-PCR擴增後，只有鴨黃病毒特異性RT-PCR擴增陽性，且擴增目的片段大小與預測的相符，為400bp (見圖1)；目的條帶經膠回收後克隆至pMDIS-T載體，通過測序後以Blast進行比較分析，該株病毒與文獻(萬春和，施少華，程龍飛，陳紅梅，傅光華，張大丙，林芳，林建生，黃瑜.一種引起種(蛋)鴨產蛋鄹降新病毒的分離與初步鑑定；福建農業學報，2010，25 (6) :663-666.)報導的種(蛋)鴨黃病毒同源性高達97. 1%，在系統進化樹上處於同一分支 (見圖2)；而與黃病毒科黃病毒屬代表株坦布蘇病毒同源性為87%。以上結果表明，分離於產蛋率驟降的蛋雞中的FQ-Cl株病毒為黃病毒科黃病毒屬病毒，即為雞黃病毒。(4 )病毒的SPF雞胚傳代
將獲得的FQ-Cl株病毒在SPF雞胚中連續傳代20代，每隔5代次測定一次病毒的ELD5tl， 結果表明該病毒能在SPF雞胚中穩定增殖，對SPF雞胚的致死時間穩定在80h左右。實施例2
本發明的雞黃病毒滅活疫苗，是通過如下方式獲得的
將雞黃病毒FQ-Cl株接種SPF雞胚，收集接毒後死亡的SPF雞胚尿囊液，其中雞黃病毒 FQ-Cl株的含量為IO3 33 ELD50/0. anl，將SPF雞胚尿囊液經甲醛滅活加入白油佐劑進行乳化，製備成常規的油乳劑滅活疫苗。製備的滅活疫苗的免疫結果如下 1、疫苗安全性試驗
1.1 SPF雛雞安全性試驗
購進1日齡SPF雛雞60羽，飼養到7日齡時隨機分成4組，每組15羽，3組實驗組SPF 雞分別經腿部肌注不同批次(共3批)的雞黃病毒滅活疫苗，一次單劑量接種ImL/羽；第4 組為對照組，注射滅菌生理鹽水。對實驗組SPF雛雞與對照組SPF雛雞連續觀察14天，觀察有無發病、死亡和體重變化。結果3個實驗組SPF雛雞和對照組SPF雛雞體重無差異，均無發病、死亡，撲殺後均無肉眼可見病變。1.2蛋雞安全性試驗
從非疫區經檢測雞黃病毒抗體陰性的健康產蛋雞群(220日齡、4100隻、產蛋率為94%左右)選取120隻，飼養1周後(此時產蛋率為93. 33%)隨機分成4個組，每組30隻，其中3 組實驗蛋雞分別經胸部肌注不同批次的雞黃病毒滅活疫苗，一次單劑量接種3mL/只；第4 組為對照組，經胸部肌注滅菌生理鹽水3mL/只。連續觀察14天，觀察各組蛋雞有無產蛋量下降、發病、死亡。結果3個實驗組蛋雞和對照組蛋雞於注射疫苗或生理鹽水後4天內平均產蛋率分別下降9. 13%,9. 13%,8. 33%,8. 33%，第5天後逐漸正常，四組間無差異，且均無發病、死亡，觀察期滿撲殺後均無肉眼可見病變。2、疫苗免疫效果試驗
從非疫區經檢測雞黃病毒抗體陰性的健康產蛋雞群(220日齡、4100隻、產蛋率為94% 左右)選取150隻，飼養1周(此時產蛋率為93. 33%)後隨機分成A、B、C、D、E五個組，每組 30隻，其中A、B、C三個組實驗蛋雞分別經胸部肌注不同批次(共3批)的雞黃病毒滅活疫苗， 一次單劑量免疫接種ImL/只；第D、E兩個組為對照組，經胸部肌注滅菌生理鹽水ImL/只。 連續觀察28天(此時A、B、C、D、E各組蛋雞產蛋率分別為96. 67%,93. 33%,93. 33%,96. 67%、 96. 67%)後，A、B、C、D四組蛋雞分別經胸部肌注攻以FQ-Cl株雞黃病毒ImL/只；E組作為空白對照蛋雞，經胸部肌注滅菌生理鹽水ImL/只。連續觀察14天，觀察各組蛋雞有無產蛋量下降、發病、死亡。結果A、B、C三個實驗組蛋雞和E組空白對照組蛋雞於攻毒或注射生理鹽水後4天內平均產蛋率分別為 83. 33%,83. 33%,80%,86. 67%,分別下降了 13. 34%、10%、13. 33%、10%， 第5天後逐漸正常，四組間無差異，且觀察期內均未見發病、死亡，觀察期滿撲殺後均無肉眼可見病變。而D組蛋雞於攻毒後第1、2、3、4天產蛋率分別為83. 33%,43. 33%、16. 67%、 6. 67%，4天內平均產蛋率為37. 5%，下降了 59. 17% ；第5天起停產。在觀察期內未見蛋雞死亡，但觀察期滿撲殺後可見卵泡出血，卵黃囊水腫增厚或破裂，卵黃液化、混濁。結果表明，本發明的疫苗對預防雞黃病毒病有較好的保護效果。
權利要求
1.一種雞黃病毒，其特徵在於所述雞黃病毒為雞黃病毒(CXid Flavivirus) V^-Cl 株，已於2011年5月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為 CGMCC NO. 4905。
2.根據權利要求1所述的雞黃病毒，其特徵在於所述雞黃病毒FQ-Cl株的分離如下(1)病毒的分離培養從表現產蛋異常的蛋雞中無菌採集其出血卵泡，按常規方法勻漿、反覆凍融4次，4°C條件下12 000 r/min離心10 min，無菌條件下吸取上清液，凍存備用；(2)病原禽胚分離培養將步驟(1)分離的毒株經SPF雞胚連續傳4代，得到的SPF雞胚適應毒株即為所述雞黃病毒FQ-Cl株。
3.權利要求1或2所述的雞黃病毒在製備雞黃病毒滅活疫苗中的應用。
4.一種雞黃病毒滅活疫苗，其活性成分為滅活的權利要求1或2所述的雞黃病毒。
5.一種雞黃病毒滅活疫苗的的製備方法，其特徵在於將權利要求1或2所述的雞黃病毒FQ-Cl株接種SPF雞胚，收集接毒後死亡的SPF雞胚尿囊液，將SPF雞胚尿囊液經甲醛滅活加入白油佐劑進行乳化，製備成常規的油乳劑滅活疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種雞黃病毒及其滅活疫苗，屬於獸醫傳染病學領域。本發明的雞黃病毒為雞黃病毒(ChickenFlavivirus)FQ-C1株，已於2011年5月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCC No.4905。雞黃病毒FQ-C1株接種SPF雞胚，收集接毒後死亡的SPF雞胚尿囊液，將SPF雞胚尿囊液經甲醛滅活加入白油佐劑進行乳化，製備成常規的油乳劑滅活疫苗。本發明製備的雞黃病毒滅活疫苗不會對雞隻產生任何不良反應，實驗安全性高，該疫苗能夠有效控制雞黃病毒病，使目前我國大量養雞生產者減少損失、提高養殖效益。
文檔編號A61P31/14GK102229916SQ20111016391
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月17日 優先權日2011年6月17日
發明者萬春和, 傅光華, 施少華, 林建生, 林芳, 程龍飛, 陳紅梅, 黃瑜 申請人:福建省農業科學院畜牧獸醫研究所