用於生物材料的幹的貯存穩定用組合物的製作方法

2023-06-15 19:56:21

專利名稱：：用於生物材料的幹的貯存穩定用組合物的製作方法
技術領域：
：本發明屬於使玻璃狀乾結構的生物材料穩定的領域。相關技術對於食品、營養品和藥品行業而言在高溫度和高溼度下長期貯存的生物材料的結構和功能的維持非常重要。敏感的生物材料(如，蛋白質、酶、細胞、細菌和病毒)時常必須被保存一段時間以備將來使用。當乾燥對於最終產品而言有害或者不合適時，常常進行簡單的冷凍。就以幹態保存而言，冷凍乾燥在傳統上是最常見的方法。其它方法(如環境空氣乾燥、在環境溫度下真空乾燥(真空乾燥)、或通過使細霧的小滴與暖空氣接觸來乾燥(噴霧乾燥)以及通過脫水來乾燥)一般不適於敏感性生物活性物質，如活的或減弱(attenuated)的細菌和病毒。用於這些方法中的高幹燥溫度導致對生物活性物質自身的顯著損傷。通常，冷凍乾燥工藝可以因緩慢乾燥過程中冰晶的形成而導致活性顯著丟失以及對生物活性劑造成損傷。冷凍乾燥組合了因冷凍和乾燥二者所產生的應力。該工藝的冷凍步驟可以具有非期望的作用，如蛋白質和酶的變性和細胞的破裂。由冷凍造成的損傷在一定程度上可以通過向溶液中添加防凍化合物或試劑來規避。這樣的保護劑一般是在冷凍過程中添加到製劑中以保護細胞膜和蛋白質以及在貯存過程中用以增強穩定性的高度可溶的化學品。常見的穩定劑包括高濃度的糖，如鹿糖、海藻糖、甘油或山梨糖醇(Morgan等，2006;Capela等，2006)。二糖(如蔗糖和海藻糖)是具有良好保護特性的天然冷凍保護劑。海藻糖是特別有吸引力的冷凍保護劑，因為在事實上已將其從在乾旱期間仍處於假死狀態的植物和活有機體中分離出來。已示出海藻糖對多種生物材料而言是有效的保護劑(參見，Crowe，J.H.，1983)。若干專利公開了海藻糖或海藻糖與其它冷凍保護劑的組合在冷凍、乾燥和復水過程中保護蛋白質和其它生物大分子(如酶、血清、血清補體、抗體、抗原、螢光蛋白和疫苗組分)中的用途(美國專利N0.5，556，771)。但是，有一些缺點與使用海藻糖或其它二糖或單糖作為唯一冷凍保護劑相關。海藻糖可能無法充分穿透進入細胞中以保護胞內體積中的活性成分，這可以引起經冷凍乾燥之物質的貯存不穩定。此外，有時必要的是海藻糖的濃度大於按給定保存介質的重量計的60%。與海藻糖的使用相關的甚至更嚴重的問題是單獨使用海藻糖保存的生物材料在長時間內不穩定，特別是在高溫度和/或高溼度環境下貯存的那些。因此，顯著的挑戰仍然是開發使經乾燥材料的乾燥損失最小化同時實現充分的貯存穩定性的最佳製劑和乾燥工藝。與海藻糖和冷凍乾燥工藝相關的一些問題已通過採用某些製劑與玻璃態(特別是糖玻璃)真空乾燥的組合而被解決(美國專利N0.6，190，701)。在那些製劑中，生物活性劑被保護在對抗不利環境(如高溫度和高溼度)的玻璃狀基質中。但是，在這些製劑中，作為環境中的水分的水的存在起到了增塑劑的作用，並且具有降低玻璃狀基質的玻璃化轉變溫度(Tg)的作用。在較高的水含量下，Tg顯著地降低到幹製劑在室溫下為非期望的橡膠態或塑性狀態的程度。保持製劑的玻璃形式的優點包括固體的物理穩定性增加和有害的分子內反應減少。水-食物聚合物相互作用的物理化學的詳細討論(如與玻璃態及其轉化溫度相關)可見於M.LeMeste等(2002)中。但是，無定形系統(如物理不穩定性和較高的化學反應性)的限制成為其廣泛商品化的限制。因此，存在對可用於廣泛範圍的生物材料之穩定用組合物的需要。還存在對可以有效地用於涉及環境溫度乾燥的冷凍乾燥工藝和乾燥工藝二者的穩定用組合物的需要。還需要與目前所使用的那些相比成本較低的組合物混合物。最後，重要地，需要為在材料的運輸和貯存過程中可以遇到的升高的溫度和不同程度的溼度下，長時間保存生物材料提供穩定的介質，同時在復水後仍然保持顯著量的活性的組合物混合物。所有這些需要由本發明的組合物混合物、乾燥方法和所得的保存生物材料組合物滿足。發明概述本發明包括用於在貯存中保存敏感性生物活性材料的組合物和乾燥方法，所述敏感性生物活性材料如肽、蛋白質、激素、核酸、抗體、藥物疫苗、酵母、細菌(益生菌或其它)、病毒和/或細胞懸液。本發明的組合物包含二糖、寡糖和多糖的碳水化合物混合物和有機酸(優選為檸檬酸和/或抗壞血酸)的離子。製劑是通過將所有固體組分分散於溶液中來製備的。通過本領域中公知的方法(如液氮或乾冰)迅速凍結溶液以形成小珠、線或滴。可以將凍結的珠貯存於冷藏器(_30°C至-80°C)中用於之後以凍結狀態使用或者置於處於凍結狀態的盤上以在常規的冷凍乾燥機中乾燥。優選的乾燥步驟任選地通過以下而起始的:短暫清潔，在小於2000毫託的真空壓力和期望溫度下的初級乾燥步驟。在材料的次級乾燥步驟和最終乾燥步驟，施加了全真空壓力和升高的溫度以獲得乾材料的最終期望的水活性。在一個特定實施方案中，生物材料包括活細菌(例如，益生菌)。合適的微生物的實例包括但不限於:酵母如酵母屬(Saccharomyces)、德巴裡酵母屬(Debaromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)和球擬酵母屬(Torulopsis);黴菌如麴黴菌屬(Aspergillus)、根黴菌屬(Aspergillus)、毛黴菌屬(Mucor)、青黴菌屬(Penicillium)和球擬酵母屬(Torulopsis);以及細菌如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、球菌屬(Melissococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、Kocuriaw>葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈鎖球菌屬(Peptostrepococcus)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、Weissella、氣球菌屬(Aerococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)和乳酸菌屬(Lactobacillus)。合適的益生微生物的特定實例由下述物種來表示，並且包括這些物種中的所有培養生物型:黑麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(A.0ryzae)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、緩慢芽胞桿菌(B.lentus)、地衣芽胞桿菌(B.1icheniformis)、糖化菌(B.mesentericus)、短小芽抱桿菌(B.pumilus)、枯草桿菌(B.subtilis)、納豆芽抱桿菌(B.natto)、嗜澱粉擬桿菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛擬桿菌(Bac.Capillosus)、瘤胃生擬桿菌(Bac.Ruminocola)、Bac.Suis、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、動物雙歧桿菌(B.animalis)、短雙歧桿菌(B.breve)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidmn)、嬰兒雙歧桿菌(B.1nfantis)、乳酸雙歧桿菌(B.1actis)、長雙歧桿菌(B.1ongum)、偽長雙歧桿菌(B.pseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌(B.thermophilum)、Candidapintolepesi1、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳酪腸球菌(Enterococcuscremoris)、二乙醯乳酸腸球菌(E.diacetyIactis)、屎腸球菌(Efaecium)、中間腸桿菌(E.1ntermedius)、乳酸腸球菌(E.lactis)、E.muntd1、嗜熱腸球菌(E.thermophilus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、消化乳桿菌(L.alimentarius)、食澱粉乳桿菌(L.amylovorus)、完全乳桿菌(L.crispatus)、短乳桿菌(L.brevis)、Lcase4L.curvatus、纖維二糖乳桿菌(L.cellobiosus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckiiss.Bulgaricus)、香腸乳桿菌(Lfarciminis)、發酵乳桿菌(L.fermentum)、格氏乳桿菌(L.gasseri)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、乳酸乳桿菌(L.lactis)、乾酪乳桿菌(L.ρIantarum)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、致腐乳桿菌(L.sakei)、唾液乳桿菌(L.salivarius)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、啤酒球菌(P.cereviseae)(得酸球菌，damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Prop,shermanii)啤酒酵母(Saccharomycescereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、金黃色葡萄球菌(Staph)、木糖葡萄球菌(xylosus)、嬰兒鏈球菌(Streptococcusinfantarius)、鏈鎖狀球菌(Strep)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(salivariusss.Thermophilus)、嗜熱鏈球菌(Strep.Thermophilus)和乳酸鏈球菌(Strep，lactis)。在一個實施方案中，製劑包含二糖、寡糖和多糖的碳水化合物混合物，其中包埋有生物活性材料。合適的多糖的實例包括但不限於鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、羧基-甲基-纖維素、膠質、藻酸鈉、藻酸的鹽、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素、角叉膠、吉蘭糖膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃原膠、槐豆膠、殼聚糖和殼聚糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、澱粉和改性澱粉。合適的寡糖的實例包括但不限於環糊精、菊粉、F0S、麥芽糊精、葡聚糖等；及其組合。合適的二糖的實例包括但不限於乳糖、海藻糖、蔗糖等。在一個特定實施方案中，優選的多糖是藻酸鈉或吉蘭糖膠。優選地，碳水化合物混合物包含按總乾物質的重量百分數計0.1%至10%的多糖、1%至10%的寡糖和10%至99%的二糖。在另一實施方案中，碳水化合物混合物包含重量比為10:0.1-4:0.1-2的二糖、寡糖和多糖，更優選地，其中，二糖/寡糖/多糖的重量比為約10:0.2:0.1至約10:2:1。在本發明的又一實施方案中，碳水化合物混合物中的多糖與二價金屬離子交聯以形成堅固的水凝膠。在另一實施方案中，組合物包含顯著量的玻璃增強用化合物(glassenhancingcompound)，所述玻璃增強用化合物包括有機酸的鹽，所述有機酸如乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡萄糖酸、穀氨酸等)的鹽。鹽可以包括陽離子如鈉、鉀、鈣、鎂等。實例包括檸檬酸鈉、乳酸鈉、馬來酸鈉、葡萄糖酸鎂、抗壞血酸鈉等。優選具有高玻璃化轉變溫度(Tg)和高可溶性的鹽。最優選的有機酸是檸檬酸及其鹽(如檸檬酸鈉或鉀、檸檬酸三鈉的脫水物)和抗壞血酸及其鹽(例如，抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鎂)。幹組合物中檸檬酸或抗壞血酸離子的優選重量使得離子與碳水化合物之摩爾數的摩爾比為約0.0l至約0.3，更優選為約0.1至約0.2。其它可用的玻璃增強劑(glassenhancer)包括蛋白質、蛋白質水解產物、多肽和胺基酸。這些包括明膠、白蛋白、乳清蛋白質、大豆蛋白質、酪蛋白、酪蛋白酸鹽、免疫球蛋白、大蛋白質、婉蛋白質、棉杆蛋白質或其它食物和奶品或植物蛋白質和/或它們的水解產物。聚胺基酸的實例包括聚丙氨酸、聚精氨酸、聚甘氨酸、聚穀氨酸等。可用的胺基酸包括賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或組氨酸，及疏水性胺基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)和甲胺如甜菜鹼。幹組合物中蛋白質、蛋白質水解產物和胺基酸的優選的總量為約1%至約30%的總質量的碳水化合物混合物，最優選為約5%至約20%的碳水化合物的質量。理想地，與非GRAS的那些相比，優選一般地被認為安全(GRAS)的化合物。應當注意，組合物中玻璃增強劑的合適的量可以取決於幹組合物的期望性質。應當根據期望的貯存條件來確定玻璃增強劑的合適的量。例如，包含碳水化合物混合物和蛋白質或蛋白質水解產物的組合物可用於增強生物材料的化學穩定性，同時在溫和的溫度和相對溼度(如25°C和25%RH)下貯存。檸檬酸鹽離子可以優選地構成玻璃增強劑以獲得在較高溫度和溼度暴露下的穩定的額外益處。可替選地，可以是這樣的情況:更優選檸檬酸鹽/抗壞血酸鹽離子與另一玻璃增強劑(如蛋白質或蛋白質水解產物)的組合來構成組合物。生物材料和組合物的優選的混合工藝通過向包含生物材料的濃縮的培養溶液或介質溶液中添加總幹組合物混合物來進行。培養基中生物材料的重量分數通常為約5%至30%w/v，更優選為約10%至20%w/Vo培養基中組合物混合物的添加的重量分數通常為約10%至約60%，更優選為約20%至40%。混合的漿料中的最終固體含量為約20%至約60%，更特別地為約30%至約50%。優選地，將溶液在室溫下混合或者輕微溫熱至有助於使材料在粘性溶液中溶解(例如20°C至40°C)。在本發明的變體中，將製劑中碳水化合物混合物的總量調節至獲得粘度和密度使得進行有效乾燥同時避免可能在乾燥步驟過程中發生的橡膠形成或過度起泡的期望製劑。優選的漿料粘度為約1，OOOcP至約500，OOOcP，最優選的範圍為約10，OOOcP至約300，OOOcP0可以通過本領域中公知的任意方法來獲得具有期望粘度和密度的最終漿料，例如，稍微調節碳水化合物混合物中多糖的量，或者通過脫氣或注氣如空氣、氮氣、二氧化碳、氬氣等。本發明的生物材料通常迅速凍結至_30°C至_180°C，更優選地，通過霧化、滴下或注入液氮浴中來在液氮中迅速凍結。從液氮浴收集顆粒、珠、線或滴，並在冷凍乾燥器或真空乾燥器中乾燥，或者可替選地，將它們貯存在冷藏器(_30°C至-80°C)中以在之後以凍結形式使用或者直至乾燥。一般，可用的乾燥工藝技術包括噴霧乾燥；凍幹然後碾磨使粉末微粉化；霧化到冷表面上，然後升華並收集微粉化粉末；在高於漿料的冷凍溫度的溫度下(_20°C至50°C)，在真空烘箱或離心蒸發器中蒸發乾燥非凍結溶液，然後碾磨為期望的粒徑。所得的粉末顆粒是玻璃狀或結晶的，其中大部分玻璃狀材料包被在表面上。用玻璃狀材料包被生物材料的優點是增加產品的物理穩定性和減少顆粒中不利的分子間反應。在一個優選實施方案中，將凍結顆粒加載於盤上，並立即轉移到真空乾燥室，在真空乾燥室中，乾燥過程以三個主要步驟進行，包括:(I)在小於2000毫託的真空壓力和高於漿料的凝固點之溫度下的初級乾燥步驟；和(3)在全真空壓力和升高的溫度下的次級及最後乾燥步驟，時間為足以將乾燥製劑的水活性降低至0.3Aw或更小。該幹的和穩定的生物組合物可以直接以片使用，或者研磨為粉末並且篩至平均粒徑為約10μm至約1000μm。製劑可以作為濃縮粉末、作為重構液體(例如，飲料)或者其可以以片或粉末形式整合入現有食物或飼料產品中而直接施用於動物，包括人。在下文中，將在優選實施方案的詳細描述中對本發明的這些和其它優點和特徵進行描述。圖1示出市售益生菌和本發明的幹組合物中的益生菌的加速穩定性。圖2示出在加速貯存條件(37°C和33%RH)下，組合物中玻璃增強劑與碳水化合物混合物的多種摩爾比對益生菌穩定性(副乾酪乳桿菌，L.paracasei)的作用。圖3示出本發明的組合物對益生菌嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)的貯存穩定性的作用。在24°C和33%RH的加速貯存條件下，針對幹益生菌的穩定性測試537天。圖4示出多種玻璃改進劑化合物對益生菌嗜酸乳桿菌的貯存穩定性的作用。在24°C和43%RH的加速貯存條件下，針對幹益生菌的穩定性測試180天。圖5示出多種蛋白質水解產物/糖的比例對益生菌乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)的貯存穩定性(35°C和43%RH)的作用。圖6示出益生菌鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)的最大穩定性的pH優化(在40°C和33%RH的加速貯存條件下8周)。發明詳述定義應當理解，本文中所使用的術語是僅出於描述特定實施方案的目的，而並非意在限制。如本說明書和所附權利要求書中所使用的，除非內容清楚地指出，否則單數形式包括複數指稱。因此，例如，提及「蛋白質」包括單一蛋白質或者兩種或者更多種蛋白質的組合；提及「酶」、「細菌」等包括單一細菌或者若干類型的混合物等。在描述和要求保護本發明時，將根據下文中給出的定義來使用以下術語。「生物材料」、「生物組合物」或「生物活性製劑」是指形式為使生物活性成分或生物活性劑的生物活性明確有效的製劑。「玻璃增強劑」是在臨界溫度-玻璃化轉變溫度(Tg)下能夠形成無定形結構或玻璃化結構的化合物。如果玻璃增強劑在其Tg下乾燥，則將形成玻璃。但是，如果玻璃增強劑在高於其Tg下乾燥，則不形成玻璃。在玻璃狀結構形成期間，生物物質可以變得包埋於玻璃結構中。適用於本發明的玻璃增強劑包括但不限於有機酸(如乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡萄糖酸、穀氨酸等)的鹽。鹽可以包括陽離子如鈉、鉀、鈣、鎂、磷酸鹽等。其它可用的玻璃增強劑包括蛋白質、蛋白質水解產物、多肽和胺基酸。玻璃形成劑的組合也包含於單一組合物中。出於本發明的目的用於獲得玻璃化結構的方法一般是溶劑升華和/或蒸發技術。理想地，與非GRAS相比，化合物優選為GRAS化合物。「碳水化合物」或「多羥基化合物」是指主要由碳、氫和氧構成的多糖。多糖通常由以線性或非線性形式連接的重複結構單元的糖骨架構成，一些重複結構單元包含帶正電或帶負電的化學基團。重複單元可以為兩個至數百萬個不等。可用的多糖包括還原性糖和非還原性糖，和糖醇、二糖、寡糖、水溶性多糖及其衍生物。兩個單糖連在一起形成二糖。用於形成二糖的兩個單糖可以相同或不同。可用於本發明的碳水化合物混合物中的二糖的實例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、異麥芽糖。也可以使用硫酸化二糖。小數目的單糖連接在一起(通常形成三至十)形成寡糖。用於形成寡糖的單糖可以是相同組成的糖或不同組成的糖。適於使用的寡糖的實例包括菊粉、麥芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其組合。大數目的單糖連接在一起(一般大於十)形成多糖。用於形成多糖的單糖可以是相同組成的糖或不同組成的糖。適於使用的多糖的實例包括但不限於甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素；可溶性澱粉或澱粉級分、黃原膠、瓜爾膠、果膠、角叉膠、半乳甘露聚糖、吉蘭糖膠，包括這些的任意衍生物，鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、羧基-甲基-纖維素、藻酸鈉、褐藻酸的鹽、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、阿拉伯膠、槐豆膠、殼聚糖及殼聚糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、澱粉和改性澱粉以及環糊精。「穩定的」製劑或組合物是這樣的製劑或組合物:其中生物活性材料在貯存時基本保持其物理穩定性、化學穩定性和/或生物活性。穩定性可以在選定的溫度和溼度條件下測量一段選定的時間。在材料在事實上已貯存一段給定時間之前，可以使用趨勢分析來評估預期的貯存期限。例如，對於活細菌，穩定性被定義為在預定的溫度、溼度和時間段的條件下，失去Ilog的CEF/g幹製劑所需的時間。對於細菌，「活力」是指在適於細菌生長的營養介質上形成菌落(CFU或菌落形成單位)的能力。對於病毒，「活力」是指在合適的宿主細胞中感染和繁殖，導致在宿主細胞的菌苔上形成噬斑的能力。「環境」室溫或條件是在給定環境中的任意給定時間的那些。通常，環境室溫為22°C至25°C，環境大氣壓和環境溼度易於測量並且根據一年中的時間、天氣和氣候條件、高度等而變化。在上下文中，幹製劑組合物的「水活性」或「Aw」是指水的可用性，並且表示系統中水的能量狀況。其定義為樣品上方水的蒸汽壓除以在系統溫度下純水的蒸汽壓。純蒸餾水的水活性恰好為I或者Aw=1.0。在上下文中，貯存穩定性的「相對溼度」或「RH」是指在給定溫度下空氣中水蒸汽的量。相對溼度通常小於使空氣飽和所需的溼度，並且以飽和溼度的百分數表示。「幹」及其變體是指脫水或無水(即，基本缺乏液體)的物理狀態。例如，乾燥包括噴霧乾燥、流化床乾燥、凍幹和真空乾燥。「凍幹」或冷凍乾燥是指通過快速冷凍和在凍結狀態下脫水(有時稱為升華)來製備幹形式的組合物。凍幹發生在導致聚合物結晶的溫度下。該過程可在足以保持凍結產品優選地低於約2000毫託)於真空下發生。對於本文所述的工藝，「次級乾燥」是指在高於製劑的冷凍溫度和接近熱源之溫度的溫度下發生的乾燥步驟。該過程可在足以降低製劑的水活性的壓力下(優選地小於約<1000毫託)於真空下發生。在通常的製劑乾燥工藝中，次級乾燥步驟將製劑的水活性降低至Aw為0.3或更小。本發明的組合物和乾燥方法解決了提供經濟有效並且可以以工業規模凍結或乾燥的製劑的問題，所述製劑包含敏感的生物活性材料，如肽、蛋白質、激素、核酸、抗體、藥物、疫苗、酵母、細菌、病毒和/或細胞懸液，其具有顯著延長的幹態貯存期限。本發明提供了組合物保存和乾燥的方法，其包括由無定形玻璃狀結構的高度可溶的化合物來包圍生物材料。冷凍和乾燥工藝包括:將生物材料與組合物在漿料中混合，在液氮中迅速冷凍(snap-freeze)所述組合物眾料以形成滴、線或珠,在高真空下清潔凍結顆粒,然後通過在減壓方案下蒸發水分同時向組合物供熱來乾燥糖玻璃形成物中的生物活性材料。本發明基於這樣的驚人發現:可以將生物材料保護於玻璃狀結構中同時保持基本活性。當根據本發明將生物材料與組合物混合物組合物並真空乾燥時，在長時間暴露於苛刻的溫度和溼度條件下的過程中獲得了優越的穩定性。本發明包括含有生物材料、可溶性碳水化合物與玻璃增強用羧酸鹽的混合物的組合物。本發明的組合物與簡單地通過普通乾燥方法乾燥的非粘性或濃縮的含糖組合物在其物理結構和功能上有本質的不同。例如，美國專利N0.6，919，172公開了用於肺部給藥的霧化組合物，其包含多種碳水化合物與檸檬酸鈉的混合物。但是，該專利中描述的組合物缺乏對於增加的穩定性以及對於乾燥具有高濃度糖的溶液的過程中期望物理結構的形成而言所必需的添加的蛋白質樣化合物。該專利中所述的組合物還缺乏使得有效乾燥解凍的溶液或者未凍結的溶液以增強玻璃形成的粘性或水凝膠結構。在本領域中，通常通過在真空下使溶液起泡或者煮沸溶液以促進有效乾燥來獲得增強的玻璃狀結構。起泡步驟一般導致深度煮沸和溶液的噴發，這是乾燥未凍結溶液的不可避免的結果，因此，在小瓶或容器中只能得到溶液的非常低的負荷容量(參見，例如美國專利6，534，087，其中最終起泡的產物的厚度為小於2mm)。本發明的組合物和乾燥方法避免了製劑的煮沸和起泡，從而使得單位乾燥面積有高得多的負荷，因此，可以易於按比例擴大至生產大量材料而無需使用特殊設計的容器和託盤或裝置。廣泛範圍的生物材料可以與本發明的組合物一起使用以形成本發明的水性保存介質。然後，可以使該保存介質經曆本發明的乾燥過程以製成生物材料的穩定乾粉。這些生物材料包括但不限於:酶，如胰腺酶、脂肪酶、澱粉酶、蛋白酶、phitase、乳酸脫氫酶；蛋白質，如菊粉；疫苗；病毒，如腺病毒；細胞，包括原核細胞(包括細菌)和真核細胞，其它生物材料，包括藥物、核酸和脂質囊泡。益生菌已示出特別地獲益於本發明的組合物和乾燥方法。根據本發明的組合物和方法以製備了穩定的幹益生菌粉末，所述方法包括將益生菌的新鮮凍結的培養物或者幹培養物與碳水化合物和玻璃增強用化合物的混合物混合，在液氮中快速冷凍該粘性製劑以形成凍結的固體滴、線或珠，並通過初始地施加充分的真空壓力來真空乾燥以清潔並穩定凍結顆粒的結構，將製劑溫度增加至高於冷凍溫度，並提供20°C及更高的熱源以促進初級的水去除。可以通過調節真空壓力以及通過將熱傳導至製劑來實現將製劑的溫度保持為高於凝固點。為了完成乾燥過程並且進一步將製劑的水活性降低至低於0.3或更低的Aw，在最大的真空壓力以及升高至70°C的溫度下施加次級乾燥步驟。這樣的組合物可以在如40°C和33%RH的苛刻的貯存條件下保持穩定60天或者更長。組合物的製備用於製備本發明的穩定的凍結生物材料或者乾粉生物材料的組合物包含碳水化合物混合物和玻璃增強劑。當這樣的材料與優選的生物活性材料在液氮中混合時形成珠線或滴，並且根據本發明方法可以有效地在無定形的玻璃狀結構中乾燥，並且提供大量的穩定的幹組合物用於貯存和施用所述生物活性材料(參見圖1-乾燥後不同製劑的物理觀察結果和水活性(Aw))。碳水化合物混合物為製劑提供了結構穩定性和/或為生物活性材料提供了物理和化學保護的益處，並且預防或減少重構或復水的不利作用。碳水化合物混合物中的多糖級分可以為製劑提供增稠的粘度和提供在減壓下對製劑密度特性的更佳的控制以及為本發明的幹製劑組合物提供增加的結構輕度。優選的多糖(特別是活有機體)是水溶性膠，因為它們在溫和溫度下形成粘性凝膠的特殊性質。還發現某濃度的膠可以通過為製劑提供合適的粘度和密度並且使得製劑在特定粘度的初級液體乾燥步驟過程中有效乾燥製劑來有效地在真空下穩定製劑結構。某些膠還可以通過與二價或多價陽離子(例如，藻酸鹽、膠質、殼聚糖)交聯或者通過溫度或PH變化(例如，凝膠、CMC、CAP、吉蘭糖膠)來形成水凝膠。水凝膠溶液將防止與未凍結溶液的真空乾燥相關的問題。碳水化合物混合物中的的二糖級分包括多種糖和糖醇。優選的二糖是在凍結溫度(例如，低於-20°C)下以及在水去除過程中不使製劑中的生物活性材料結晶和/或破壞或失穩的那些。例如，生物活性材料可以物理地包埋於玻璃形成糖(如蔗糖、乳糖或海藻糖)中以促進在乾燥過程中分子結構的保持並且為幹態的無定形基質賦予結構硬度。合適的二糖可以有效地代替乾燥過程中水合作用失去的水，以防止對細胞膜和酶的變性的破壞(參見綜述Crowe等，1998)。組合物中二糖的其它功能可以包括保護生物活性材料免於暴露於具有破壞性的光、氧、氧化劑和水分。合適的二糖必須易於溶解於溶液中。海藻糖是特別有吸引力的保護劑，因為它是見於在乾旱期保持休眠狀態的植物和活有機體(例如，細菌、真菌和無脊椎動物如昆蟲和線蟲)中的非還原性二糖。已示出海藻糖對於多種生物材料(包括蛋白質和其它生物大分子，如酶、血清、抗體、抗原和疫苗組分)而言是有效的保護劑(Sanchez等，1999，Intl.J.Pharm.185,255-266；Esquisabel等，1997，J.Microencapsulation,14,627-638)。在一些情況下,有利的是包含兩種或更多種不同二糖(如海藻糖與蔗糖的混合物)以抑制結晶的形成，從而提高在貯存條件下，幹生物活性材料製劑在延長的時間中的穩定性以及降低成本。碳水化合物混合物中的寡糖級分包括菊粉、麥芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其組合物。寡糖緩和了與單獨使用海藻糖作為多種保存生物材料的保護劑相關的若干問題。海藻糖單獨作為穩定劑對於在脫水和復水過程中保護生物材料非常有效，但其不提供期望的長時間的貯存穩定性，尤其是在高溫下和/或溼環境中。在本發明中，通過向碳水化合物混合物中添加寡糖(優選為菊粉)解決了該問題。碳水化合物混合物中糖的優選的質量比為10:0.1-4:0.1-2的二糖/寡糖/多糖，更優選地，其中二糖/寡糖/多糖的重量比為約10:0.2:0.1至約10:2:1。優選地，碳水化合物混合物包含按總乾物質的重量計的百分數為10%至90%的二糖、1%至10%的寡糖和0.1%至10%的多糖。本發明的玻璃結構增強劑包括有機酸的鹽，所述有機酸如乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡萄糖酸、穀氨酸等。鹽可以包括陽離子如鈉、鉀、鈣、鎂、緩衝鹽、磷酸鹽等。實例包括檸檬酸鈉、乳酸鈉、馬來酸鈉、葡萄糖酸鎂、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、磷酸緩衝的鹽等。一般，多價陰離子比單價陰離子更易於以較高的Tg形成玻璃。優選的陰離子將具有高Tg以及足以已知結晶的可溶性，從而形成魯棒性玻璃狀結構。在一些情況下，有機鹽的混合物是可用的(例如，檸檬酸鈉和抗壞血酸鈉)。發現檸檬酸鈉與糖分子的羥基基團反應並且通過其羧基基團成鍵，這導致玻璃化蔗糖的玻璃化轉變溫度的急劇增加(Kets等，2004.CitrateincreasesglasstransitiontemperatureofvitrifiedsucrosepreparationsCryobiology,48:46-54)。朽1樣酸鈉是確認為GRAS(21CFR184.1751-檸檬酸鈉)的常見的食品添加劑。組合物中檸檬酸鈉的其它功能與其緩衝能力與相關，並且防止凍結過程中液體介質的PH急劇變化，該變化可以導致被冷凍乾燥的蛋白質變性。包含於組合物中以進一步增加其穩定性的其它合適的玻璃增強劑包括蛋白質、蛋白質水解產物、多肽和胺基酸。優選使用酪蛋白或豌豆，更優選水解的酪蛋白蛋白或水解的豌豆蛋白。「水解蛋白」是指已經歷部分或完全的酸水解或酶水解從而產生分子量為約IkDa至約50kDa的水解蛋白的蛋白質。優選地，蛋白質底物的至少20%被轉化為分子量為200道爾頓至2000道爾頓的肽。水解蛋白與全蛋白具有相同的胺基酸組成，並且可以從任意數目的商業來源得到。由於具有低變應原性，所以水解蛋白可以有利地用於高度敏感的消費者(如幼兒和老人)的某些食物中。用於該組合物中的玻璃增強劑的量將根據總體組成及其預期乾燥貯存條件而不同。一般，玻璃增強劑與總碳水化合物的摩爾比將為約0.01至約0.3。優選的組成構成摩爾為約0.1至0.2。優選的組合物包含約0.5%至約90%的碳水化合物組分(至少包括二糖、寡糖和多糖)和由約0.5%至約40%的水解蛋白構成的蛋白質組分。更優選地，組合物包含約30%至約70%的碳水化合物組分和約10%至約40%的玻璃增強劑組分如蛋白質水解的蛋白質和羧酸，其中，碳水化合物組分包含約10%至90%、更優選約40%至80%的二糖；約1%至約10%、更優選約5%至10%的寡糖；和約0.1%至約10%、更優選約5%至約10%的多糖。組合物還包含被認為是另一玻璃增強劑組分的有機酸鹽，並且包含基於組合物的總重量的約大於0.5%至20%的羧酸。本發明的含生物材料的溶液和穩定用組合物可以包含顯著量的總固體(減去溶劑(如水)的成分)，重量百分數為約20%至約60%，優選為約30%至50%。總固體的主要部分可以由生物活性材料、碳水化合物混合物和玻璃增強劑組成。例如，生物活性材料可以以約5%至30%w/v、優選為約10%至20%w/v存在於製劑中。培養基中組合物混合物的重量分數通常為約10%至約60%，優選為約20%至40%。本發明製劑的粘度通常大於1000釐泊(CP)，更優選大約5000cP;最優選大於10000CP。穩定幹製劑的製備方法多種乾燥技術可以有效地用於幹組合物。雖然與冷凍乾燥或真空乾燥相比複雜性較小並且成本較低，但是這些方法一般對生物材料的破壞性更大。與使用冷凍乾燥或凍幹時相比，使用在環境溫度或較高溫度下進行的方法保存方法相比，許多生物材料更傾向於總構象變化和非期望的反應。因此，即使使用目前已知的保護劑時，許多復水生物材料自身的活性都不能令人滿意，並且顯著地低於通過低溫乾燥而保存的。用於製備包含生物活性材料的穩定幹製劑的優選方法包括:(I)通過將生物活性材料與本發明的組合物在水性溶液中混合來製備粘性漿料製劑；(2)迅速冷凍漿料製劑以形成固體凍結顆粒；(3)任選地，使凍結顆粒在短時間內經歷高真空壓力以清潔顆粒並穩定其結構；(4)通過在高於製劑凍結溫度的溫度下蒸發水分來去除水；(5)在全真空和升高的溫度下，將製劑水活性進一步降低至低於0.3Aw。例如，可以將幹形式的生物活性材料配製成包含組合物粉末混合物的溶液或懸液。在冷卻以及與生物活性材料混合之前，可以將該組合物混合物溶解入溫熱的水性溶液中，同時低速攪拌(sheeragitation)。在重懸入製劑中之前,可以濃縮生物活性材料(如培養病毒或細菌)並通過離心或過濾將其與培養基分離。可替選地，製劑中水的總體提供於濃縮生物材料的液體中。將懸液保持在稍微高於室溫的溫度下，將幹組合物粉末混合物緩慢地加入含生物材料的溫熱(25°C至40°C)懸液中。在行星式混合器中輕輕攪拌懸液直至所有組分都完全地分散或者溶解，獲得均勻的漿料。可以通過添加金屬離子或者改變漿料的溫度或pH來交聯粘性溶液以形成水凝膠(取決於多糖特性)，然後根據本發明的乾燥方法進行乾燥。可替選地，可以通過經噴嘴霧化、滴下或注入乾冰或液氮浴來迅速凍結漿料，以形成小顆粒或固體滴線或珠。可以將凍結的固體顆粒在-30°C至_80°C下儲存於冷藏器中用於以後用作穩定的凍結產物或者直至乾燥。優選的乾燥方法是真空乾燥，其中，產物溫度保持在稍微高於其冷凍溫度。將凍結的滴或珠置於盤負荷容量為約0.1千克/平方英尺至約1.5千克/平方英尺的盤上，根據本發明的方法進行乾燥。優選地，乾燥工藝是通過短的清潔步驟開始的，該步驟使得產物適應(acclimation)起始溫度，並且使得凍結顆粒的結構鬆散且穩定，並且使過量的空氣脫氣。通常，清潔步驟需要I分鐘至60分鐘，這取決於產品粘度和盤的負荷。在整個清潔步驟中，珠或顆粒應當保持固體凍結形式。於是，產物溫度達到高於其凍結溫度，然後進行初級乾燥，直至所有游離水從產物中蒸發。一旦製劑溫度達到期望溫度，則調節熱以保持該溫度，並且通過蒸發進行初級液體乾燥步驟。在該步驟中，製劑被解凍，並且發生了加速的水蒸發，而沒有任何煮沸或起泡。在最大真空和升高的溫度下以附加的次級乾燥期完成乾燥過程。本領域中的普通方法涉及可以對敏感的生物材料造成破壞並且導致難於在高負荷容量下工業規模生產的廣泛起泡和/或濺射以及劇烈煮沸(參見例如，美國專利N0.6，534，087，其中所施加的真空壓力導致劇烈煮沸和起泡)。但是，現有組合物和方法避免了製劑的任何煮沸或起泡，同時獲得顯著更快的乾燥速度，並且使得製劑具有高負荷容量。此外，粘性液體漿料的完全且有效的脫氣是困難的並且可能需要延長的時間。通過使用使得形成玻璃狀結構而無需任何煮沸和過量泡沫的有效初級液體乾燥的合適的組合物，本發明解決了所有這些障礙。與漿料或粘性糖漿料相比，盤上固體冷凍顆粒的負荷比根據本領域所提供的盤上的單位乾燥面積的負荷容量高得多。在本發明的一個優選的實施例中，生物材料是活的濃縮的益生菌培養物。粉末組合物混合物優選地包含1%至4%的藻酸鈉或吉蘭糖膠、50%至75%的海藻糖、1%至10%的菊粉或FOS、IO%至20%的蛋白質水解產物，如酪蛋白、乳清、豌豆、大豆或棉籽的水解產物和1%至10%的檸檬酸鈉或抗壞血酸鈉。益生培養物可以是新鮮的、凍結的或已乾燥的乾粉形式。將組合物混合物添加到濃縮的益生培養物介質中以使溶液混合物的固體含量為40%至60%(w/w)，用磷酸離子或檸檬酸例子將pH調節至6.5至7.5。將溶液在稍微高於室溫的溫度(通常為25°C至37°C)下混合直至所有組分都完全溶解。將粘性漿料滴入液氮中以形成小滴或珠，然後從液氮中將小滴或珠去除，裝入袋中，並在_80°C下於冷藏器中貯存直至乾燥。活的益生菌的常用乾燥方法包括:將固體凍結珠以均勻層散布在負荷容量為100至1500克/平方英尺的盤上，並且立即將盤置於冷凍乾燥器中。然後施加約1000毫託或更低的真空壓力，該壓力取決於冷凍乾燥器的尺寸和熱源的類型，將擱板溫度調節至將顆粒保持在約-20°C至約_30°C。清潔固體凍結珠約I分鐘至約60分鐘，並將真空調節至2000毫託至10，000毫託，以及將熱傳輸增加至將製劑溫度提高到-10°C至+(TC。在初級液體乾燥步驟過程中保持這些溫度和真空壓力條件，所述步驟可持續幾小時至24小時，這取決於盤負荷。在初級乾燥過程中的某點，溶劑的蒸發速率變慢，製劑溫度開始增加，這是因為在乾燥室中過量供應的熱。該點表示本發明的初級乾燥步驟的結束。隨著溶劑從製劑中出來，溶液中的玻璃形成用化合物變得濃縮並且更厚直至其停止作為液體流動，並且形成無定形的和/或穩定的玻璃狀結構。然後，接著在最大真空下進行次級乾燥步驟，並且製劑溫度為30°C至50°C。次級乾燥步驟的目的是除去剩餘的截留水分或者結合水份，並且提供在環境溫度下在長時間內穩定貯存的組合物。次級乾燥步驟可持續數小時，並且其結束點為製劑完全乾燥並且其水活性低於0.3Aw時。本發明的乾燥方法引起生物活性材料被無定形的玻璃狀結構包住，從而防止蛋白質的摺疊或變性，並且顯著地減緩分子相互作用或交叉反應，這是由於無定形的玻璃狀組合物中的化合物和其它分子的大大降低的移動性。只要無定形固體結構保持在低於其玻璃化轉變溫度的溫度下，並且殘餘水分保持較低(即，Aw低於0.5)，則益生菌可以保持相對穩定。應當注意，玻璃狀結構並非長時穩定性的先決條件，因為一些生物材料可以在更為結晶的狀態下更好。乾燥的玻璃狀結構可以這樣使用:以整體；切為期望的形狀和大小，或者壓成或者碾磨為自由流動的粉末，其提供容易的下遊處理如溼凝集或幹凝集、粒化、壓片、壓實、制丸或者任意其它種類的遞送處理。壓、碾磨、粉碎或研磨成粉的方法在本領域中是公知的。例如，可以使用錘式磨機、空氣磨機、衝擊式磨機、噴磨機、Wiley磨機或類似的碾磨裝置。優選的顆粒大小為小於約1000μm,優選為小於500μm。本文所述的組合物和方法在高於環境溫度的溫度和相對溼度下長時間穩定生物材料並保存其活性。例如，通過使它們經歷升高的溫度(例如，40°C)和高溼度(例如，33%RH)來測試組合物，並測量製劑的生物活性。作為活益生菌的實例，這些研究的結果表明，配製於這些組合物中的細菌穩定至少60天。穩定性定義為示出llogCFU/g效力的時間。這樣的製劑即使在使用高濃度的生物活性材料時也是穩定的。因此，這些製劑的優點在於它們可以在室溫或高於室溫的溫度下長時間運輸和貯存。實施例提供了下述實施例以進行說明，但不限制所要求保護的發明。實施例1幹且穩定的組合物的製備基礎碳水化合物混合物將約70克的海藻糖(CargillMinneapolis,MN)、約5克的速溶菊粉(CargillMinneapolis,MN)和約3克的藻酸鈉(ISPCorp.,Wayne,NJ)以幹形式均勻混合。基礎玻璃增強劑混合物將約17克的酪蛋白水解產物或豌豆水解產物(ultrafiltratedhydrolysates,Marcor,Carlstadt,NJ)與5克的朽1檬酸鈉或抗壞血酸鈉(Sigma,St.Louis,MO)以幹形式均勻混合。益生菌的穩定將鼠李糖乳桿菌的新鮮濃縮物(100ml，10%的固體，直接來自發酵產物)添加到共混器中並保持在35°C。將約78克的基礎碳水化合物混合物和約22克的基礎玻璃增強劑混合物緩慢加入益生培養物中，並在35°C下實施混合10分鐘。然後，將粘性漿料轉移到具有多孔底的容器中，並且使其滴入包含液氮的浴中。然後從液氮中除去珠，並且立即調整至乾燥。包含益生菌的凍結珠的乾燥將凍結珠散布在負荷容量為200克/平方英尺的盤上，並且立即置於冷凍乾燥器(Model25SRC,Virtis,Gardiner,NY)中的擱架上。然後，將真空調節至2000毫託至2700毫託，將擱架溫度提高至+30°C。將這些溫度和真空壓力設置保持5小時。任選地，在通過施加約1000毫託的真空壓力和清潔固體凍結珠約10分鐘來起始初級液體乾燥之前，將凍結珠的溫度適應為約_20°C。然後，在初級乾燥步驟之後，將真空壓力調節至2000毫託至2700毫託，擱架溫度升高至+30°C。將這些溫度和真空壓力設置為保持5小時。接著，在全真空(150毫託至200毫託)下進行次級乾燥步驟，再將擱架溫度在30°C至50°C下保持3小時。完全乾燥製劑，並且通過HygropalmAwl儀((RotonicInstrumentCorp.,Huntington,NY.)在Aw=0.23下測量其水活性。實施例2幹益生菌的貯存穩定性圖1示出來自實施例1的幹穩定益生菌和市售幹益生菌(Culturelle,Amerifit,Inc.，Cromwell,CT)在40°C和33%RH與30°C和43%RH的兩種不同加速貯存條件下的貯存穩定性。在加速貯存條件下，市售益生菌在前幾周完全示出其活力，而本發明益生菌的幹組合物在30°C和43%RH下60天後僅示出了1.181ogs以及在30°C和43%RH下僅1.091ogso實施例3包含益生菌鼠李糖乳桿菌的穩定幹組合物的大規模生產。在37°C下，將鼠李糖乳桿菌(來自市售來源的400克凍結濃縮物)在有罩的雙行星混合器(DPM,lqt,RossEngineering,Inc.Savannah,GA)中解凍，用蒸懼水將固體含量調節為按重量計10%的固體。將約212克的海藻糖(CargillMinneapolis,MN)、約20克的速溶菊粉(CargillMinneapolis,MN)、約12克的藻酸鈉(ISPCorp.,Wayne,NJ)、約136克的酪蛋白水解產物(ultrafiltratedhydrolysates,Marcor,Carlstadt,NJ)和約20克的抗壞血酸鈉(Sigma,St.Louis,MO)以幹形式均勻混合。將粉末混合物緩慢地添加到益生培養物中，並在37°C下，以40RPM實施混合10分鐘。然後將漿料轉移到具有多孔底的容器中，並使其滴入含液氮的浴中。然後從液氮中除去珠，置於密封的鋁箔袋中，並在_80°C下於冷藏起中貯存數周。對於乾燥，將凍結珠均勻地散布在負荷容量為500克/平方英尺至1500克/平方英尺的盤上，並且將盤置於冷凍乾燥器(Model25SRC，Virtis,Gardiner,NY)的擱架上。通過將真空壓力調節至2000毫託至2700毫託來起始初級液體乾燥步驟，將產物溫度提高並穩定為-10°C至_5°C。隨時間推移(約10小時至16小時)，產物溫度增加至約20°C至25°C，在該點，次級乾燥步驟以最大真空(150毫託至200毫託)起始，並且將產物溫度在30°C至40°C下再保持14小時。將製劑完全乾燥，以0.23Aw測量水活性。實施例4包含益生菌乳雙歧桿菌的穩定幹組合物的大規模生產在37°C下，將乳雙歧桿菌(來自市售來源的400克凍結濃縮物)在有罩的雙行星混合器(DPM,lqt,RossEngineering,Inc.Savannah,GA)中解凍，將約212克的海藻糖(CargillMinneapolis,MN)、約20克的速溶菊粉(CargillMinneapolis,MN)、約12克的藻酸鈉(ISPCorp.,Wayne,NJ)和約20克的抗壞血酸鈉(Sigma,St.Louis,MO)以幹形式均勻混合。將粉末混合物緩慢地添加到益生培養物中。將約136克的豌豆水解產物(ultrafiltratedhydrolysates,Marcor,Carlstadt,NJ)溶解於80克蒸懼水中，將混合物短暫地經微波處理或者在水浴中溫熱至60°C，脂質完全分解，然後冷卻至約35°C。將幹混合粉末和包含豌豆蛋白水解產物的溶液添加到益生濃縮物中，並在37°C下以40RPM實施混合20分鐘。然後，將漿料轉移到具有多孔底的容器中，並使其滴入含液氮的浴中。然後從液氮中除去珠，置於密封的鋁箔袋中，並在_80°C下於冷藏起中貯存數周。對於乾燥，將凍結珠均勻地散布在負荷容量為500克/平方英尺至1500克/平方英尺的盤上，並且將盤置於冷凍乾燥器(Model25SRC，Virtis,Gardiner,NY)的擱架上。通過將真空壓力調節至2000毫託至2700毫託來起始初級液體乾燥步驟，將產物溫度提高並穩定為-10°C至_5°C。隨時間推移(約10小時至16小時)，產物溫度增加至約20°C至25°C，在該點，次級乾燥步驟以最大真空(150毫託至200毫託)起始，並且產物溫度在30°C至40°C再保持14小時。將製劑完全乾燥，以0.23Aw測量水活性。實施例5包含益生菌乳雙歧桿菌的水凝膠製劑的製備根據實施例1製備乳雙歧桿菌的濃縮的益生漿料。向基礎製劑中添加0.5克的二鹼式磷酸鈣，然後添加0.5克的葡萄糖酸內酯。在接下來的2個小時中，使漿料在室溫下硬化以形成固體水凝膠。使用市售的切片機/撕碎機將堅固的凝膠切為薄且長的線。薄線直接以溼形式加載於盤上或者在液氮中迅速凍結，並加載於負荷容量為500克/平方英尺的盤上，並置於冷凍乾燥器中用於如實施例3所述的乾燥。製劑的水活性(Aw)為0.05(由HygroPalmAwl,RotonicHuntington,NY測量)。使用標準的錘磨裝置進一步將幹製劑研磨為細粉末，並通過50微米至250微米篩過濾。實施例6玻璃增強劑與碳水化合物混合物的摩爾比的優化根據權利要求1製備了包含多種摩爾比例的玻璃增強劑與碳水化合物混合物的若干組合物。從市售來源獲得了益生菌副乾酪乳桿菌的濃縮培養物，並如實施例1所述製備於幹組合物中，除了將漿料以溼形式直接加載於盤上，而無需急冷步驟和清潔步驟。如實施例I和3所述將漿料在初級階段和次級階段中乾燥，除了在初級乾燥步驟和次級乾燥步驟中將擱架溫度升高至40°C以外。在37°C和33%RH下，使穩定粉末經歷加速貯存條件84天。圖2示出多種摩爾比對幹細菌的穩定性的作用。結果表明，玻璃增強劑與碳水化合物混合物的最佳摩爾比為約0.12至0.15。實施例7本發明的組合物對益生菌嗜酸乳桿菌的貯存穩定性的作用製備了如實施例1所述的包含碳水化合物混合物和玻璃增強劑混合物的組合物。從市售來源獲得了益生菌嗜酸乳桿菌的濃縮培養物，並如實施例1和3所述製備於幹組合物中，在37°C和33%RH下，使穩定粉末經歷加速貯存條件537天。圖3示出用本發明的組合物配置的益生菌的優越穩定性。結果表明，在特定條件下，擱架貯存經537天，益生菌的活力降低了僅0.181og。實施例8多種玻璃增強劑化合物對益生菌嗜酸乳桿菌的貯存穩定性的作用製備了包含如實施例1所述的碳水化合物混合物的和含有酪蛋白水解產物和檸檬酸鈉或抗壞血酸鈉或二者之組合的玻璃增強劑的若干組合物。益生菌嗜酸乳桿菌的濃縮培養物得自商業來源，並製備於如實施例1所述的幹組合物中，除了立即將漿料以溼形式加載於盤上以外，而無需急冷和清潔步驟。如實施例1和3所述在初級階段和次級階段乾燥漿料，使穩定的粉末經歷24°C和43RH%的加速貯存條件180天。圖4示出多種玻璃增強用化合物對乾燥細菌的作用。結果表明，在蛋白質水解產物的頂上包含額外的玻璃增強劑得到了更佳的穩定性。特別地，包含等量的乙酸鈉和抗壞血酸鈉提供了最穩定的組合物。來自實施例5和6二者的結果還表明，根據細菌菌株，多種玻璃增強劑可以更有效，或者甚至可以作為失穩劑。實施例9多種蛋白質水解產物/糖的比例對益生菌乳雙歧桿菌的貯存穩定性的作用製備了如實施例1所述的包含碳水化合物混合物和玻璃增強劑的若干組合物和等量但比例不同的豌豆水解產物/海藻糖的組合物(有或沒有抗壞血酸鈉)。益生菌乳雙歧桿菌的濃縮培養物得自商業來源並且製備於如實施例1和3所示的幹組合物中，使穩定粉末經歷35°C和43冊％的加速貯存條件7周。圖5示出比例為1:4、1:2.5和1:1.5的豌豆水解產物/海藻糖(有或沒有抗壞血酸鈉)對幹細菌的穩定性的影響。結果表明在增加比例的豌豆水解產物/海藻糖獲得了顯著更佳的穩定性。特別地，比例為1:1.5的豌豆水解產物/海藻糖提供了更穩定的組合物。與不含抗壞血酸鈉的製劑相比，包含更高的豌豆水解產物/海藻糖比例的抗壞血酸鈉導致優越的穩定性。實施例10益生菌鼠李糖乳桿菌的最大穩定性的pH優化製備了如實施例所述的包含碳水化合物混合物和玻璃增強劑之pH不同的若干組合物。益生菌鼠李糖乳桿菌的濃縮培養物得自商業來源並且製備於實施例1和3所述的幹組合物中。使穩定粉末經歷40°C和33冊％的加速貯存條件8周。圖6示出漿料對於幹細菌穩定性的PH作用。結果表明，在中性pH(7)得到了最佳穩定性。實施例11包含酶的穩定的乾粉通過將400克的碳水化合物和200克如實施例1和4所述的玻璃增強劑混合物和400克的phitase在IOOOml的水中混合物來製備包含40重量份的phitase(BASF，GmBH)的水凝膠配方。將粉碎的水凝膠製劑在液氮中迅速凍結，並在50°C的初級乾燥溫度和次級乾燥溫度下於真空烘箱中乾燥。對於確定乾燥配方的負荷和貯存穩定性:在微量離心管中對幹樣品進彳丁精確稱重(〈IOOmg)。添加200μI的_■甲亞諷。通過潤流將製劑溶解於DMSO緩衝劑中。向該樣品中添加0.8ml的包含0.05NNaOH,0.5%SDS和0.075M檸檬酸(三鈉鹽)的溶液。將管在45°C下超聲處理10分鐘。將等份的清潔DMSO/NaOH/SDS/檸檬酸溶液加入微板的孔中，並施用Bradford測定法分析蛋白質含量。在95°C下暴露20分鐘後,穩定的酶幹組合物的穩定性顯著高於不含本發明組合物的酶。`實施例12包含感染性鮭魚貧血病毒的穩定的乾粉末除將20ml4%的殼聚糖溶液在0.5%乙酸中添加到包含ISAV疫苗濃縮物、碳水化合物混合物和玻璃增強劑的漿料中以外，根據實施例4製備ISAV疫苗(Novozyme，Denmark)的濃縮漿料。添加0.5g的二鹼式磷酸鈣，然後添加0.5g的葡萄糖酸內酯。使漿料在接下來的2小時中在室溫下變硬以形成固體水凝膠。使用市售切片機/粉碎機將堅固的膠切為細線和長線。將細線直接以溼形式負荷在盤上，或者在液氮中迅速凍結，並負荷在負荷容量為1500克/平方英尺的盤上，置於冷凍乾燥器中並如實施例3所述進行乾燥。製劑的水活性(Aw)為0.25。使用標準的錘磨裝置將幹製劑進一步研磨為細粉末，並經50微米至150微米的篩進行過濾。穩定的幹ISAV組合物關於通過上層包被有幹組合物的商業飼料來進行經口免疫，並施予大西洋鮭魚。實施例13入侵物種誘餌的製備根據本發明的用於特定地靶向入侵物種的丸狀誘餌製備為包含殺蟲劑。製備200克的如實施例9所述的製劑，添加到200克的水中。向該溶液中添加90克的魚藤酮和0.5克的二鹼式磷酸鈣，然後添加0.5克的葡萄糖酸內酯。立即將漿料在標準工業噴霧乾燥器中乾燥，乾燥製劑用於靶向特定的入侵物種，而對環境或附近的生態系統沒有毒素的有害作用。實施例14受保護的植物益生菌製劑的製備根據實施例4將生物控制劑(如根際細菌(Rhizobacteria))製備於幹組合物中。在無菌條件下針對萵苣生長來評價幹根際細菌組合物的有效性。將IOOmg的根際細菌幹組合物/植物的劑量接種到具有沙的容器中，並種植預發芽(24小時)的萵苣種子。將營養劑5ml的無菌霍格蘭溶液施加至容器中的植物。容器在保持在28°C的生長室中隨機排布，光周期為12小時。在接種後每隔7天期間，小心地從容器中移出植物和粘沙。在無菌磷酸鹽緩衝劑(PH7.0)中洗滌根，記錄根長度的測量值。參考文獻下述文獻的內容就全部目的而言通過弓I用併入本文。美國專利和專利申請參考文獻:6，190，701Compositionandmethodforstableinjectableliquids，Marchl999,Roseretal.6，964，771Methodforstablyincorporatingsubstanceswithindry,foamedglassmatrices，Septemberl997，Roseretal.5，766，520Preservationbyformulationformation,Junel998,Bronshtein.6，534，087Processforpreparingapharmaceuticalcomposition,June2001，BussonandSchroeder.6，884，866Bulkdryingandtheeffectsofinducingbubblenucleation，April2005，Bronshtein.7，153，472Preservationandformulationofbioactivematerialsforstorageanddeliveryinhydrophobiccarriers，December，2006，Bronshtein.2008/0229609,PreservationbyVaporization.,June2005,Bronshtein.6，306，345Industrialscalebarriertechnologyforpreservationofsensitivebiologicalmaterialsatambienttemperatures，0ctober2001，Bronshteinetal.7，381，425，Preservationofbioactivematerialsbyfreezedriedfoam，September2006,Truong-le,Vu.其他參考文獻:Morgan,C.A.，Herman,N.，White,P.A.，Vesey,G.,2006,Preservationofmicro-organismsbydrying；areview.J.Microbiol.Methods.66(2):183-93.Capela，P.，Hay,T.K.C.，&Shah，N.P.,2006,Effectofcryoprotectants,prebioticsandmicroencapsulationonsurvivalofprobioticorganismsinyoghurtandfreeze-driedyoghurt.FoodResearchInternational，39(3)203-211).Annear，1962，ThePreservationofLeptospiresbyDryingFromtheLiquidState，J.Gen.Microbiol.，27:341-343.CroweiJ.F.，Carpenter，J.F.andCroweiL.M.,1998,THEROLEOFVITRIFICATIONINANHYDR0B10SIS.Annu.Rev.Physiol.60:73-103.Crowe,J.H.，Crowe.，LM.，andMouriadian,R.，1983，Cryobiology,20，346-356.M.LeMeste，etal.，2002，GlassTransitionandFoodTechnology:ACriticalAppraisal，JournalofFoodScience,67:2444-2458.Sanchezetal.，1999，Intl.J.Pharm.185，255-266.Esquisabeletal.,1997,J.Microencapsulation，14，627-638.Ketsetal.,2004.Citrateincreasesglasstransitiontemperatureofvitrifiedsucrosepreparations,Cryobiology,48:46-54.權利要求1.一種用於生物材料的幹的穩定用組合物，基於所述組合物的總重量，其包含佔約0.5%至90%的碳水化合物組分；和佔約0.5%至40%的水解的動物或植物蛋白質的蛋白質組分。2.根據權利要求1所述的幹的穩定用組合物，其中所述碳水化合物組分是選自寡糖、多糖和二糖中的至少一種糖，其中基於所述碳水化合物組分的總重量，所述寡糖為約5%至10%，二糖為40%至80%，所述多糖為5%至10%。3.根據權利要求1所述的幹的穩定用組合物，其中所述生物材料包括:活的、死的或減弱的細胞、微生物、病毒、細菌、益生菌、植物和土壤細菌、或酵母、細胞培養物、蛋白質、重組蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、藥物及其混合物。4.根據權利要求1所述的幹的穩定用組合物，其中所述水解的蛋白質組分包括:水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白質、水解的豌豆蛋白質、水解的大豆蛋白質及其混合物。5.根據權利要求1所述的幹的穩定用組合物，其中所述碳水化合物組分包括多糖、寡糖、二糖及其混合物。6.根據權利要求2所述的幹的穩定用組合物，其中所述多糖組分包括:鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、羧基-甲基-纖維素、膠質、藻酸鈉、藻酸的鹽、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素、角叉膠、吉蘭糖膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃原膠、槐豆膠、殼聚糖和殼聚糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、澱粉和改性澱粉及其混合物。7.根據權利要求2所述的幹的穩定用組合物，其中所述寡糖組分是環糊精、菊粉、麥芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其混合物。8.根據權利要求5所述的幹的穩定用組合物，其中所述二糖組分是海藻糖、蔗糖、乳糖及其混合物。9.一種用於生物材料的幹的穩定用組合物，基於所述組合物的總重量，其包含佔約0.5%至90%的碳水化合物組分；佔約0.5%至40%的水解的動物或植物蛋白質的蛋白質組分；和佔約0.5%至20%的羧酸的羧酸組分。10.根據權利要求9所述的幹的穩定用組合物，其中所述羧酸組分包括:乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡萄糖酸、穀氨酸及其鹽或其混合物。11.根據權利要求9所述的幹的穩定用組合物，其中所述碳水化合物組分包含佔約5%至10%的寡糖、佔40%至80%的二糖、和佔5%至10%的多糖。12.根據權利要求9所述的幹的穩定用組合物，其中所述生物材料包括:活的、死的或減弱的細胞、微生物、病毒、細菌、益生菌、植物和土壤細菌，或酵母、細胞培養物、蛋白質、重組蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、藥物及其混合物。13.根據權利要求9所述的幹的穩定用組合物，其中所述水解的蛋白質組分包括:水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白質、水解的豌豆蛋白質、水解的大豆蛋白質及其混合物。14.根據權利要求9所述的幹的穩定用組合物，其中所述碳水化合物組分包括多糖、寡糖、二糖及其混合物。15.根據權利要求11所述的幹的穩定用組合物，其中所述多糖組分包括:鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、羧基-甲基-纖維素、膠質、藻酸鈉、藻酸的鹽、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素、角叉膠、吉蘭糖膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃原膠、槐豆膠、殼聚糖和殼聚糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、澱粉和改性澱粉及其混合物。16.根據權利要求11所述的幹的穩定用組合物，其中所述寡糖組分是環糊精、菊粉、麥芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其混合物。17.根據權利要求14所述的幹的穩定用組合物，其中所述二糖組分是海藻糖、蔗糖、乳糖及其混合物。18.根據權利要求1或9所述的用於生物材料的幹的穩定用組合物，其中所述組合物被乾燥為無定形玻璃態。19.根據權利要求2或11所述的幹的穩定用組合物，其中二糖/寡糖/多糖的重量比為約10:0.2:0.1至約10:2:1。20.一種乾燥方法，其中所述乾燥是選自以下的一種或更多種工藝:冷凍乾燥、空氣乾燥、真空乾燥、流化床乾燥和噴霧乾燥。21.一種用於生物材料的幹的穩定用組合物的製備方法，其包括:(a)將生物材料與權利要求I或9中所述的化合物的混合物在水性溶劑中組合以形成粘性漿料；(b)將所述漿料在液氮中迅速冷凍以形成固體凍結顆粒、珠、滴或線；(c)在高於其冷凍溫度的配製溫度下，通過在真空下蒸發來進行製劑的初級液體乾燥步驟；(d)在最大真空和20°C或更高的溫度下進行所述製劑的次級乾燥，進行次級乾燥的時間足以降低所述製劑的水活性。22.根據權利要求21所述的製備方法，其還包括在起始所述初級乾燥步驟之前，所述固體凍結顆粒的適應步驟。23.根據權利要求21所述的製備方法，其中所述幹的穩定用組合物被乾燥為無定形玻璃態。24.根據權利要求21所述的製備方法，其中在迅速冷凍之前，通過pH或溫度變化或者通過聚合物鏈的交聯將所述漿料固化為堅固的水凝膠。25.根據權利要求24所述的製備方法，其中將所述漿料模製為期望形狀。26.根據權利要求22所述的製備方法，其中在真空和低於所述製劑凝固點的溫度下實施所述適應步驟。27.根據權利要求22所述的製備方法，其中所述適應步驟實施O分鐘至60分鐘。28.根據權利要求21所述的製備方法，其中在高於>2000毫託的真空壓力下實施所述初級液體乾燥步驟。29.根據權利要求21所述的製備方法，其中將所述幹的穩定用組合物切、壓、碾磨或者分別粉碎為自由流動的粉末。30.根據權利要求29所述的製備方法，其中所述粉末的粒徑小於約1000μm。31.根據權利要求21所述的製備方法，其中所述幹的穩定用組合物的水活性(Aw)為Aw<0.3或更低。32.—種經口遞送製劑，其包含根據權利要求1或9所述的幹的穩定用組合物，其中，所述製劑為以下形式:重構的液體、研磨的粉末、片劑、丸劑、膠囊、食品或飼料產品。33.一種經口遞送製劑，其包含根據權利要求1或9所述的組合物，其中所述生物材料在所述製劑的貯存期限過程中是穩定的。34.一種經口遞送製劑，其包含根據權利要求1或9所述的幹的穩定用組合物，其中所述製劑作為食品、動物飼料、營養品、藥品或疫苗產品而被消耗。35.根據權利要求1或9所述的用於生物材料的幹的穩定用組合物，其中所述組合物作為以下形式的食品、食品添加劑、動物飼料、動物飼料添加劑、營養品、藥品或疫苗產品而被消耗:杆、液體配方、膠狀懸液、粉末、片劑、膠囊。全文摘要本發明包括用於在貯存中保存敏感性生物活性材料的組合物和乾燥方法，所述敏感性生物活性材料如肽、蛋白質、激素、核酸、抗體、藥物疫苗、酵母、細菌(益生菌或其它)、病毒和/或細胞懸液。所述組合物包括碳水化合物組分和玻璃增強劑組分，其中所述碳水化合物組分包括二糖、寡糖和多糖的混合物，所述玻璃增強劑包括有機酸的離子和蛋白質水解產物。所述組合物是通過將所有固體組分分散於溶液中，然後迅速凍結以形成小珠、線或滴而製備的。所述凍結的珠、線或滴的優選乾燥方法是通過以下進行首先是短暫清潔和在小於＜2000毫託的真空壓力下的凍結顆粒的結構穩定化步驟，接著在大於＞2000毫託的真空壓力和期望溫度下的初級乾燥步驟。在材料的次級乾燥步驟和最終乾燥步驟過程中，施加了全真空壓力和升高的溫度以獲得乾材料的最終期望的水活性。文檔編號C12N7/01GK103140145SQ201180039219公開日2013年6月5日申請日期2011年8月12日優先權日2010年8月13日發明者莫蒂·哈雷爾,唐瓊申請人:高級生物營養公司