提升糖代謝能力的組合物及其應用的製作方法

2023-06-15 20:04:28

1.本技術涉及藥物、食品或保健品技術領域，特別是涉及一種提升糖代謝能力的組合物及其應用。


背景技術：

2.隨著經濟的高速發展，居民的飲食結構也隨之發生改變，人們根據喜好日常攝入更多的含糖飲料、精製碳水。大部分碳水化合物在口腔及腸腔中經消化酶水解為葡萄糖，分解後的葡萄糖通過腸黏膜上皮細胞進入小腸壁的毛細血管，並匯合於門靜脈而進入肝臟，最後進入大循環，作為主要能源物質被運送到身體各個器官。而當碳水化合物攝入過剩時，會呈現高血糖狀態，長期的高血糖會誘發肥胖、心血管疾病、糖尿病等疾病，嚴重危害人類健康。同時，研究表明肥胖、動脈粥樣硬化以及糖尿病還會進一步導致糖代謝障礙，再度上調血糖水平，形成惡性循環。肥胖和糖尿病發病率呈逐年上升趨勢，肥胖、糖尿病的發生又引發各種心腦血管疾病、慢性腎臟病和視網膜病變等，嚴重降低生活質量。因此，加速糖代謝，控制血糖升高，改善肥胖以及糖代謝障礙人群的健康是亟待解決的問題。
3.傳統的用於平穩血糖、緩解糖代謝壓力的方法或機理可以舉例如：
4.(1)通過抑制α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶以抑制外源性碳水向葡萄糖進行轉換來控制血糖，但消化酶的抑制率根據個體差異很難把握，因此相應的產品若阻斷率過高會造成低血糖，若阻斷率過低仍然會造成糖代謝障礙人群血糖過高；
5.(2)通過注射胰島素來激活糖代謝通路，但這作為臨床治療手段並不適用於糖尿病前期，或肥胖人群，長時間注射胰島素更容易造成內源性胰島素分泌障礙以及敏感性降低，導致胰島素抵抗。
6.骨骼肌是人體最大的糖代謝器官，七成以上的糖代謝在骨骼肌中進行，因此促進骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用是提升糖代謝的最有效的手段之一。骨骼肌糖代謝分為葡萄糖轉運、糖原合成和糖原分解三個步驟進行，其中葡萄糖轉運是骨骼肌利用葡萄糖的首要步驟。葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，glut4)是骨骼肌中最重要的葡萄糖轉運載體之一，承擔轉運機體50％～80％的葡萄糖。人體攝入糖分後刺激胰島素分泌，胰島素刺激細胞分泌glut4和易位到細胞膜上。在基礎代謝狀態下，定位細胞膜上的glut4僅有5％左右，血糖升高以及胰島素分泌可使50％的glut4從細胞核周圍易位到細胞膜表面，攝取利用葡萄糖穩定血糖水平。因此，促進glut4從細胞內易位到細胞膜是提升骨骼肌糖代謝能力的關鍵步驟。
7.有兩種主要機制參與促進glut4的易位和活化，包括通過胰島素受體底物(irs)/磷脂醯肌醇-3-激酶(pi3k)/蛋白激酶b(akt)途徑和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mapk)途徑。因此胰島素是調控骨骼肌細胞glut4易位的重要信號分子。在骨骼肌中胰島素信號的傳導主要由胰島素受體底物-1(irs-1)/pi3k/akt途徑介導。該途徑的激活導致細胞內glut4易位至表面膜，從而增加葡萄糖攝取。另外，胰島素可介導p38/mapk信號通路增強glut4的內在活性，參與glut4的激活，導致胰島素刺激葡萄糖攝取。通過調控胰島素相關的
兩條通路，促進glut4向細胞膜易位，提高機體糖代謝能力是改善肥胖和代謝障礙的有效手段，但是有部分肥胖或糖尿病患者存在胰島素水平低下或胰島素受體不敏感等問題，僅依賴於胰島素相關的通路可能對該類人群改善糖代謝的幫助有限。因此，尋找一種不依賴於胰島素的促進糖代謝的方法是改善胰島素水平低下或胰島素受體不敏感人群糖代謝能力的解決方案之一。同時，目前以促進胰島素分泌為目的方案對ⅱ型糖尿病患者等胰島素不敏感人群的糖代謝能力的提高也十分有限。


技術實現要素：

8.基於此，本技術提供一種無需依賴於胰島素，且能夠有效提升機體的糖代謝能力的組合物及其應用。
9.本技術的第一方面，提供一種提升糖代謝能力的組合物，以重量份計，包括如下組分：
10.白芸豆的提取物30份～50份、綠茶的提取物30份～50份，以及梔子的提取物40份～80份；
11.所述重量份按照各組分的乾重計。
12.在其中一個實施例中，所述的提升糖代謝能力的組合物，以重量份計，包括如下組分：
13.白芸豆的提取物35份～45份、綠茶的提取物35份～45份，以及梔子的提取物55份～65份；
14.所述重量份按照各組分的乾重計。
15.在其中一個實施例中，所述組合物具有如下特徵中的一項或多項：
16.(1)所述白芸豆的提取物為白芸豆的水提取物；
17.(2)所述綠茶的提取物為綠茶的水提取物和綠茶的醇提取物中的一種或兩種；
18.(3)所述梔子的提取物為梔子的水提取物和梔子的醇提取物中的一種或兩種。
19.在其中一個實施例中，所述白芸豆的提取物中蛋白質的質量百分比≥75％。
20.在其中一個實施例中，所述綠茶的提取物中茶多酚的質量百分比為20％～60％。
21.在其中一個實施例中，所述梔子的提取物中梔子苷的質量百分比為1％～10％。
22.本技術的第二方面，提供第一方面所述的提升糖代謝能力的組合物在製備具有提升糖代謝能力的藥物、食品或保健品中的應用。
23.在其中一個實施例中，所述糖代謝為骨骼肌的糖代謝。
24.本技術的第三方面，提供第一方面所述的提升糖代謝能力的組合物在製備具有預防或治療肥胖、糖代謝障礙、心血管疾病、糖尿病或輔助降血糖的藥物、食品或保健品中的應用。
25.本技術的第四方面，提供一種藥物、食品或保健品，包括第一方面所述的提升糖代謝能力的組合物，以及輔料。
26.上述提升糖代謝能力的組合物，通過白芸豆的提取物、綠茶的提取物以及梔子的提取物的協同配伍，能夠以不依賴胰島素的方式激活骨骼肌細胞的葡萄糖轉運蛋白向細胞膜上易位，從而激活骨骼肌細胞糖代謝通路，提升骨骼肌糖代謝能力，進一步改善肥胖和糖代謝障礙。同時，該提升糖代謝能力的組合物還可以增加胰島素的敏感性，協同胰島素增強
骨骼肌的糖代謝能力。
附圖說明
27.圖1為不同處理組細胞的葡萄糖攝取量統計圖；
28.圖2為不同處理組細胞膜蛋白中glut4、β-actin免疫印跡圖以及相應的定量結果；
29.圖3為不同處理組細胞中p-akt、akt免疫印跡圖以及相應的定量結果。
具體實施方式
30.以下結合具體實施例對本技術的提升糖代謝能力的組合物及其應用作進一步詳細的說明。本技術可以以許多不同的形式來實現，並不限於本文所描述的實施方式。相反地，提供這些實施方式的目的是使對本技術公開內容理解更加透徹全面。
31.除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬於本技術的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本技術的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在於限制本技術。
32.本文所使用的術語「和/或」的可選範圍包括兩個或兩個以上相關所列項目中任一個項目，也包括相關所列項目的任意的和所有的組合，所述任意的和所有的組合包括任意的兩個相關所列項目、任意的更多個相關所列項目、或者全部相關所列項目的組合。
33.本文中，「一種或多種」指所列項目的任一種、任兩種或任兩種以上。
34.本技術中，「第一方面」、「第二方面」、「第三方面」、「第四方面」等僅用於描述目的，不能理解為指示或暗示相對重要性或數量，也不能理解為隱含指明所指示的技術特徵的重要性或數量。而且「第一」、「第二」、「第三」、「第四」等僅起到非窮舉式的列舉描述目的，應當理解並不構成對數量的封閉式限定。
35.本技術中，以開放式描述的技術特徵中，包括所列舉特徵組成的封閉式技術方案，也包括包含所列舉特徵的開放式技術方案。
36.本技術中，涉及到數值區間，如無特別說明，上述數值區間內視為連續，且包括該範圍的最小值及最大值，以及這種最小值與最大值之間的每一個值。進一步地，當範圍是指整數時，包括該範圍的最小值與最大值之間的每一個整數。此外，當提供多個範圍描述特徵或特性時，可以合併該範圍。換言之，除非另有指明，否則本文中所公開之所有範圍應理解為包括其中所歸入的任何及所有的子範圍。
37.本技術中涉及的百分比含量，如無特別說明，對於固液混合和固相-固相混合均指質量百分比，對於液相-液相混合指體積百分比。
38.本技術中涉及的百分比濃度，如無特別說明，均指終濃度。所述終濃度，指添加成分在添加該成分後的體系中的佔比。
39.本技術中的溫度參數，如無特別限定，既允許為恆溫處理，也允許在一定溫度區間內進行處理。所述的恆溫處理允許溫度在儀器控制的精度範圍內進行波動。
40.本技術中的室溫一般指4℃～30℃，較佳地指20
±
5℃。
41.目前，尚未見不依賴於胰島素的提升糖代謝能力的食源性天然產物組合物，也未見以激活骨骼肌glut4易位的從而提升糖代謝的食源性天然產物組合物。
42.傳統的降低餐後血糖的藥品或食品有以抑制α-澱粉、α-葡萄糖苷酶活性為主的產
品，例如白芸豆提取物作為澱粉酶抑制劑在阻斷碳水吸收的功能食品中被應用，但白芸豆提取物無法減少人體對葡萄糖、蔗糖等小分子糖類的吸收，且白芸豆的功效成分為α-澱粉酶抑制蛋白，在酸性的胃液環境中不穩定，因此，單獨的白芸豆降低餐後血糖的效果不穩定。
43.本技術的一示例提供一種提升糖代謝能力的組合物，以重量份計，包括如下組分：白芸豆的提取物30份～50份、綠茶的提取物30份～50份，以及梔子的提取物40份～80份；所述重量份按照各組分的乾重計。
44.上述提升糖代謝能力的組合物將白芸豆的提取物、綠茶的提取物和梔子的提取物進行復配形成組合物。首先，本組合物不僅可以一定程度抑制葡萄糖進入血液循環系統，更為重要的是，可以激活pi3k/akt信號通路，從而促進骨骼肌細胞內的葡萄糖轉運蛋白向細胞膜轉移，使骨骼肌吸收更多葡萄糖，提升骨骼肌糖代謝能力；其次，本組合物不僅可以在胰島素存在的情況下，增加胰島素的敏感性，協同促進骨骼肌糖代謝，還可以在沒有胰島素存在的條件下，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取利用；再次，本組合物的穩定性較單獨白芸豆的蛋白質成分更好，因此控制血糖的能力也更穩定。
45.此外，本組合物能安全、有效、作用穩定、作用機制明確，同時，由於骨骼肌是人體最大的代謝葡萄糖的器官，本組合物以骨骼肌為靶器官，用骨骼肌消耗血液中的葡萄糖，能夠進一步安全有效地提升骨骼肌糖代謝能力，平穩控制血糖濃度，有效改善人體的糖代謝水平，例如協助處於糖尿病前期人群維持好的糖代謝機能。
46.具體地，所述白芸豆的提取物的重量份包括但不限於：30份、33份、35份、37份、38份、39份、40份、41份、42份、43份、45份、47份、50份。
47.具體地，所述綠茶的提取物的重量份包括但不限於：30份、33份、35份、37份、38份、39份、40份、41份、42份、43份、45份、47份、50份。
48.具體地，所述梔子的提取物的重量份包括但不限於：40份、42份、45份、50份、55份、58份、60份、62份、65份、70份、75份、78份、80份。
49.在其中一個示例中，所述白芸豆的提取物為白芸豆的水提取物。
50.在其中一個示例中，所述白芸豆的提取物中蛋白質的質量百分比≥75％。進一步地，所述白芸豆的提取物中蛋白質的質量百分比為75％～99％。具體地，所述白芸豆的提取物中蛋白質的質量百分比包括但不限於：75％、78％、80％、80.6％、82％、85％、90％、95％、99％。不作限制地，所述白芸豆的提取物可以通過購買獲得，也可以通過傳統提取方法獲得，例如包括如下步驟：粉碎白芸豆，加水提取，收集提取液進行乾燥，製備所述白芸豆的提取物。更為具體地，白芸豆和水的重量比可為1:(9～16)，提取溫度可為25℃～45℃，提取時間可為2～4小時。
51.在其中一個示例中，所述綠茶的提取物為綠茶的水提取物和綠茶的醇提取物中的一種或兩種。進一步可選地，所述醇為乙醇。
52.在其中一個示例中，所述綠茶的提取物中茶多酚的質量百分比為20％～60％。具體地，所述綠茶的提取物中茶多酚的質量百分比包括但不限於：20％、25％、30％、35％、38％、40％、42％、45％、50％、55％、60％。不作限制地，所述綠茶的提取物可以通過購買獲得，也可以通過傳統提取方法獲得，例如包括如下步驟：綠茶加水或醇提取，收集提取液進行濃縮和乾燥，製備所述綠茶的提取物。更為具體地，綠茶和水的重量比可為(6～12):1，提
取溫度可為50℃～100℃，提取時間可為1～2小時，提取溶劑可為體積分數為0～100％的乙醇水溶液，進一步地，乙醇水溶液的體積分數為45～55％。
53.在其中一個示例中，所述梔子的提取物為梔子的水提取物和梔子的醇提取物中的一種或兩種。進一步可選地，所述醇為乙醇。
54.在其中一個示例中，所述梔子的提取物中梔子苷的質量百分比為1％～10％。具體地，所述梔子的提取物中梔子苷的質量百分比包括但不限於：1％、2％、3％、3.5％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。不作限制地，所述梔子的提取物可以通過購買獲得，也可以通過傳統提取方法獲得，例如包括如下步驟：梔子加水或醇提取，收集提取液進行濃縮和乾燥，製備所述梔子的提取物。更為具體地，梔子和水的重量比可為(4～10):1，提取溫度可為60℃～100℃，提取時間可為2～3小時，提取溶劑可為體積分數為0～100％的乙醇水溶液，進一步地，乙醇水溶液的體積分數為45～55％。
55.在其中一個示例中，所述提升糖代謝能力的組合物，以重量份計，包括如下組分：
56.白芸豆的提取物35份～45份、綠茶的提取物35份～45份，以及梔子的提取物55份～65份；所述重量份按照各組分的乾重計。
57.本技術的又一示例提供如上所述的提升糖代謝能力的組合物在製備具有提升糖代謝能力的藥物、食品或保健品中的應用。進一步地，所述糖代謝為骨骼肌的糖代謝。
58.本技術的又一示例提供如上所述的提升糖代謝能力的組合物在製備具有預防或治療肥胖、糖代謝障礙、心血管疾病、糖尿病或輔助降血糖的藥物、食品或保健品中的應用。
59.本技術的又一示例提供一種藥物、食品或保健品，包括如上所述的提升糖代謝能力的組合物，以及輔料。
60.以下為實施例，如無特別說明，實施例中採用的原料均為市售產品。
61.實施例和對比例中採用的白芸豆的提取物中蛋白質的質量百分比為80.6％。該白芸豆的提取物可以通過購買獲得。不作限制地，該白芸豆的提取物的提取工藝為：白芸豆經粉碎，加水提取，收集提取液進行乾燥，製得所述白芸豆的提取物。白芸豆和水的重量比為1:12，提取溫度控制在35℃，保溫3小時。
62.綠茶的提取物中茶多酚的質量百分比為40％。該綠茶的提取物可以通過購買獲得。不作限制地，該綠茶的提取物的提取工藝為：綠茶加體積分數為50％的乙醇水溶液提取，收集提取液進行濃縮和乾燥，製得所述綠茶的提取物。綠茶和乙醇水溶液的重量比為10:1，提取溫度控制在80℃，提取1.5小時。
63.梔子的提取物中梔子苷的質量百分比為3.5％。該梔子的提取物可以通過購買獲得。不作限制地，該梔子的提取物的提取工藝為：梔子加體積分數為50％的乙醇水溶液提取，收集提取液進行濃縮和乾燥，製得所述梔子提取物。梔子和乙醇水溶液的重量比為8:1，提取溫度控制在85℃，提取2.5小時。
64.實施例和對比例：
65.實施例和對比例提供提升骨骼肌糖代謝能力的組合物，其配伍如下表1所示：
66.表1
[0067][0068]
上述組合物的製備方法為將各組分按配伍重量份混合均勻即可。
[0069]
測試例：
[0070]
(1)組合物對骨骼肌細胞葡萄糖利用度的影響
[0071]
1、c2c12細胞培養和分化
[0072]
將c2c12小鼠成肌細胞接種於培養板，待細胞長滿至80％～90％，用含2％馬血清的高糖dmem培養液誘導分化3～4天。
[0073]
2、加樣處理
[0074]
待c2c12細胞分化出肌管後，用含25mm葡萄糖培養基模擬高糖情況下的細胞環境，將細胞進行分組加樣處理：
[0075]
空白組：加入1ml新鮮空白培養基，未加入任何樣品；
[0076]
胰島素組：在收樣前30分鐘加入10μg/ml胰島素，以培養基體積計；
[0077]
實施例1+胰島素組：加入200μg/ml實施例1組合物，收樣前30分鐘加入10μg/ml胰島素，以培養基體積計；
[0078]
實施例2組：加入200μg/ml實施例2組合物，以培養基體積計；
[0079]
實施例3組：加入200μg/ml實施例3組合物，以培養基體積計；
[0080]
對比例1組：加入200μg/ml對比例1組合物，以培養基體積計；
[0081]
對比例2組：加入200μg/ml對比例2組合物，以培養基體積計；
[0082]
對比例3組：加入200μg/ml對比例3組合物，以培養基體積計。
[0083]
其中，胰島素組處理時間為30分鐘，其餘組處理時間為2小時。
[0084]
3、葡萄糖利用度檢測
[0085]
按上述分組加樣處理完成後，吸取各組的培養基，1000rpm離心5分鐘，取上清液，然後利用god-pod法試劑盒檢測培養基上清液中的葡萄糖含量，葡萄糖攝取量＝空白培養基葡萄糖濃度-細胞接種孔葡萄糖含量均值，測試結果如圖1和表2所示。
[0086]
表2
[0087][0088][0089]
由圖1和表2可知，在相同的作用時間下，相比空白組，胰島素、實施例1、實施例1+胰島素、實施例2、實施例3處理孔中葡萄糖攝取量顯著增多，存在顯著性差異(p＜0.05)，對比例1、對比例2和對比例3雖一定程度增加了細胞對葡萄糖的攝取，但無顯著性差異(p＞0.05)。其中尤其以實施例1+胰島素組的葡萄糖攝取量最多，說明組合物可能增強了胰島素的敏感性，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取利用。另外，在不添加胰島素的情況下，單獨的組合物也可以一定程度增加骨骼肌細胞的葡萄糖攝取量，說明組合物可以一種不依賴於胰島素的方式促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取利用。
[0090]
(2)組合物對骨骼肌細胞的glut4蛋白分布的影響
[0091]
1、c2c12細胞培養和分化，同(1)項。
[0092]
2、加樣處理，同(1)項。
[0093]
3、膜蛋白的分離提取以及glut4蛋白水平檢測
[0094]
利用膜蛋白提取試劑盒(c500049-0050)分離、提取經上述處理後的c2c12細胞中的膜蛋白。具體步驟如下：
[0095]
1)收集不少於1
×
107個細胞，預冷的雙蒸水洗滌3次後加入1ml提取buffer，超聲破碎30秒，4次，每次間隔1分鐘；
[0096]
2)冰上裂解10分鐘，然後4℃、14000rpm離心10分鐘，吸取上清，棄去沉澱；
[0097]
3)上清置於37℃水浴10分鐘，然後室溫、14000rpm離心15分鐘，樣品分成上層和下層(含膜蛋白)；
[0098]
4)取下層，加入500μl冰冷滅菌水，4℃放置5分鐘，再置於37℃水浴10min，室溫、14000rpm離心5分鐘，得到的下層即為膜蛋白提取物，冷凍保存。
[0099]
4、製備膜蛋白樣品後，加入適當體積的1
×
loading buffer溶解膜蛋白，煮沸5分鐘後，利用蛋白免疫印跡法檢測glut4的表達情況。具體步驟如下：
[0100]
1)電泳：製備sds-聚丙烯醯胺凝膠，將上述方法製得的蛋白樣品加到凝膠的上樣孔中，安裝好電泳儀，插好電線和電源，90v的電壓下恆壓進行電泳，待目的條帶跑到合適的位置時，停止電泳；
[0101]
2)轉膜：將凝膠取下，轉移到轉膜夾中，插到轉膜裝置中置於轉膜槽中，倒入冷的1
×
電轉緩衝液，插上冰磚，插好電線和電源，90v的電壓下恆壓轉膜1小時；
[0102]
3)封閉：轉膜完成後將膜取出，置於5％的脫脂牛奶中，置於搖床上室溫封閉1小
時；
[0103]
4)孵育一抗：將目的條帶裁剪下來，一抗原液glut4(購自abclone，glut4rabbit pab，a7637)按1：1000比例稀釋在含1％脫脂牛奶的tbst溶液中，β-actin(購自abclone，β-actin mouse mab，ac004)按1：10000比例稀釋在含1％脫脂牛奶的tbst溶液中，將條帶放在合適大小的抗體孵育槽中，加入相應抗體稀釋液，置於4℃冰箱中的搖床中孵育過夜；次日回收一抗，用1
×
tbst在轉速較快的搖床上洗膜，10分鐘換一次液，一共洗3次；
[0104]
5)孵育二抗：按1：10000的比例稀釋二抗原液，將二抗稀釋液加到膜上，置於慢速搖床上，室溫孵育1小時，然後棄去二抗，用1
×
tbst在轉速較快的搖床上洗膜，10分鐘換一次液，一共洗4次；
[0105]
6)顯影：將ecl的a液和b液按照1：1的比例混勻，均勻滴加到膜上，然後將膜轉移到顯影夾中的乾淨玻璃紙上，立即到暗房中顯影，獲得結果條帶；
[0106]
7)用image j圖像處理軟體統計glut4和β-actin灰度，計算glut4和β-actin的比值，測試結果如圖2所示。
[0107]
由圖2可知，相比空白組，胰島素、實施例1和實施例1+胰島素組的glut4在膜蛋白中的表達量更高，說明單獨的胰島素、單獨的組合物以及胰島素和組合物的聯用均可增加glut4在骨骼肌細胞膜上的表達。其中，胰島素和組合物的聯用的效果最好，說明組合物可能增強了胰島素的敏感性，促進glut4從細胞內轉位到細胞膜上。另外，在不添加胰島素的情況下，單獨的組合物也可以一定程度增加glut4在骨骼肌細胞膜上的表達量，說明組合物可以一種不依賴於胰島素的方式促進glut4的膜轉位，提升骨骼肌的糖代謝能力。
[0108]
(3)組合物對骨骼肌細胞的akt信號通路的影響
[0109]
1、c2c12細胞培養和分化，同(1)項
[0110]
2、加樣處理，同(1)項
[0111]
3、細胞蛋白樣品製備
[0112]
1)收集上述加樣處理完畢的細胞，棄去培養基，預冷的pbs清洗一遍後棄去pbs，每孔加入90μl預冷的np-40細胞裂解液，放置於冰上靜置裂解10分鐘；
[0113]
2)用細胞刮將上述裂解後的細胞刮下，裂解液轉移至離心管中，將離心管放在漩渦振蕩儀上振蕩5秒，然後插到冰上靜置5分鐘，重複該步驟3次，使細胞裂解完全，然後將離心管置於提前預冷至4℃的低溫離心機中，12000g離心10分鐘，吸取2μl上清液用於測量蛋白濃度；
[0114]
3)bca法測定蛋白濃度，根據蛋白濃度測定結果，計算蛋白裂解液的吸取量，用np-40裂解液補齊各個樣品的體積，加入相應量的5
×
上樣緩衝液使之為1
×
工作濃度，漩渦振蕩儀上振蕩5秒混勻後，置於蛋白樣品加熱器煮樣5分鐘，常溫離心機中10000g離心1分鐘，將製備好的蛋白樣品用於後續跑膠或者放置於-20℃冰箱中保存。
[0115]
4、免疫印跡法檢測蛋白表達
[0116]
1)電泳：製備sds-聚丙烯醯胺凝膠，將上述方法製得的蛋白樣品加到凝膠的上樣孔中，安裝好電泳儀，插好電線和電源，90v的電壓下恆壓進行電泳，待目的條帶跑到合適的位置時，停止電泳；
[0117]
2)轉膜：將凝膠取下，轉移到轉膜夾中，插到轉膜裝置中置於轉膜槽中，倒入冷的1
×
電轉緩衝液，插上冰磚，插好電線和電源，90v的電壓下恆壓轉膜1小時；
[0118]
3)封閉：轉膜完成後將膜取出，置於5％的脫脂牛奶中，置於搖床上室溫封閉1小時；
[0119]
4)孵育一抗：將目的條帶裁剪下來，一抗原液p-akt(購自cst，phospho-akt(ser473)(d9e)rabbit mab#4060)和akt(購自cst，akt(pan)(c67e7)rabbit mab#4691)均按1：1000比例稀釋在含1％脫脂牛奶的tbst溶液中，將條帶放在合適大小的抗體孵育槽中，加入相應抗體稀釋液，置於4℃冰箱中的搖床中孵育過夜；次日回收一抗，用1
×
tbst在轉速較快的搖床上洗膜，10分鐘換一次液，一共洗3次；
[0120]
5)孵育二抗：按1：10000的比例稀釋兔二抗原液，將二抗稀釋液加到膜上，置於慢速搖床上，室溫孵育1小時，然後棄去二抗，用1
×
tbst在轉速較快的搖床上洗膜，10分鐘換一次液，一共洗4次；
[0121]
6)顯影：將ecl的a液和b液按照1：1的比例混勻，均勻滴加到膜上，然後將膜轉移到顯影夾中的乾淨玻璃紙上，立即到暗房中顯影，獲得結果條帶；
[0122]
7)用image j圖像處理軟體統計p-akt和akt灰度，計算p-akt和akt的比值，測試結果如圖3所示。
[0123]
由圖3可知，相比空白對照組，胰島素、實施例1和實施例1+胰島素組的p-akt蛋白表達量更高，說明單獨的胰島素、單獨的組合物以及胰島素和組合物的聯用均可增加akt的磷酸化水平，促進akt信號通路的激活。其中，胰島素和組合物的聯用的效果最好，說明組合物可能增強了胰島素的敏感性，增加胰島素對下遊的pi3k/akt信號通路的激活。另外，在不添加胰島素的情況下，單獨的組合物也可以一定程度增加p-akt的表達量，進一步說明了組合物可以不依賴胰島素提升骨骼肌細胞糖代謝的作用機制。
[0124]
以上所述實施例的各技術特徵可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特徵所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特徵的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的範圍。
[0125]
以上所述實施例僅表達了本技術的幾種實施方式，便於具體和詳細地理解本技術的技術方案，但並不能因此而理解為對申請專利保護範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本技術構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本技術的保護範圍。應當理解，本領域技術人員在本技術提供的技術方案的基礎上，通過合乎邏輯的分析、推理或者有限的試驗得到的技術方案，均在本技術所附權利要求的保護範圍內。因此，本技術專利的保護範圍應以所附權利要求的內容為準，說明書及附圖可以用於解釋權利要求的內容。