木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法的製作方法

2023-06-15 20:24:01

專利名稱：木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物基因轉化方法，特別涉及茶樹等木本植物的活體生長錐農杆 菌轉化法。
背景技術：
植物遺傳轉化是指通過某種技術或途徑，將外源基因導入受體植物基因組中，使 其在受體植物中穩定遺傳，並賦予植物新的農藝性狀，如高抗、高產、優質、代謝物質含量的
顯著變化等等。植物遺傳轉化中，基因受體通常有體外培養材料和活體材料兩類。利用體外培養 材料如原生質體、懸浮培養細胞、愈傷組織、小孢子和原初外植體等作為基因受體，即通過 組織培養和植株再生來實現遺傳轉化，是目前最主要的方法。此外，使用活體材料如完整植 株、種子或花粉等作為基因受體，直接將外源基因導入受體植物也取得了成功。植物遺傳轉化技術可分為兩大類一類是直接基因轉移技術，包括基因槍法、原生 質體法、脂質體法、花粉管通道法、電激轉化法、聚乙二醇轉化法等，其中基因槍法是代表。 另一類是生物介導的轉化方法，主要有農桿菌轉化法和病毒轉化法兩種，其中農桿菌轉化 法操作簡便、成本低、轉化效率高，廣泛應用於雙子葉植物甚至單子葉植物的遺傳轉化。木本植物的遺傳轉化至今為止是一大難題。眾所周知，木本植物在組織培養中經 愈傷再生是非常困難的，這是限制木本植物通過組織培養和植株再生進行遺傳轉化的首要 因素。此外，木本植物普遍含有大量的多酚，多酚在傷口細胞處迅速大量積累，對於植物來 講是一種自我保護機制，但傷口細胞處的多酚如果過重則對農桿菌介導的基因轉化具有抑 製作用，甚至對農桿菌本身具有殺傷作用，從而導致農桿菌轉化法在木本植物基於組織培 養和植株再生的遺傳轉化中表現出轉化頻率很低、效果不穩定、難於重演等問題。因此，著 手木本植物遺傳轉化技術的優化和創新，對推進木本植物基因工程發展意義重大，同時也 是利用現代分子育種技術培育優良品種的迫切需要。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，突 破了木本植物基因轉化困難和再生困難兩大技術瓶頸，不依賴於植物基因型和組織培養， 具有轉化效率高，操作簡單，成本低廉等優點，適用於茶樹等大多數木本植物，尤其是頂芽 飽滿的木本植物。為達到上述目的，本發明的木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，包括以下步驟a、農桿菌工程菌滲透轉化液的配製將含有目的基因的農桿菌工程菌接種於含有 篩選壓的液體培養基中進行培養，當菌液0D_值達到0. 5 1. 0時，向菌液中補加篩選壓， 並加入滲透劑和表面活性劑，配製成農桿菌工程菌滲透轉化液；b、活體生長錐的轉化接種在葉層平均溫度為18 26°C、平均溼度為70 80% 的條件下，將農桿菌工程菌滲透轉化液注射至木本植物新梢頂芽芽苞內的生長錐上；
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C、生長錐與農桿菌工程菌的共培養將轉化後的新梢頂芽在覆蓋吸水保溼材料並 用遮陽網遮陰降溫保溼的條件下共培養2 10天，控制葉層平均溫度為18 26°C、平均溼 度為70 80% ；d、抗性芽的篩選在共培養結束後，向新梢頂芽的生長錐上補加篩選壓，抑制生長 錐中非轉化細胞的分裂，使轉化細胞正常分裂並分化成抗性芽；e、抗性枝條的培養按常規方法進行田間施肥和病蟲防治管理，及時剪掉未經轉 化處理的枝條，使抗性芽生長成抗性枝條；f、轉基因植株的鑑定對抗性枝條進行轉基因鑑定，結果呈陽性的植株即為轉基 因植株。進一步，所述木本植物的頂芽飽滿；進一步，所述木本植物為茶樹；進一步，所述步驟a是將含有目的基因的農桿菌工程菌接種於含有篩選壓、鏈黴 素和利福平的LB液體培養基中進行培養，當菌液OD6tltl值達到0. 6 0. 8時，向菌液中補加 篩選壓，並加入濃度為100g/L的蔗糖、體積百分濃度為0. 02 0. 05%的Silwet L-77和體 積百分濃度為0. 01 0. 05%的吐溫，配製成農桿菌工程菌滲透轉化液；進一步，所述步驟b是在木本植物新梢頂芽飽滿的時期進行轉化接種，且轉化接 種時不損傷或僅輕度損傷生長錐；進一步，所述步驟c是先用吸水保溼性強的棉布覆蓋轉化後的新梢頂芽，再在棉 布上覆蓋50% 90%遮陽網，將生長錐與農桿菌工程菌共培養6天，其中前2天用蔗糖水 溶液噴溼棉布保溼，後4天用水噴溼棉布保溼。本發明的有益效果在於鑑於①農桿菌對傷口細胞或無蠟質層遮蓋的裸露細胞具 有直接侵染特性；②生長錐細胞無外被蠟質層，處於裸露狀態，分裂旺盛，是感受性優良的 基因受體；③木本植物的新梢數量大，頂芽生長錐發育迅速，容易發育成枝條和扦插成苗； 本發明創新提出木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，具有如下優點①不依賴於植物基 因型和組織培養，克服了木本植物基於組織培養和植株再生的遺傳轉化技術存在的兩大障 礙多酚阻礙農桿菌侵染的基因轉化障礙和高度依賴於基因型的再生障礙，適用於大多數 木本植物品種、品系和種質資源材料；②轉化效率高，可以實現高通量的基因轉化；③操作 簡單，技術要領掌握容易，相對成功率大，成本低廉，適合大規模應用；④以活體生長錐細胞 作為基因受體，陽性枝條繁殖採用無性繁殖方式，儘可能地避免了基因飄逸等環境風險；該 方法適用於茶樹等大多數木本植物，尤其是頂芽飽滿的木本植物。推測本發明的木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法的機理在於①生長錐的最外 面兩層細胞為生長錐分化的源泉，具有極強的生長和分化能力；②生長錐外面雖然有葉原 基包裹，但沒有角質層緊密覆蓋，農桿菌菌液能夠輕易滲入到生長錐處，而生長錐細胞為無 蠟質層遮蓋的裸露細胞，農桿菌可以直接浸染；③生長錐為植株的核心部位，擁有最好的營 養條件和生理狀況，只要在進行活體基因轉化操作時不過度傷害生長錐，則轉化後生長錐 細胞的生長和分化良好。


圖1為抗性枝條的卡那黴素鑑定，其中方框處為抗性枝條半成熟葉片的卡那黴素處理區域，圓圈處為非抗性枝條半成熟葉片的卡那黴素處理區域，可見抗性枝條半成熟葉 片的卡那黴素處理區域只有針孔，無褪綠、無黃斑，而非抗性枝條半成熟葉片的卡那黴素處 理區域褪綠而變黃；圖2為抗性枝條的⑶S染色鑑定，其中31為陰性對照，32、33為抗性枝條，ck為非 抗性枝條，可見抗性枝條的GUS染色呈藍色；圖3為抗性枝條的PCR鑑定，其中M泳道為DL2000 DNA分子量標準，-泳道為非 轉基因植株，+泳道為陽性對照(農桿菌工程菌)，1-6泳道為卡那黴素鑑定和GUS染色鑑 定呈陽性的轉基因植株。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖，對本發明的優 選實施例進行詳細的描述。鑑於茶樹屬多年生木本植物，且多酚含量很高，是木本植物中的 典型代表。因此，本發明的優選實施例以茶樹為研究對象，將報告基因gus採用活體生長錐 農桿菌轉化法轉化茶樹5個基因型總計約10萬個生長錐，最終經卡那黴素抗性鑑定、GUS染 色鑑定和PCR鑑定，共獲得轉基因植株32株。其它木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法可 參照茶樹的活體生長錐農桿菌轉化法，基本步驟一致，只需對相應參數和材質進行適當優 化調整即可。一、茶樹的活體生長錐農桿菌轉化法及其條件優化1、農桿菌工程菌的構建採用熱激轉化法將植物雙元表達載體pCAMBIA2301轉入根癌農桿菌菌株LBA4404 中，獲得農桿菌工程菌。標記基因在植物的遺傳轉化過程中用以區分轉化和非轉化細胞，須與目的基因共 同導入轉化細胞。目前廣泛應用的標記基因有除草劑抗性基因和抗生素抗性基因。抗性 標記基因的編碼產物通常是分解除草劑或抗生素的酶，可賦予轉化細胞除草劑或抗生素抗 性，從而使轉化細胞能夠在一定濃度除草劑或抗生素存在下生長而非轉化細胞被殺滅或生 長受到抑制。在本發明中，篩選劑可根據目的基因重組表達載體中的標記基因進行選擇，篩 選劑的最適濃度即篩選壓視不同植物可能有較大差異，可通過實驗進行確定。PCAMBIA2301載體中含有CaMV35S啟動的含有內含子的β-葡萄糖苷酸酶基因 (gus)和CaMV35S啟動的新黴素磷酸轉移酶基因(npt II),npt II基因的編碼產物對卡那 黴素具有抗性，因此，本實施例以卡那黴素為篩選劑。2、農桿菌工程菌的培養挑取農桿菌工程菌單菌落接種於含有濃度為100mg/L的卡那黴素、濃度為25mg/ L的鏈黴素和濃度為40mg/L的利福平的YEP液體培養基中，在溫度為28°C、振蕩速度為 250rpm的條件下振蕩培養，當菌液0D_值達到0. 8時，以轉速為5000rpm離心10分鐘，收 集菌體，用含有濃度為100 μ mol/L的乙醯丁香酮的MS液體培養基重懸，用於配製農桿菌工 程菌滲透轉化液。3、生長錐篩選壓的確定向室外栽培茶苗的頂芽生長錐上注射濃度分別為50、100、200、300、400、500、 600mg/L的卡那黴素水溶液，分別於處理後15天和30天觀察生長錐對不同濃度的卡那黴素
5的反應，以確定篩選壓。4、農桿菌工程菌滲透轉化液的配製將用含有乙醯丁香酮的MS液體培養基重懸的農桿菌工程菌接種於含有濃度為 100mg/L的卡那黴素、濃度為20mg/L的鏈黴素和濃度為40mg/L的利福平的LB或MS液體培 養基中，在溫度為28°C、振蕩速度為250rpm的條件下振蕩培養，當菌液OD6tltl值達到0. 6 0. 8時，分別按下述不同配方添加卡那黴素、蔗糖、SilwetL-77和吐溫20，配製農桿菌工程 菌滲透轉化液，考察農桿菌工程菌滲透轉化液對活體生長錐轉化率的影響。農桿菌工程菌株滲透轉化液的配方如下(各試劑的濃度均為終濃度)A 農桿菌工程菌菌液+LB液體培養基；B 農桿菌工程菌菌液+LB液體培養基+濃度為300mg/L的卡那黴素；C 農桿菌工程菌菌液+LB液體培養基+濃度為100g/L的蔗糖+體積百分濃度為 0. 05%的Silwet L-77+體積百分濃度為0. 03%的吐溫20 ；D 農桿菌工程菌菌液+LB液體培養基+濃度為300mg/L的卡那黴素+濃度為 100g/L的蔗糖+體積百分濃度為0. 05%的Silwet L-77+體積百分濃度為0. 03%的吐溫 20 ；E 農桿菌工程菌菌液+MS液體培養基+濃度為300mg/L的卡那黴素+濃度為 100g/L的蔗糖+體積百分濃度為0. 05%的Silwet L-77+體積百分濃度為0. 03%的吐溫 20。5、活體生長錐的轉化接種分別在不同氣候條件下進行轉化接種第1、2組以無雨的陰天為主，第3組以晴天 為主，用醫用注射器將農桿菌工程菌滲透轉化液10 50 μ L迅速注射至茶樹每個新梢頂芽 芽苞內的生長錐上，注射時不損傷或僅輕度損傷生長錐，並用油性記號筆在轉化株第二葉 面和第二、三葉間莖部做上明顯標誌；轉化接種前3天用吸水保溼性強的白棉布覆蓋新梢 頂芽，並定時用清水噴溼棉布保溼，分別於每天上午10點和下午3點測量葉層溫度和溼度 並計算轉化前3天的平均值，考察葉層平均溫、溼度對活體生長錐轉化率的影響。6、生長錐與農桿菌工程菌的共培養分別在不同覆蓋遮陽保溼處理下進行共培養第1組不進行覆蓋遮陽保溼處理， 第2、3組在轉化接種完成後，先用吸水保溼性強的白棉布迅速覆蓋轉化頂芽，第2組再在白 棉布上覆蓋50%綠色遮陽網、第3組再在棉布上覆蓋90%黑色遮陽網，覆蓋遮陽保溼共培 養6天，其中前2天用質量體積百分濃度為1%。的蔗糖水溶液噴溼棉布保溼，後4天用清水 噴溼棉布保溼，考察不同覆蓋遮陽保溼處理對活體生長錐轉化率的影響。7、抗性芽的篩選分別在不同篩選壓條件下進行抗性芽的篩選第1組不補充篩選壓，第2組補充 篩選壓，在共培養結束後，向每個轉化頂芽生長錐上注射濃度為300mg/L的卡那黴素水溶 液50 μ L，抑制生長錐中非轉化細胞的分裂，使轉化細胞正常分裂並分化成抗性芽，考察不 同篩選壓對活體生長錐轉化率的影響。8、抗性枝條的培養按常規方法進行田間施肥和病蟲防治等管理，及時剪掉新長出但沒有轉化標記的 非處理枝條，每1 2月修剪1次，使抗性芽優先生長，形成抗性新梢和抗性枝條。
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9、抗性枝條的卡那黴素抗性鑑定(1)、半成熟葉片篩選壓的確定在室外栽培茶苗的半成熟葉片上直接滴加或打孔後滴加濃度分別為4、8、10、12、 14、16g/L的卡那黴素水溶液，並用棉球保溼遮陰，分別於處理後15天和30天觀察半成熟葉 片對不同濃度的卡那黴素的反應，以確定篩選壓。(2)、抗性枝條的卡那黴素抗性鑑定待抗性枝條長至足夠長度，其上的葉片呈半成熟狀態即典型功能葉中期階段，選 擇無雨的陰天，在葉片上打孔後滴加濃度為15g/L的卡那黴素水溶液200 μ L，第二天補加1 次，處理數日後觀察葉片上處理區域的顏色變化情況，無褪綠、無黃斑或程度極輕微者即具 有卡那黴素抗性，褪綠而變黃者則不具有卡那黴素抗性(如圖1所示)。10、抗性枝條的⑶S染色鑑定待抗性枝條長至足夠長度時，剪取0. 5cm2的嫩葉，浸入GUS染色工作液(含有體積 百分濃度為20%的甲醇以抑制植物體內GUS活性)中染色，37°C保溫過夜，再用體積百分濃 度為90%的乙醇水溶液脫色漂洗2次以消除葉綠素的幹擾，觀察組織染色情況，以確定gus 基因是否成功轉入茶樹基因組中並表達。陽性染色呈藍色(如圖2所示)。11、抗性枝條的PCR鑑定取抗性枝條的功能葉，用常規CTAB法提取基因組DNA ；以該基因組DNA為模板、 5，-ctgaactggcagactatcccg-3，和 5，-gtccgcatcttcatgacgacc-3，為上下遊弓丨物進行 PCR 鑑定，PCR體系為總體積為25 μ L的標準Taq PCR體系，其中含有基因組DNA 2μ 1 ； PCR循 環條件參數為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性1分鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸1分 鍾，共35個循環，最後72°C延伸10分鐘，25°C保溫10分鐘。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電 泳，有489bp的唯一特異條帶者判為陽性，無此條帶者判為陰性(如圖3所示)。( 二)、不同茶樹基因型的活體生長錐農桿菌轉化採用上述活體生長錐農桿菌轉化法及其優化條件，本發明共進行了福鼎大白茶、 渝茶1號、渝茶2號3個品種兩個品系共5個基因型的活體生長錐農桿菌轉化，其中渝茶1 號為大葉型，福鼎大白茶和株系1為中葉型，渝茶2號和株系2為小葉型。(三)、統計方法由於整個實驗規模很大，不便於精確計數，故實驗結果均為抽樣鑑定值。卡那黴素 抗性鑑定重複3次，至少2次結果為陽性者計入統計結果，GUS染色鑑定和PCR鑑定各重複 2次，2次結果均為陽性者計入統計結果。二、實驗結果1、生長錐篩選壓的確定實驗結果顯示，生長錐的篩選壓為300mg/L，在該篩選壓下，生長錐的生長速度明 顯受到抑制但不會導致生長錐死亡。2、農桿菌工程菌滲透轉化液配方對活體生長錐轉化率的影響農桿菌工程菌滲透轉化液配方對活體生長錐轉化率的影響見表1。由表1可知，農 桿菌工程菌滲透轉化液對活體生長錐轉化率具有顯著影響配方A無篩選壓、滲透劑和表 面活性劑，轉化率為0 ；配方B有篩選壓但無滲透劑和表面活性劑，配方C有滲透劑和表面 活性劑但無篩選壓，轉化率較低；配方D和E既有篩選壓又有滲透劑和表面活性劑，轉化率較高；說明篩選壓、滲透劑和表面活性劑均是影響活體生長錐轉化率的關鍵因素。此外，滲 透轉化液的培養基種類對活體生長錐轉化率也有較大影響，LB液體培養基優於MS液體培 養基，說明在活體生長錐農桿菌轉化法中確保農桿菌工程菌的侵染活力比保證頂芽的舒適 度更為重要。表1農桿菌工程菌滲透轉化液配方對活體生長錐轉化率的影響_滲透轉化液配方ABCDE_3、葉層平均溫、溼度對活體生長錐轉化率的影響葉層平均溫、溼度對活體生長錐轉化率的影響見表2。由表2可知，第1、2組葉層 平均溫度差異較小，均接近文獻報導的農桿菌侵染最適溫度23 °C，但平均溼度有一定差異， 平均溼度較大的第1組的轉化率優於平均溼度較小的第2組；第3組葉層平均溫度與農杆 菌侵染最適溫度相差較大，且葉層平均溼度較低，轉化率為0 ；表明葉層平均溼度是影響活 體生長錐轉化率的重要因素，較高的葉層溼度保證了農桿菌工程菌滲透轉化液不被迅速蒸 發，使農桿菌工程菌有足夠的活力和時間對生長錐進行侵染。表2葉層平均溫、溼度對活體生長錐轉化率的影響
4、不同覆蓋遮陽保溼處理對活體生長錐轉化率的影響。不同覆蓋遮陽保溼處理對活體生長錐轉化率的影響見表3。由表3可知，覆蓋遮陽 保溼處理是室外維持農桿菌工程菌轉化最適環境條件的關鍵措施，當不進行覆蓋遮陽保溼 處理時，轉化率為0 ；當採用棉布+50%綠色遮陽網或棉布+90 %黑色遮陽網進行覆蓋遮陽 保溼處理時，轉化率較高且二者之間差異不大，可能是由於棉布的噴液保溼作用，在棉布上 再覆蓋50%綠色遮陽網或90%黑色遮陽網對棉布下葉層溫、溼度的影響並不顯著。表3不同覆蓋遮陽保溫處理對活體生長錐轉化率的影響_卡那黴素抗性 ⑶S染色PCR鑑定覆蓋遮陽保溼處理
卡那黴素抗性 ⑶S染色PCR鑑定
陽性植株數陽性植株數陽性植株數
000
801
602
922329
5697
編號 葉層平均溫度/溼度卡那黴素抗性GUS染色PCR鑑定
CC/%)陽性植株數陽性植株數 陽性植株數
122.3/80922021
224.5/72701216
327. 3/65000
8
陽性植株數不進行覆蓋遮陽保溼處理0棉布+50%綠色遮陽網 80棉布+90%黑色遮陽網 86_5、不同篩選壓對活體生長錐轉化率的影響不同篩選壓對活體生長錐轉化率的影響見表4。由表4可知，共培養結束後立即補 充注射濃度為300mg/L的卡那黴素，使生長錐在分化期間維持適當的篩選壓，有利於生長 錐中轉化細胞優先分裂，形成抗性生長錐並分化成抗性芽，同時降低形成嵌合體的可能性。表4不同篩選壓對活體生長錐轉化率的影響_是否補充選擇壓補充不補充_6、半成熟葉片篩選壓的確定實驗結果顯示，室外栽培茶苗的半成熟葉片由於有一層較厚的蠟質層及受自然光 照環境的影響，所有卡那黴素濃度梯度直接滴加處理30天均未對葉片生長產生抑制作用； 而打孔後滴加卡那黴素的處理結果具有濃度梯度差異，處理後15天濃度在10g/L以下的卡 那黴素處理對葉片生長無抑制效果，處理後30天濃度在8g/L以下的卡那黴素處理對葉片 生長無抑制效果，濃度為12g/L的卡那黴素處理後15 30天葉片上相應區域出現黃斑，但 後期不會穿孔掉葉，而濃度為16g/L的卡那黴素處理後15 30天葉片上相應區域出現黃 化，後期出現穿孔但不掉葉，因此，確定半成熟葉片的篩選壓為12 15g/L。7、不同茶樹基因型對活體生長錐轉化率的影響不同茶樹基因型對活體生長錐轉化率的影響見表5。由表5可知，不同茶樹基因型 對活體生長錐轉化率有一定影響，大葉型和中葉型的轉化率較高且二者之間差異不大，小 葉型的轉化率相對較低。分析其原因可能在於①生長錐內含物質的影響文獻報導，茶樹 茶多酚的抗菌性是降低轉化率的重要因素。本實驗三種葉型茶樹的茶多酚含量依次為大 葉型> 中葉型>小葉型，但茶多酚含量高的大葉型的轉化率高於茶多酚含量低的小葉型， 可能是由於三種葉型茶樹茶多酚含量的差異在春季對活體生長錐的轉化率不具有顯著影 響，而大葉型由於具有較大的頂芽易於轉化成功。②芽型的影響本實驗三種葉型茶樹春 季中後期新梢頂芽的大小和飽滿程度依次為大葉型> 中葉型>小葉型，恰與活體生長錐 轉化率成正相關，說明新梢頂芽的大小和飽滿程度可能是影響活體生長錐轉化率的重要因 素。大而飽滿的芽頭能夠容納更多的農桿菌工程菌滲透轉化液，從而能夠保證足夠的工程 菌量，並能夠使工程菌維持更長時間的活力。此外，同型號的醫用注射器對大葉型生長錐的 傷害相對較小，從而使其轉化率較高。表5不同茶樹基因型對活體生長錐轉化率的影響
陽性植株數 0 15 17
陽性植株數 0 19 18
卡那黴素抗性GUS染色
PCR鑑定
陽性植株數 陽性植株數 陽性植株數 1482731
14560114]茶樹基因型卡那黴素抗性陽性植株數GUS染色陽性植株數PCR鑑定陽性植株數
大葉型821518
中葉型701516
小葉型1023
以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過按照本發明的優選 實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細 節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。序列表重慶市農業科學院木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法2121DNA人工序列抗性枝條的PCR鑑定的上遊引物1ctgaactggc agactatccc g21221DNA人工序列抗性枝條的PCR鑑定的下遊引物2gtccgcatct tcatgacgac c2權利要求
木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，其特徵在於包括以下步驟a、農桿菌工程菌滲透轉化液的配製將含有目的基因的農桿菌工程菌接種於含有篩選壓的液體培養基中進行培養，當菌液OD600值達到0.5～1.0時，向菌液中補加篩選壓，並加入滲透劑和表面活性劑，配製成農桿菌工程菌滲透轉化液；b、活體生長錐的轉化接種在葉層平均溫度為18～26℃、平均溼度為70～80％的條件下，將農桿菌工程菌滲透轉化液注射至木本植物新梢頂芽芽苞內的生長錐上；c、生長錐與農桿菌工程菌的共培養將轉化後的新梢頂芽在覆蓋吸水保溼材料並用遮陽網遮陰降溫保溼的條件下共培養2～10天，控制葉層平均溫度為18～26℃、平均溼度為70～80％；d、抗性芽的篩選在共培養結束後，向新梢頂芽的生長錐上補加篩選壓，抑制生長錐中非轉化細胞的分裂，使轉化細胞正常分裂並分化成抗性芽；e、抗性枝條的培養按常規方法進行田間施肥和病蟲防治管理，及時剪掉未經轉化處理的枝條，使抗性芽生長成抗性枝條；f、轉基因植株的鑑定對抗性枝條進行轉基因鑑定，結果呈陽性的植株即為轉基因植株。
2.根據權利要求1所述木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，其特徵在於所述木本 植物的頂芽飽滿。
3.根據權利要求2所述木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，其特徵在於所述木本 植物為茶樹。
4.根據權利要求1至3任一項所述木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，其特徵在 於所述步驟a是將含有目的基因的農桿菌工程菌接種於含有篩選壓、鏈黴素和利福平的 LB液體培養基中進行培養，當菌液0D_值達到0. 6 0. 8時，向菌液中補加篩選壓，並加入 濃度為100g/L的蔗糖、體積百分濃度為0. 02 0. 05%的Silwet L-77和體積百分濃度為 0. 01 0. 05%的吐溫，配製成農桿菌工程菌滲透轉化液。
5.根據權利要求1至3任一項所述木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，其特徵在於 所述步驟b是在木本植物新梢頂芽飽滿的時期進行轉化接種，且轉化接種時不損傷或僅輕 度損傷生長錐。
6.根據權利要求1至3任一項所述木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，其特徵在於 所述步驟c是先用吸水保溼性強的棉布覆蓋轉化後的新梢頂芽，再在棉布上覆蓋50% 90 %遮陽網，將生長錐與農桿菌工程菌共培養6天，其中前2天用蔗糖水溶液噴溼棉布保 溼，後4天用水噴溼棉布保溼。
全文摘要
本發明公開了木本植物的活體生長錐農桿菌轉化法，包括農桿菌工程菌滲透轉化液的配製、活體生長錐的轉化接種、生長錐與農桿菌工程菌的共培養、抗性芽的篩選、抗性枝條的培養、轉基因植株的鑑定等多個步驟；本發明突破了木本植物基因轉化困難和再生困難兩大技術瓶頸，不依賴於植物基因型和組織培養，具有轉化效率高，操作簡單，成本低廉等優點，適用於茶樹等大多數木本植物，尤其是頂芽飽滿的木本植物。
文檔編號A01H5/00GK101935672SQ20101010700
公開日2011年1月5日 申請日期2010年2月8日 優先權日2010年2月8日
發明者吳全, 周正科, 姚永宏, 李中林, 柴友榮 申請人:重慶市農業科學院