來源於單核細胞的去分化的可程序化幹細胞及其製備和應用的製作方法
2023-06-16 06:22:26
專利名稱：來源於單核細胞的去分化的可程序化幹細胞及其製備和應用的製作方法
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本發明涉及由人單核細胞生成的成熟的去分化的可程序化幹細胞及其製備，以及它們在製備體細胞和組織產品中的用途。根據本發明特別優選的實施方案，所述細胞為自體的人幹細胞，即單核細胞來源的細胞來自欲接受幹細胞和/或該幹細胞生成的體細胞治療的病人。在現有技術中，術語「幹細胞」是指具有(a)自我更新能力和(b)由於其不對稱分裂能力而形成至少一種和通常是多種特化細胞類型的能力的細胞(參見Donovan，P.J Gearhart，J Nature 41492-97(2001))。術語「多能性的」是指幹細胞基本上能被分化為人類和動物體的所有可能的細胞類型。迄今為止，這樣的幹細胞僅僅可以從胚胎組織或胚胎癌(睪丸腫瘤)中獲得(參見Donovan，P.J.Gearhart，J在上述引文中)。胚胎幹細胞的應用已經成為公眾廣泛討論的話題，尤其是在德國，這被認為是非常嚴重的問題。除了胚胎幹細胞涉及的倫理和法律問題，這種細胞的醫療應用也遇到許多困難。顯然，來自於供體機體的胚胎幹細胞相對於將要接受由這些胚胎幹細胞生成的分化了的細胞或組織(此後稱之為靶體細胞或靶組織)的受體而言是異源的。因此可以預見這類靶細胞將在未來受體的體內引發排斥反應形式的速髮型免疫反應。
幹細胞可以從成人的不同組織中分離到，即從分化的個體中分離到。這些幹細胞在現有技術中稱之為「多能性成體幹細胞」。它們在體內組織再生和穩態(homeostasis)中發揮作用。胚胎多能性幹細胞與成體多能性幹細胞之間的本質區別在於從各自細胞能得到的分化的組織的數目。推測起來，這是由於多能性幹細胞來源於精細胞或者能夠產生精子的細胞，而成體多能性幹細胞來源於成人個體中不能產生精子的身體或體細胞。
然而，有關獲得和使用成體幹細胞的實際問題還在於這些細胞的稀缺性。因而，在骨髓中僅含有比例為1∶10,000的幹細胞，外周血液中為1∶250,000，肝臟中的比例為1∶100,000。因此對於患者而言獲得幹細胞是十分昂貴和困難的。另外，迄今為止以合理的費用獲得臨床治療所需的大量這類細胞的生產幾乎是不可能的。
而與此形成鮮明對比的是，以「組織工程」或細胞治療的方式對受損組織進行治療的可能性卻在不斷提高，在「組織工程」或細胞治療構架中，將對皮膚、肌肉、心肌、肝臟、胰島、神經、神經元、骨骼、軟骨、內皮和脂肪細胞等進行替換。
與此相關，西方世界人口年齡和疾病狀況的可預見的發展決定了下一個十年是西歐，包括美國和加拿大的人口的健康和醫療發展的重大轉折點。僅僅在德意志聯邦共和國，人口統計學進展顯示，截至2015年，45-64歲年齡段的人口增長21％，超過65歲的年齡段的人口增長26％。這必然將導致病人結構和需要醫療的疾病譜產生變化。可以預見，心循環系統疾病(高血壓、心肌梗塞)、源於動脈硬化和代謝疾病的血管疾病、代謝疾病如糖尿病、肝代謝疾病、腎病、以及由年齡相關的退化引起的骨骼系統疾病、神經元和神經膠質細胞損失引起的大腦退化疾病將增加並需要更新的治療概念。
基於上述情況有關的專家迅速努力開展國內和國際間的研究和開發，去獲得能夠程序化生成組織(肝臟、骨骼、軟骨、肌肉、皮膚等)特有的分化細胞的幹細胞。
因此，本發明所要解決的問題是製備可用的成體幹細胞，該幹細胞的生成不產生倫理和/或法律問題，該幹細胞能夠以所需數量、合理的生產成本迅速按計劃用於治療用途，且該幹細胞用於「細胞治療」時不會在病人體內產生細胞排斥和誘發腫瘤尤其是惡性腫瘤形式的副作用，或者不產生值得注意的副作用。
根據本發明，該問題是通過製備來源於人單核細胞的去分化的可程序化細胞來解決的，鑑於本發明的目的，此後它被稱之為「幹細胞」。術語「去分化」是所屬領域技術人員所熟知的，參見WeissmanI.L Cell 100157-168，圖4，(2000)。它是指一種成體的，已經特化的(分化的)體細胞退化為幹細胞，後者反過來又能夠轉化(程序化)成多種細胞類型的細胞。令人驚訝的是，已經證明本發明所述的方法能夠導致單核細胞去分化。用這種方法製備的幹細胞能夠被轉化(程序化)為大量不同的靶細胞/靶組織，參見實施例。本發明所述的幹細胞除了表達分化的單核細胞的特異性表面抗原CD14之外，還能表達至少一種，優選兩種或三種典型的多能性標記CD90、CD117、CD123和CD135。在特別優選的方式中，本發明製備的幹細胞表達表面抗原CD14和四種多能性標記CD90、CD117、CD123和CD135，參見實施例2、表1。優選本發明的幹細胞表達膜聯單核細胞特異性的表面抗原CD14，以及至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。更優選本發明的幹細胞帶有抗原CD14與至少多能性標記CD123和/或CD135的組合。低於3％，優選低於1％的本發明所述的幹細胞表達抗原CD34。最優選本發明的幹細胞不表達抗原CD34。通過上述方法，首次獲得了能夠在短時間內再次程序化成優選的自體組織的成體幹細胞。
本發明的幹細胞的產生對患者是完全無害的，且在自體應用情形中與自體血液回輸相類似。在抽血後10至14天內就可以以合理的成本得到通常的治療所需要(見上文)數量的幹細胞(108至109的細胞)。另外如果作為自體應用，由於細胞和受體優選相同的遺傳性，用於治療的細胞產品不會引起任何細胞排斥形式的免疫問題。
動物實驗和培養證明，本發明所述的幹細胞在引發惡性腫瘤方面是安全的，估計產生這一結果的原因是本發明所述幹細胞是單核細胞來源的。
本發明所述來源於人單核細胞的去分化的可程序化幹細胞的製備過程包括以下基本步驟(a)從人血中分離單核細胞；(b)在裝有包含巨噬細胞集落刺激因子(此後簡稱為M-CSF)的細胞培養基的合適的培養容器中增殖單核細胞；和(c)在白細胞介素-3(IL-3)的存在下培養單核細胞；和(d)從培養基中分離得到人去分化的可程序化的幹細胞。
在該過程特別優選的實施方案中，M-CSF和IL-3是在步驟(b)中同時加入細胞培養基中的。
然而為了引起單核細胞增殖，最初在步驟(b)中只向細胞培養基中加入M-CSF，隨後再向細胞培養基中加入IL-3也是可能的。
最後，步驟(b)的過程也可以通過以下方式進行單核細胞最初在僅包含M-CSF的細胞培養基中增殖，然後將培養基與細胞分離，再使用包含IL-3的另一種細胞培養基。
本發明優選的實施方案是在步驟(b)中，培養基與貼附於培養容器底部的細胞分離，使人去分化的可程序化幹細胞通過脫離底面並分離細胞而獲得。
本發明優選的實施方案是細胞在含硫化合物的存在下進一步培養。這種培養可以是在如上所述培養步驟(b)之後獨立步驟中的培養，也可以是通過在步驟(b)中向培養基中進一步加入含硫化合物而進行，其優選在培養的開始階段加入。
意想不到的是本發明所述方法導致了單核細胞去分化，其中去分化形成的成體幹細胞除了表達去分化的單核細胞特有的表面抗原CD14之外，還表達了至少一種或多種，優選所有的多能性標記CD90、CD117、CD123和CD135(參見表1)。優選本發明的幹細胞表達膜聯單核細胞特異性表面抗原CD14和至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。更優選本發明的幹細胞帶有抗原CD14與至少多能性標記CD123和/或CD135的組合。低於3％。優選低於1％的本發明所述的幹細胞表達抗原CD34。最優選本發明的幹細胞不表達抗原CD34。各種標記(表面抗原)的表述可以通過商業上可獲得的對各種要檢測的抗原特異性的抗體，應用標準免疫測定方法去檢驗，參見實施例2。
在增殖和去分化過程中，由於細胞貼附於各個培養容器底部，必須將細胞在步驟(b)從培養基中分離出來，使其在去分化結束後從容器底部剝離。本發明所述優選的實施方案是貼附於底部的細胞脫離之前將細胞培養基的上清液棄去，隨後貼附的細胞優選用新鮮培養基清洗。清洗後再向貼附於底部的細胞加入新鮮培養基，然後進行將細胞從底部分離的步驟(參見實施例13)。
優選的實施方案是在步驟(c)的最後、步驟(d)之前，將細胞與生物學上可良好耐受的有機溶劑接觸。生物學上可良好耐受的有機溶劑可以是含1-4個碳原子的醇，優選使用乙醇。
進一步的實施方案是在步驟(c)的最後、步驟(d)之前，細胞與生物學上可良好耐受的有機溶劑的蒸汽相接觸。
細胞剝離也可以採用機械方法，但是優選使用例如胰蛋白酶進行的酶解剝離的方法。
這種方法獲得去分化的可程序性幹細胞在培養基中自由流動，能夠直接進入再次程序化的過程，或者在培養基中保持幾天；後一種情況中，為了避免程序化能力的過早損失，優選向培養基中加入細胞因子或LIF(白血病抑制因子)(參見Donovan，P5 Gearhart，J在上述引文中，第94頁)。最後為了貯存的目的可將細胞深度冷凍，而不喪失可程序化性。
本發明所述的幹細胞不同於迄今為止已知的胚胎來源的多能性幹細胞和來源於不同組織的已知的成體幹細胞，其差別在於除了帶有膜聯單核細胞特異性表面抗原CD14之外，它們表面上還帶有至少一種選自CD90、CD117、CD123和CD135的多能性標記。優選本發明的幹細胞帶有膜聯單核細胞特異性表面抗原CD14和至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。更優選本發明的幹細胞帶有抗原CD14與至少多能性標記CD123和/或CD135的組合。低於3％，優選低於1％的本發明所述的幹細胞表達抗原CD34。最優選本發明的幹細胞不表達抗原CD34。
應用本發明所述方法生產的幹細胞可以被重新程序化生成任何體細胞。幹細胞的重新程序化的方法是現有技術中已知的，參見例如Weissman I.L Science 2871442-1446(2000)和Insight ReviewArticles Nature 41492-131(2001)，以及手冊「Methods of TissueEngineering」，Eds.Atala，A Lanza，R.P Academic Press，ISBN0-12-436636-8；Library of Congress Catalog CardNo.200188747。
此外本發明所述的幹細胞重新程序化獲得的分化的分離的靶體細胞和/或靶組織都帶有單核細胞的膜聯CD14分化標記。另外，低於3％、優選低於1％的本發明所述的這些靶體細胞和/或靶組織表達抗原CD34。最優選這些細胞或組織不表達抗原CD34。如實施例11所示，來源於本發明所述幹細胞的肝細胞表達單核細胞特有的表面標記CD14的同時也生成了肝細胞特有的白蛋白。來源於本發明所述幹細胞的肝細胞因此而區別於天然的肝細胞。利用同樣的方法，在來源於本發明所述幹細胞的胰島素產生性細胞上也檢測到膜聯表面標記CD14(實施例9)。
本發明的一個具體實施方案是去分化的可程序化幹細胞用於體外製備靶細胞和靶組織(參見實施例)。因此，通過本發明所述的幹細胞分化(重新程序化)獲得的攜帶膜聯表面抗原CD14的分化的、分離的組織細胞也是本發明的主題。
在用於各種靶細胞和/或其碎片培養的(參見實施例6至8)、包含培養基上清液的培養基中培養幹細胞，使本發明所述的幹細胞優選地、簡單可靠地在體外分化成期望的靶細胞，例如脂肪細胞(參見實施例6)、神經元和神經膠質細胞(參見實施例3)、內皮細胞(參見實施例5)、角質細胞(參見實施例8)、肝細胞(參見實施例7)和胰島細胞(胰島，參見實施例9)。此後該上清液稱之為靶細胞條件化培養基。
為了本發明所述的去分化幹細胞的分化(重新程序化)可以按照如下步驟進行a)粉碎包含或由期望的靶細胞組成的組織；b)得到組織細胞(靶細胞)和/或其碎片；c)靶細胞和/或其碎片在適宜的的培養基中培養；d)在培養過程中或培養之後收集培養基上清液，作為靶細胞條件化培養基；和e)為了去分化幹細胞重新程序化分化成期望的靶細胞或靶組織，將幹細胞在靶細胞條件化培養基中培養。
可使用標準細胞培養基作為培養基(參見實施例)。培養基優選包含生長因子，如表皮生長因子。
靶細胞和/或其碎片(「細胞沉澱」)的培養需要經過5-15天，優選10天。上清液即靶細胞條件化培養基優選每2-4天後移出並用新鮮的培養基替換。得到的上清液分別在無菌條件下過濾，收集後在約-20℃下貯存，或者直接用於幹細胞的程序化。如上所述，通過在各種靶細胞條件化培養基中培養幹細胞以使幹細胞程序化為期望的靶細胞(參見實施例)。生長培養基優選另外還含有一種靶細胞特異性生長因子，例如「肝細胞生長因子」或「角質細胞生長因子」(參見實施例)。
本發明的一個具體實施方案是本發明所述的去分化的程序化幹細胞本身用於製備體內生成靶細胞和靶組織的藥物組合物。
這種藥物製劑可以包含懸浮於生理上良好耐受的介質中的本發明所述幹細胞。適合的介質例如PBS(磷酸鹽緩衝液)或含有20％的人白蛋白溶液的生理鹽水等等。
這些藥物製劑中包含本發明所述的有活力的去分化的可程序化幹細胞，它們的表面帶有CD14表面標記和至少一種以上的多能性幹細胞標記CD90、CD117、CD123和/或CD135，其相對於製劑中存在的細胞總數的百分含量為1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％、優選為60或70％，特別優選為80或90％和最優選為100％的，這些藥物製劑任選進一步含有藥學上可良好耐受的佐劑和/或載體物質。
幹細胞製劑包含的本發明所述的有活力的、去分化的、可程序化幹細胞的表面帶有CD14表面標記和至少一種以上的多能性幹細胞標記CD90、CD117、CD123和/或CD135，其相對於製劑中存在的細胞總數的百分含量為1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59％、優選至少60％；例如PBS或RPMI等細胞良好耐受的細胞培養或轉移培養基的細胞懸浮液，或者含有50％人白蛋白溶液和10％DMSO的RPMI的合適的貯存培養基中深度冷凍的細胞製劑都是優選的。
有活力細胞的數目和上述組合物中它們的比例可以通過使用「臺盼藍染料排除技術」光學檢測，因為使用這種染料能夠用光學檢測區分無活力細胞和有活力細胞。
通常，如果在存在足夠數量的功能性幹細胞的前提下，在藥物製劑中存在一些不能達到本發明所述的去分化可程序化細胞的標準的細胞，不會影響臨床治療。然而也可能根據該製劑中含有的本發明所述的去分化細胞特有的表面標記，利用現有技術中已知方法中的手段去除非去分化的細胞，以獲得基本上純的包含期望細胞的製劑。適合的方法例如「免疫磁珠分選」，參見Romani等人，J.Immunol.Methods 196137-151(1996)。
通過直接接觸特定細胞類型的細胞群，幹細胞能夠進一步自動地在體內分化形成該類型的細胞。利用能夠再分化的細胞製備組織的方法(「組織工程」)是現有技術中已知的。例如，Wang，X.等人(「Liver vepopulation and correction of metabolic liverdisease by transplanted abult mouse pancreatic cells」Am.J.Pathol.158(2)571-579(2001))已經證明在FAH-(富馬醯乙醯乙酸水解酶)缺陷小鼠中，某些小鼠體內成體胰臟細胞能夠被轉化為肝細胞中，由此能夠完全彌補這些動物的代謝功能的損失。進一步的例子為Lagasse等人，「Purified hematopoieticstem cells candifferentiate into hepatocytes in vivo」，Nature Medicine，6(11)1229-1234(2000)的實驗。作者指出骨髓中的造血幹細胞在轉移入FAH-缺陷的小鼠體內後能夠轉化成肝細胞從而彌補代謝功能的損失；也可以參見Grompe M.的綜述「Therapeutic LiverRepoplilation for the Treatment of Metobolic Liver Diseases」Hum.Cell，12171-180(1999)。
特別優選的本發明所述去分化的幹細胞在體內分化的應用形式是注射、輸液或將幹細胞植入體內特定的細胞群中，通過使幹細胞直接與細胞群接觸而使幹細胞在其中分化成特定細胞類型。注射或輸液時細胞可以在PBS(磷酸鹽緩衝液)中施用。
相關的適應症優選的例子有肝硬變、胰機能不全、急性或慢性腎衰、激素功能低下、心肌梗塞、肺拴塞、中風和皮膚損傷。
因此本發明優選的實施方案是去分化、可程序化幹細胞在製備治療肝硬變、胰機能不全、急性或慢性腎衰、激素功能低下、心肌梗塞、肺拴塞、中風和皮膚損傷的藥物組合物的應用。
由本發明所述的幹細胞獲得的靶細胞的治療用途涉及的許多概念都是已知的(參見Science 2871442-1446(2000)和Nature41492-131(2001))。
更優選的使用涉及注射本發明所述的去分化的幹細胞入腹膜，由於其周圍細胞的影響，它們可以就地分化為腹膜細胞。當腎機能不全的病人需要腹膜透析時，這些細胞能夠通過半透膜取代腎功能，將依賴腎排出的廢物釋放到腹膜中經透析液將其排出。
因此通過幹細胞再程序化獲得的特徵在於膜聯CD14抗原的分化的、分離的靶體細胞和/或靶組織也是本發明的目的。這些靶體細胞和/或靶組織優選含有脂肪細胞、神經元和神經膠質細胞、內皮細胞、角質細胞、肝細胞和胰島細胞。
然而，細胞也可以直接引入將要重建的器官中。這種引入通過被相應的分化的細胞或能夠分化的細胞包裹的基質構建體來完成。基質構建體通常是生物可降解的，當新引入的細胞和已有細胞長在一起時，其可以排出體外。從這個觀點出發，例如細胞，優選是胰島細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、肌細胞、心肌細胞、神經細胞、骨細胞、內分泌細胞等形式的自體移植物開始被考慮用於例如器官部分手術切除後的重建，用於如創傷後的修復，或用於如在器官功能缺失或不全時的支持用途。
本發明所述的幹細胞和由其獲得的靶細胞通常被用於包裹可移植物以提高生物相容性。因此被去分化的可程序化幹細胞或靶體細胞和/或靶組織所包裹的可移植物也是本發明的目的。本發明所述的實施方案是這些可移植材料是假器官。在特別優選的實施方案中，假器官是心臟瓣膜、人工血管、人工骨骼和關節。
可移植物也可以是包含在分化的可程序化幹細胞或靶細胞的人工和/或生物載體材料。此時載體材料可以是引入人體的囊或室。
在一種本發明的實施方案中，包含如胰島細胞的本發明所述分化的體細胞的袋用於製備作為提供胰島素的人工胰島細胞孔口室(port chamber)的藥物構建體。
在一種本發明的進一步實施方案中，包含本發明所述分化的體細胞如脂肪細胞的囊或室用於製備一種填充了脂肪細胞的人造聚合物，它可作為手術後乳房構建以及在整形和/或美容矯正時的進一步適應症的藥物構建體。
此外，包含多種不同來源的內分泌細胞的半透性孔口室系統能夠用於體內治療內分泌、代謝或凝血功能紊亂。所述內分泌細胞例如產生甲狀腺素、類固醇、ADH、醛固酮、褪黑素、5-羥色胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、TSH、LH、FSH、瘦素、縮膽囊素、胃泌素、胰島素、胰高血糖素或凝血因子的細胞。
因此包含分化的分離的靶體細胞的半透性孔口室系統的可移植物也是本發明的目的。在本發明不同的實施方案中，這些半透性室系統用於製備體內治療內分泌、代謝或凝血紊亂的藥物構建體。
由本發明所述的幹細胞得到的靶細胞能夠另外用作體外生物反應器的細胞培養物，進行例如解毒的反應。這種形式的應用特別適合急性狀況，如急性肝功能衰竭時作為肝細胞生物反應器。
上述構建體的製備及其在相關治療過程中的實施已經在現有技術中多次記載。例如Lalan，S等人的綜述「Tissue enginearing andits potential impacton surgery」World J.Surg.251458-1466(2001)；Nasseri，B.A等人「Tissue engineeringan evolving21st-century science to provide replacement for restructionand transplantation」Surgery 130781-784(2001)以及Fuchs，J.R.等人，「Tissue engineeringa 21st century solution tosurgical reconstructran」Ann.Thorac.Surg.72577-591(2001)。
最後本發明所述的多能性幹細胞開創了轉基因修復和治療的廣闊前景。本發明優選的實施方案中，去分化可程序化幹細胞本身或者最終由它們分化得到的靶體細胞和/或靶組織被一種或多種基因轉染。這樣用於維持某些器官例如肝、腎的代謝所需的一種或多種基因被恢復和/或支持或再次導入。例如幹細胞或源自所述幹細胞的肝細胞被FAH(富馬醯乙醯乙酸水解酶)基因轉染。在FAH缺陷的小鼠模型中脾內注射1000個FAH陽性供體肝細胞，6-8周之後就足以完全遍及其肝臟，完全彌補了肝硬變導致的代謝功能損失(參見Grompe，M等人，Nat.Genet.12266 ff.(1996))。
通過「多藥抗性基因」轉染幹細胞或通過程序化幹細胞獲得的相應的靶細胞(例如造血細胞、肝細胞、卵巢細胞、肌細胞、神經細胞、神經元細胞、神經膠質細胞、軟骨細胞和骨細胞等)，在惡性疾病情況下通過重建相應的造血功能使得長期的基本化療成為可能，或者產生輻射抗性。
本發明詳細說明如下本發明所述方法的起始原料是來自於人血的單核細胞。它們優選是自體單核細胞，即來源於欲利用本發明所述的幹細胞或由其產生的靶細胞進行治療病人的血液中的單核細胞。
為了得到單核細胞，首先將經過根據已知方法用抗凝劑處理的血液分離，優選離心，得到血漿、白細胞和紅細胞。離心後血漿在上清液中，之下是含有全部白細胞的一層，這一層也被稱之為「棕黃層」。再下面含有紅細胞相(血細胞比容)。
然後利用已知方法如離心分離「棕黃層」得到單核細胞。根據優選的方法，不同的「棕黃層」包被在淋巴細胞分離介質(例如FicollHypaque)上再離心。通過進一步離心和漂洗，從血液中得到單核細胞組分(參見實施例1)。
從全血中獲得單核細胞的其他方法例如「螢光激活細胞分類術」(FACS)，「免疫磁珠分選」(參見Romani等人，J.Immunol.Methods196137-151(1996))和「磁激活細胞分類術」(MACS)或者所謂的「Rosetting法」(參見Gelig-Meyling，F等人，「Simplifiexprozedure for the separation of human Tand non-T cells」VoxSang.335-8(1977))。
根據本發明，任何分離的人血都能得到單核細胞且血液也可來源於如脾臟、淋巴結或骨髓等器官。尤其當從人血中分離單核細胞是不可能的(如在貧血或白血病情況下)或數量不足，以及在同種異體應用情況下(如在多個器官去除的構架中)，則考慮從器官中獲得單核細胞，脾臟可用作分離單核細胞的來源。
為了製備足夠量的本發明所述的幹細胞，首先必須增殖單核細胞。為此使用本發明所述包含M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)的適合單核細胞生長的培養基。M-CSF(也被稱之為CSF-1)由單核細胞、成纖維細胞和內皮細胞生成。培養基中M-CSF的濃度為2-20μg/l培養基，優選4-6μg/l，特別優選為5μg/l。
M-CSF結合到單核細胞上特異性的c-Fms受體(也稱之為CSF-1R)，該受體只存在單核細胞表面，僅與M-CSF結合(Sherr C.J等人，Cell 41(3)665-676(1985))。M-CSF和受體的特異性相互作用誘發了單核細胞的分裂，單核細胞在含有M-CSF或其類似物的培養基中培養，該M-CSF或其類似物能與受體結合而活化受體。由於沒有與c-Fms受體的親和力，不能誘導單核細胞分裂，所以其他生長因子例如GM-CSF(粒細胞-單核細胞集落刺激因子)和G-CSF(粒細胞集落刺激因子)都不適合。
該方法特別優選的實施方案是在方法的步驟b)中向細胞培養基中同時加入M-CSF和IL-3。培養基中IL-3的濃度可以為0.2-1μg/l，優選0.3-0.5μg/l，特別優選是0.4μg/l的IL-3。
但是也可以最初在步驟b)中只向培養基中加入M-CSF，隨後再加入IL-3。
進一步實施方案是培養容器中最初裝有隻包含M-CSF的細胞培養基，其在細胞分離之後就被另外包含IL-3的細胞培養基替換。
在本發明優選的實施方案中，所述方法中步驟b)中的細胞在含硫化合物如巰基化合物的存在下再培養，在該含硫化合物中至少一個烴基與硫原子相連，所述烴基被一個或多個功能基取代。巰基化合物是指含有至少一個與烴基結合的巰基(SH)的化合物。通過另外使用所述的含硫化合物能夠使來自單核細胞的細胞去分化而得到的表達一種或多種幹細胞標記CD90、CD117、CD123和CD135的幹細胞的數目增加。
所述功能基優選羥基和/或胺基。特別優選的實施方案中含硫化合物是2-巰基乙醇。進一步優選的實施方案中含硫化合物是二甲基亞碸(DMSO)。
含硫化合物的用量以硫為基準大約為4-大約200μmol/l。優選大約為100μmol/l。
當使用2-巰基乙醇時，培養基中含有大約3-大約13μl，優選約為7μl/l的2-巰基乙醇。
IL-3和任選的含硫化合物的處理可以同時或者在有M-CSF參予培養的單核細胞增殖後進行，優選增殖以及IL-3和任選的含硫化合物的處理同時進行。同時進行的增殖和去分化持續不超過10天，IL-3和任選的含硫化合物的處理時間至少為3天，最多為10天，優選為6天。
因此，根據本發明，當在同時含有M-CSF、IL-3和任選的巰基化合物的培養基中培養單核細胞時，到細胞從培養容器底部剝離為止的時間間隔為至少3天，最多10天，優選5-8天，特別優選6天。
在本發明優選的實施方案中，所述方法按以下方式進行。在步驟b)中，單核細胞最初在只含有M-CSF的培養基中增殖，在該培養基中增殖持續至少2天，優選3天，特別優選4天，最長為7天。隨後在IL-3和任選的巰基化合物存在下再培養3天。然而，優選在只含有M-CSF的培養基中最多持續4天，接下來在IL-3和任選的巰基化合物存在下培養3、4、5或6天。
如實施例2和13所述，為了使增殖和去分化同時進行，單核細胞被分離出來後轉移至含有M-CSF、IL-3和任選的含硫化合物特別是2-巰基乙醇或DMSO的培養基中。
由於其具有吸附特性，在製備過程中單核細胞和來自於它們的幹細胞貼附於與各自培養容器的底部。根據本發明優選的實施方案，在步驟c)之後培養基與貼附於培養容器的底部的細胞分離後被棄去。優選隨後用培養基漂洗貼附於底部的細胞，然後用新鮮培養基覆蓋細胞(參見實施例13)。
在該步驟中上述增殖和去分化培養基可以被用作培養基，例如標準細胞培養基RPMI也可用作培養基。
根據本發明進一步優選的實施方案，為了提高生產過程最後在培養基中自由漂浮的幹細胞的數目，可在步驟c)的最後和步驟d)之前將細胞與生物學上良好耐受的有機溶劑接觸。溶劑的用量為10μl-1ml。該溶劑優選為含1-4個碳原子的醇，特別優選加入乙醇。根據本發明特別優選的實施方案，將細胞與前面定義的生物學上可良好耐受的有機溶劑蒸汽相接觸，優選乙醇蒸汽(參見實施例2)。與有機溶劑優選乙醇蒸汽接觸的時間為4-12小時，優選8-10小時。
本發明所述的方法優選在其表面預先塗覆有胎牛血清(FCS)的培養容器中進行(參見實施例2)。也可以選擇使用男性供體的AB血清。用FCS的覆蓋實施如下使用前用FCS覆蓋培養容器的表面，且在幾個小時、特別為2-12小時，特別優選7個小時的接觸時間後，用適當的方法去除沒有粘附在表面的FCS。
如果在步驟c)之後，任選在換培養基之後，進行有機溶劑處理，在這個步驟中細胞已經一定程度上從底部剝離。(進一步)剝離可以用機械方法完成，例如使用精良的細胞刮棒，刮片或吸管尖(參見實施例13)。
根據本發明方法優選的實施方案，在適當的酶例如胰蛋白酶的作用下完成完全的剝離(參見實施例2)。將細胞與胰蛋白酶溶液(0.1-0.025g/l，優選0.05g/l)在35-39℃，優選37℃下在二氧化碳存在下接觸2-10分鐘。
然後通過標準的方法抑制胰蛋白酶的活性，此時利用標準方法，例如離心和在一個實施方案中在步驟d)的最後在適宜的培養基中將其懸浮，可以獲得自由漂浮的去分化程序化幹細胞。它們懸浮於適宜的培養基例如RPMI1640或DMEM中，能夠立即分化成希望的靶細胞。但是它們也能夠在培養基中保存幾天。在優選的實施方案中，如果欲將細胞作為去分化的可程序化幹細胞貯存在培養基中超過約48小時，則培養基中應含有細胞因子或LIF因子(白血病抑制因子)，參見Nature 41494(2001，Donovan，P.JGearhardt，J在上述引文中)。在包含這些因子的培養基中幹細胞能夠作為去分化程序化幹細胞保持至少10天。
在優選的實施方案中，為了長期貯存，細胞懸浮在液體培養基中，然後深度冷凍。活細胞深度冷凍的技術是現有技術中已知的，參見Griffith M等人「Epithelial Cell Culture，Cornea，inMethods of Tissue Engineering」，Atala ALanza R.P Academic Press2002，第4章第131-140頁。優選的用於本發明幹細胞深度冷凍的懸浮培養基是含FCS的DMEM，參見實施例2。
參考如下實施例進一步解釋和說明本發明。
如果在實施例中沒有進一步限定，所用的培養基和物質的組成如下1.青黴素/鏈黴素溶液每毫升生理氯化鈉溶劑(0.9％的NaCl)中10,000單位作為青黴素G鈉鹽的青黴素和1000μg作為硫酸鏈黴素的鏈黴素。
2.胰蛋白酶-EDTA每升含0.5g胰蛋白酶和0.2gEDTA(4Na)3.胰島素約28單位/mg的產生自大腸桿菌(E.coli)的人重組胰島素4.含L-穀氨醯胺的RPMI 1640(1x，液體(11875))RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養基1640是廣泛用於哺乳動物細胞的營養培養基。
參見Moore G.E.等人，J.A.M.A.199519(1967)
5.PBS(Dulbecco磷酸鹽緩衝液)參見J.Exp.Med.98167(1954)
6.2-巰基乙醇合成質量；含量＞98％，密度1.115-1.116，參見如Momo J.等人，J.Am.Chem.Soc.734961(1951)。
7.Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離培養基(蔗糖/表氯醇共聚合產物，Mg 400,000；密度1.077，泛影酸鈉調節)8.視黃酸1.5ml的PBS溶液中含有300μl維生素A酸(C20H28O2)，其相應的濃度為1mM。當用作神經元和神經膠質細胞的程序化培養基時，10ml培養基中含有150μl維生素A酸(相應濃度為10-6M)。
9.DMEMDulbecco改性的Eagle培養基(高葡萄糖)參見Dulbecco，R.等人，Virology 8396(1959)；Smith，J.D.等人，Virology12158(1960)；Tissue Culture StandardsCommittee，In Vitre，62(1993)10.L-穀氨醯胺液體29.2mg/ml11.II型膠原酶參見Rodbell，M.等人，J.Biol.Chem.239375(1964).
12.白細胞介素-3(IL-3)來源於大腸桿菌的重組人白介素(Yang Y.C.等人，Cell4710(1986))，其中所含的包括成熟IL-3的133個胺基酸殘基和包括甲硫氨醯形式的134個胺基酸殘基的比例約為1∶2；計算分子量約為17.5kD，特異性活性1×103U/μg(RD目錄No.203-IL)13.巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)來源於大腸桿菌的重組人M-CSF，其中含有包括N-末端甲硫氨酸的135個胺基酸殘基的單體(18.5KD)，它是以分子量為37kD同型二聚體存在(SIGMA目錄No.M6518)。
14.抗體實施例中應用的抗CD14、CD31、CD90、CD117、CD123、CD135抗原的抗體都是商業上可以得到的。它們從下列來源得到CD14DAKO，單克隆小鼠抗人CD14、單核細胞、克隆TK4，代碼為M0825，Lot 036 Edition 02.02.01；CD31PharMingen International，單克隆小鼠抗大鼠CD31(PECAM-1)，克隆TLD-3A12，目錄編號22711D，0.5mg；CD90Biozol Diagnostica，Serotec，小鼠抗人CDw90克隆No.F15-42-1，MCAP90，批號0699；CD117DAKO，單克隆小鼠抗人CD117，c-kit，克隆號104D2，代碼No.M 7140，Lot 016，Edition 04.05.00；CD123Research Diagnostics Inc.小鼠抗人CD123抗體，克隆9F5，目錄號RDI-CD123-9F5；CD135Serotec，小鼠抗人CD135，MCA1843，克隆號BV10A4H2實施例1從全血液中分離單核細胞為了避免血液凝固和為了飼養細胞，在一個3室帶狀裝置中將450ml全血和63ml穩定溶液混合。該穩定溶液組成為每升水中含有3.27g檸檬酸，26.3g檸檬酸三鈉鹽，25.5g右旋糖和22.22g二羥基磷酸鈉鹽。溶液的pH值為5.6-5.8。
上述混合物在20℃以4000rpm條件下「高速離心」7分鐘以分離血液中的成分。結果形成了3層顆粒和非顆粒成分。通過將帶狀裝置接入為此目的提供的一個加壓機器上，把紅血球壓入下層的袋中，把血漿壓入上層袋中，「為此目的提供的棕黃層」保留在中間袋中，其體積約為50ml。
將50ml新鮮製備的「棕黃層」分成每份25ml的2份，將每份以25ml的事先加入到2個50ml的Falcon試管中Ficoll-Hypaque分離介質覆蓋。
將該混合液在2500rpm下不間斷離心30分鐘。之後，紅細胞和死細胞仍然留在Ficoll相下面的「棕黃層」中，而白細胞包括單核細胞被分離出來，形成在Ficoll上的白色界面。
將單核細胞的白色界面小心的吸出並用10ml磷酸鹽緩衝液(PBS)混合。
然後將混合物在1800rpm下有間斷地離心3次，每次10分鐘；每次離心後將上清液吸出，離心管中裝滿新鮮的PBS。
離心管(Falcon試管)底部收集的沉澱含有單核細胞組分，即單核細胞。
實施例2單核細胞的增殖和去分化單核細胞的培養和增殖和細胞去分化都是在具有下列組成的營養培養基中一步完成的
營養培養基還含有2.5ug/500ml的M-CSF和0.2ug/500ml的白細胞介素-3(IL-3)。
將實施例1中分離的單核細胞轉移到一個6孔板上的5個孔中(每孔直徑為30毫米)，每次每個孔中的加入量約105個細胞。在每個孔中用2毫升上述營養培養基填滿。該6孔板事先用純的滅活的FCS裝滿，約7小時後將胎牛血清輕輕倒出，由此得到FCS包被的6孔板。每孔中的精確劑量的細胞數目可根據一個已知的方法來確定，參見Hay R.J「Cell Quantification and Characterisation」in Methods of Tissue Enginearing，Academic Press 2002，第4章，第55-84頁。
蓋上6孔板的蓋子在37℃培養箱中放置6天。細胞在24小時後沉到孔的底部。每隔一天吸去上清液，將6孔板的每一個孔再次裝滿2ml新鮮的營養培養基。
在第六天，將2毫升70％乙醇加入到6孔板中未使用的第6個孔中，蓋上6孔板的蓋子在37℃培養箱中繼續培養10個小時。
接著，在6孔板中含有細胞的每一個孔中用吸管加入1毫升用PBS以1∶10稀釋的胰蛋白酶溶液。蓋上6孔板在5％CO2培養箱中37℃下放置5分鐘。
之後在6孔板的每個孔中加入2毫升RPMI 1640培養基阻斷胰蛋白酶的活性。將每個孔的所有上清液(1毫升胰蛋白酶+2毫升培養基)吸出，收集到一個15ml的Falcon管中，在1800rpm下離心10分鐘。棄去上清液，沉澱用新鮮的RPMI 1640培養基混合(2毫升/105細胞)。
該細胞懸液可直接用來分化成不同的靶細胞。
或者，在離心棄去含胰蛋白酶的上清液後，細胞和作為冷凍培養基的DMSO/FCS混合，在106個/ml的濃度下深度冷凍。
冷凍培養基中含95％的FCS和5％的DMSO。每次約106個細胞置於1ml培養基中按照下述的步驟冷卻冰浴30分鐘；在-20℃下於預冷的發泡聚苯乙烯(Styropor)盒中放置2小時；在-80℃下於發泡聚苯乙烯(Styropor)盒中放置24小時；在-180℃下於液氮(N2)中的試管中貯藏。
為了現察根據上述方法得到的來源於單核細胞的去分化的可程序化幹細胞的群體的免疫組織化學表型，每次取105個細胞並在載玻片上固定為細胞離心塗片器(cytospin)製劑以用於進一步組織化學染色(Watson，P.「A slide centrifuge；an apparatus forconcentrating cells in suspension on a microscope slide」J.Lab.Clin.Med 68494-501(1966))。之後可利用Cordell，J.L等人(文獻見下)描述的應用APAAP紅色複合物的技術對細胞進行染色。如果沒有另外指出，加入的一抗是用PBS以1∶100稀釋的，每次實驗中使用200μl該濃度的抗體。作為一抗使用的單克隆抗體抗如表1所列的細胞抗原表位。圖6顯示染色的細胞離心塗片器製劑和相應的幹細胞標記物CD90，CD117，CD123和CD135的證據。
和染色技術有關的文獻Cordell J.L.，et al.″Immunoenzymatic labeling of monoclonalantibodies using immune complexes of alkaline phosphatase andmonoclonal anti-alkaline phosphatase(APAAP complexes).″J.Histochem.Cytochem.32219-229(1984).
和標記物有關的文獻CD14Ferrero E.，Goyert S.M.″Nucleotide sequence of the gene enco-ding the monocyte differentiation antigen，CD14″Nucleic AcidsRes.164173-4173(1988).
CD31Newman P.J.，Berndt M.C.，Gorski J.，White J.C.II，Lyman S.，Paddock C.，Muller W.A.″PECAM-1(CD31)cloning and relation toadhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily″Science 2471219-1222(1990).
CD90Seki T.，Spurr N.，Obata F.，Goyert S.，Goodfellow P.，SilverJ.″The human thy-1 genestructure and chromosomal location″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826657-6661(1985).
CD117Yarden Y.，Kuang W.-J.，Yang-Feng T.，Coussels L.，MunemitsuS.，Dull T.J.，Chen E.，Schlessinger J.，Francke U.，UllrichA.″Human proto-oncogene c-kita new cell surface receptortyrosine kinase for an unidentified ligand.″EMBO J.63341-3351(1987).
CD123Kitamura T.，Sato N.，Arai K.，Miyajima A.″expression cloningof the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunitfor the human IL-3 and GM-CSF receptors.″Cell 66165-1174(1991).
CD135Small D.，Levenstein M.，Kim E.，Carow C.，Amn S.，RockwellP.，Witte L.，Burrow C.，Ratajazak M.Z.，Gewirtz A.M.，CivinC.I.
″STK-1，the human homolog of Flk-2/Flt-3，is selectivelyexpressed in CD34+human bone marrow cells and is involved inthe proli feration of early progenitor/stem cells.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91459-463(1994).
表1本發明所述幹細胞抗原的表述
所示分級對應於檢測到的抗原陽性程度。單核細胞在相應的特定培養基中培養4-9天後，反應變明顯。然後，將各自的細胞離心塗片器在顯微鏡下與陰性對照(沒有一抗時的染色)對比。
+細胞和一抗有清晰的顏色反應；++細胞和一抗有強烈的顏色反應。
僅對有70％以上的具有典型的幹細胞形態(參見圖6)的活細胞的細胞離心塗片器製劑進行估計。其中只有不足1％的細胞表達了CD34抗原。
實施例3由成體幹細胞製備神經元和神經膠質細胞神經元和神經膠質細胞的製備是在一個直徑為100mm的培養皿中進行的。為準備培養皿，在每個培養皿中加入5mm純的滅活的胎牛血清(FCS)以包被培養皿底部。7小時後將沒有粘附於培養皿底部的FCS部分吸出。將約106個根據實施例2製備的細胞加入到一個上述方法準備的培養皿中，並加入10ml如下列組成的營養培養基
營養培養基中還含有1×10-6M/500ml的視黃酸。
用來製備神經元和神經膠質細胞的幹細胞在10天內發生再程序化/分化，這期間約每3天換培養基。此後，細胞大多數貼附於培養皿的底部，可以通過和以前對幹細胞的描述中的類似的方式用簡單的胰蛋白酶消化作用，將其從平皿的底部剝離下來。
實施例4神經元前體細胞，神經元和神經膠質細胞的證明為了以後對由去分化的可程序化幹細胞生成的靶細胞進行免疫組織化學特徵分析，將從單核細胞生成的幹細胞加至蓋玻片(20mm×20mm)上(105個細胞/蓋玻片)，將玻璃蓋放置於6孔板的底部(每孔直徑為30mm)，加入營養培養基(每孔2ml)培養。在幹細胞分化成各自的靶細胞後，用下列方法將其固定移去營養培養基(上清液)後，加入2ml甲醇固定培養的靶細胞，甲醇的的作用時間超過10分鐘。隨後吸出乙醇，用PBS(每次2毫升)衝洗孔板2次。之後根據Cordell，J.L.等人「Immunoenzymatic labelingmonoclonal antibodies using immune complexes of alkalinephosphatase and monodonal artiralkaline phosphatase(APAAPcomplexes)」J.Histochem.Cytochem.32219-229(1994)中所描述的技術，用APAAP紅色複合體將細胞染色。除非另有說明，所加的一抗是用PBS以1∶100的比例稀釋的，每次6個孔的每1個中吸入200μl該濃度的抗體。
神經元前體細胞可以通過用抗S100-抗原的抗體進行染色來檢測，參見
圖1中的中間圖(×200)。
神經元是通過突觸泡蛋白MAP2(微管相關蛋白2)或具有相應的特異性抗體(一抗用PBS以1∶300的比例稀釋)的神經絲68的特定表達來檢測的，圖1右圖，×200。
神經膠質細胞例如星形膠質細胞是通過檢測GFAP(膠質原纖維相關蛋白)(一抗用PBS以1∶200的比例稀釋)來確定的，圖1左圖，×200。
根據如Carmiols「Cell lsolation and Selection」Methods ofTissue Engineering，Academic Press 2002，第2章，第19-35頁中記載的方法，利用特異性抗MAP2(神經元)或GFAP(神經膠質細胞)的抗體，通過MACS(磁激活細胞分選)的方式來分離神經元和神經膠質細胞。
通過染色可見的細胞的類型如圖1所示。
實施例5由來源於單核細胞的去分化的可程序化的成體幹細胞製備內皮細胞Matrigel(Beckton and Dickinson，Heidelberg，DE)被用作培養內皮細胞基質。這種基質由纖維結合素，層粘連蛋白和膠原I和IV組成。
冷凍的基質在4℃冰箱中經過12小時的時間緩慢融化。在此期間它的狀態發生變化，即原先固態的基質變為海綿狀/液體狀。將這種狀態下的基質加入到一個48孔板(每孔直徑為10mm)使得每個孔的底部都被覆蓋。
此後，此孔板在室溫下放置30分鐘，直到凝膠在底部凝固成粘附層。
緊接著，每孔加入約1×102個細胞，並加入營養培養基在Matrigel上進行培養(如實施例2所述)。
4-5天以後第一個管狀的細胞鏈出現了，其在6-8天後發展成3維的細胞網絡。通過各自的特異一抗(每次200μl，用PBS以1∶100的比例稀釋)可以鑑定在細胞上的內皮標記物CD31和因子VIII。
另一種方法是將液態的基質加入到一個血管假器官中，然後用實施例2所述的去分化的可程序化的成體幹細胞將其包被。約6天後可以鑑定到一大片內皮細胞以環狀的方式包被在假器官上。
如圖2所示，通過用相應的內皮特異性抗體(見上)進行染色可以顯示出內皮細胞。中間的圖顯示的是在Matrigel上培養5天後的細胞。第一個管狀的鏈將單個細胞聚集組合。深棕色標記的細胞表達CD31抗原(用黃色濾光片，經200倍放大)。8天後三維的網絡結構開始慢慢形成(抗-CD31-抗原染色，黃色濾光片經200倍放大)。12天後在Matrigel上培養的新分化的CD31+細胞形成一個容器狀的具有著多層壁結構的三維管，形態學上使人聯想到一個容器。經檢測，現在幾乎所有細胞都表達CD31抗原(CD31染色，藍色濾光片，經400倍放大)，如右圖所示。
實施例6脂肪細胞的製備A為了將實施例2中所述成體幹細胞程序化/分化成脂肪細胞，首先要製備一種條件化培養基。為此，將20克自體的脂肪組織，即來自於同一人供體的脂肪組織且在該供體的血液中也可生成單核細胞，用如下方法處理首先脂肪組織在一個培養皿中壓碎，然後將破碎的組織碎片過篩(孔徑100μm)。
然後將上述方法得到的懸浮液轉移至一直徑為100mm的培養皿中，加入10ml含有30mg的II型膠原酶的DMEM培養基。將此混合物在室溫下(22℃±2℃)放置大約60分鐘以使膠原酶作用於脂肪細胞。
緊接著將混合物轉移至一個50毫升的Falcon管中，將此管在1800rpm下離心10分鐘。
離心後棄去上清液，將由脂肪細胞和前體細胞組成的細胞沉澱轉入裝有8ml下述組成的培養基中，並在培養皿(直徑為100mm)中，在37℃培養箱中培養10天。
胰島素溶液含有溶解於2ml醋酸水溶液(由40ml水和0.4ml冰醋酸組成)中的18mg的胰島素(Sigma 1-0259)。此溶液經醋酸水溶液以1∶10比例稀釋。
在10天的培養期間，脂肪細胞條件化培養基(FCCM)形成上清液。每種情形中2-4天後用新鮮的培養基替換該上清液。將每次更換培養基所獲得的FCCM經過無菌過濾後在-20℃保存。接著將10ml上述的FCCM和約106個實施例2所述的幹細胞一起加入到一個培養皿(直徑為100mm)中。4天後就可見包含脂肪小體的初始前體細胞(圖3A)。6天後出現可被蘇丹紅染色的單個脂肪細胞(圖3B和C)。10天後這些細胞出現典型的聚集並形成叢，在該步驟，肉眼已可將其看作脂肪細胞(圖3D)。
如圖3A-3D所示，染色使得脂肪細胞可以看見，這樣就與對照3E和3F有著十分明顯的區別圖3E顯示來源於單核細胞在營養培養基(如實施例2所述)中培養6天的細胞，營養培養基未加IL-3和2-巰基乙醇。其中隨後加入了FCCM。這些細胞不能分化成脂肪細胞。圖F顯示的是在完全培養基(見實施例2)中培養6天，然後繼續在營養培養基中而不是FCCM(見實施例2)中培養6天的細胞。FCCM含有給脂肪細胞分化提供信號所需的組分。
如圖3A，B，C，D細胞的蘇丹紅染色是根據Patrick Jr C.W等人「Epithelial cell Culturereast」，in Methods of TissueEngineering，Academic Press 2002，第4章，第141-149頁中所描述的方法進行的。
B除了通過用蘇丹紅染色來鑑別脂肪細胞的表型以外，也可以在mRNA水平上對脂肪細胞進行分子生物學特徵的鑑別，來檢查脂肪細胞的遺傳編碼是否在使用脂肪細胞條件化培養基培養而進行相應的程序化之後經歷了相應改變，以及來檢查從可程序化的單核細胞中程序化得到的脂肪細胞中是否可以鑑定所述脂肪細胞特有的供使核糖核酸(mRNA)轉錄物。通過聚合酶鏈式反應(PCR)的方法由分離出的RNA樣品擴增出脂肪細胞代謝的兩個特有的mRNA序列，此RNA樣品是從來源於單核細胞的去分化的可程序化的幹細胞中分離得到的，該mRNA在平行實驗混合物中由已程序化的脂肪細胞中擴增到，分別稱為「過氧化物酶體增殖活化受體γ」(PPARG)-mRNA(Tontonoz，P等人「Stimulation of adipogenesis in fibroblaots by PPARgamma 2，a lipid-activated transcription factor」Cell 791147-1156(1994)，基因庫查詢號NM-005037)和「瘦素(肥胖同系物，小鼠)」-mRNA(Zhang Y等人「Positional cloming of themouse obese gene and its human homologue」Nature 372425-432(1994)，基因庫查詢號NM-000320)。
為此需要進行的RNA分離、逆轉錄法和目標mRNA序列的PCR擴增條件的選擇根據現有技術的詳細記載進行，參見Ungefroren H等人，「Human pancreat ic adenocarcinomas express Fas and Fasligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosi」，CancerRes.581741-1749(1998)。
為此選擇的引發PCR擴增的各種引物要能使正向-和反向引物結合到mRNA序列上，該mRNA序列的染色體基因的同源區位於兩個不同的外顯子上，其相互被一個大的內含子分開。這樣可以確保從細胞中包含的mRNA獲得碎片而不是由染色體DNA中存在的序列進行擴增。特別優選下述的用於PPAR-γ和瘦素的引物序列PPAR-γ正向引物；265-288(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物487-465(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為487-265bp＝223bp的擴增碎片，見圖3G。圖3G進一步表明在可程序化幹細胞和腫瘤細胞系HL-60(人早幼白血病細胞系)中已鑑定了痕量轉錄的PPAR-γ特異性mRNA，儘管其比脂肪細胞本身的信號帶明顯窄得多。不同的是，通過逆轉錄酶PCR在mRNA的水平上只能在由可程序幹細胞生成的脂肪細胞中檢測到脂肪細胞特異性蛋白瘦素。
可程序化幹細胞(progr.Stem cell)作為對照，人腫瘤細胞系HL-60、Panc-1和WI-38不轉錄瘦素。作為陰性對照的沒有加入逆轉錄酶(脂肪細胞/-RT)的所有樣品和水的樣品同時進行測定。通過測定陽性對照中的GAPDH「看家」基因，可以確保PCR擴增步驟在每個混合物中是正常進行的。
實施例7肝臟細胞(肝細胞)的製備A為使實施例2所述的來源於單核細胞的去分化的可程序化幹細胞程序化生成肝細胞，首先要製備條件化培養基。因此將40g人肝臟組織進行如下處理。
首先將肝臟組織在PBS中漂洗幾次，基本上去除紅細胞。然後在培養皿中將組織壓碎，再在室溫下與分離溶液一起培養約45分鐘。分離溶液由40mlPBS(磷酸鹽緩衝液)，10ml用PBS按1∶10稀釋的胰蛋白酶溶液和30mlII型膠原酶(Rodbel M等人J.Biol.Chem.239375(1964))組成。培養45分鐘之後將組織碎片過篩(參見實施例6)。
然後將混合物轉入50ml的Falcon管中，加入PBS至50ml，1800rpm下離心10分鐘。
離心後棄去上清液，含有肝細胞的細胞沉澱再用50ml的PBS漂洗、離心。再次棄去形成的上清液，將細胞沉澱引入25ml如下組成的培養基中，在細胞培養瓶(體積為250ml)中在37℃培養箱培養10天。
肝細胞生長培養基
營養培養基另外含有5μg(10ng/ml)的表皮生長因子(Pascall，I.C.等人，J.Mol.Endocrinol.12313(1994))。胰島素溶液的組成如實施例6所述。
在持續10天的培養期間，肝臟細胞條件化培養基(LCCM)形成了上清液。2-4天後分別用新鮮的營養培養基取代上清液。每次換培養基時得到每批LCCM都要經過無菌過濾(0.2μm孔徑的膜過濾)後-20℃下貯存。
然後將1×106個去分化的幹細胞在裝有10ml如下組成的培養基的培養皿(直徑100mm)或培養瓶中培養。
肝細胞分化培養基
肝細胞生長因子(Kobayashi，Y.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2207(1996))的使用濃度為40ng/ml。幾天以後可以觀察到趨向扁平的、多角形的單倍體或二倍體細胞的形態學改變(圖4A)。10-12天以後，可以通過免疫組織化學檢測肝特異性抗原α-胎蛋白來鑑定來源於去分化的幹細胞的肝細胞(Jacobsen，G.K.等人，Am.J.Surg.Pathol.5257-66(1981))，如圖4B和4C所示。
B為了檢查在使用肝細胞條件化培養基進行相應的程序化之後幹細胞的基因編碼是否產生相應的變化，以及作為由本發明的幹細胞生成的肝細胞的肝細胞特有的信使核糖核酸轉錄物是否可被鑑定，除了通過α-胎蛋白的免疫組織化學鑑定肝細胞的表型之外，還要進行mRNA水平的肝細胞的分子生物學特徵的鑑定。因此在來源於單核細胞的去分化的可程序化幹細胞中，以及在平行試驗的樣品中，在來源於幹細胞程序化得到的肝細胞中，通過分離的RNA樣品的聚合酶鏈反應(PCR)方法來檢測5種不同的肝細胞特有mRNA序列的存在。具體而言，這是智人(Homo Sapiens)白蛋白mRNA(Lawn，R.M等人「The sequence of human seum a16umin cDNA and HSexpression in E.coli」Nucleic Acids Res.96103-6114，(1981)，基因庫查詢代號MM-000477)、α-胎蛋白mRNA(Morinaga T等人「Primary Stractures of human alpha-fefoprotein and the mRNA」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804604-4608(1983)，基因庫查詢代號V01514)、人氨甲醯磷酸合成酶I的mRNA(Haraguchi，Y等人「Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamylphosphate syathetasermolecular analysis ofhyperamoronemin」Gene 107335-340(1991)，基因庫查詢代號D90282)、智人凝血因子II(凝血酶，F2)mRNA(Degen，S.J.等人「Characterization of the complementary deoxyribonucleicacid and gene coding for human prothrom 6in」Biochemistry 222087-2097(1983)，基因庫查詢代號NM-000506)、智人凝血因子VII(血清凝血酶原轉變加速因子，F7)mRNA(NCBI AnnotationProject.Direct Submission，2002年2月6日，國家生物科技信息中心，NIH，Bethesda，MD 20894，美國，基因庫查詢代號XM-027508)。
根據現有技術中詳細記載，進行逆轉錄酶方法所必需的RNA分離和選擇目標mRNA序列的PCR擴增的條件，參見Ungefroren H等人，「Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligandyet are resistant to Fas-mediated apoptosis」Cancer Res.581741-1749(1998)。
選用的PCR擴增的各種引物要能使正向和反向引物結合到mRNA序列上，該mRNA序列在染色體基因上的同源區位於兩個不同的外顯子中，其相互被一個大的內含子彼此分開。由此確保從細胞中包含的mRNA獲得碎片而不是由染色體DNA中存在的序列進行擴增。
引物序列的選擇如下所示；各種PCR分析的結果在圖40中再現。本發明的去分化的可程序化幹細胞稱為「pror.stem cell」，由其程序化得到的肝細胞成為「pror.hepatocyte」。
α胎蛋白正向引物1458-1478(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1758-1735(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1758-1458bp＝391bp的擴增碎片，見圖4D。
如圖4所示，本身不具有可識別的α胎蛋白的特異性mRNA轉錄物的程序化幹細胞(pror.stem cell)能夠被程序化為含有這種mRNA轉錄物(分子量為301bp的陽性帶)的肝細胞(pror.hepatocyte)。這也解釋了圖4B和4C所示的α胎蛋白免疫組織化學的檢測結果。陽性對照稱為人肝臟組織，肝腫瘤細胞系HepG2也轉錄α胎蛋白mRNA，由301bp的帶確認。
白蛋白正向引物1450-1473(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1868-1844(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1868-1450bp＝419bp的擴增碎片，見圖4D。
圖4D顯示了在可程序化幹細胞中已有的痕量轉錄的白蛋白特異性mRNA，同時都作為陽性對照的由幹細胞程序化獲得的肝細胞、正常肝組織以及肝腫瘤細胞系HepG2的肝細胞都大量表達mRNA，可以看見清晰的譜帶。
氨甲醯磷酸合成酶I正向引物3135-3157(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物46 35-4613(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為4635-3135bp＝1500bp的擴增碎片，見圖4D。
氨甲醯磷酸合成酶I是肝細胞的特異性酶，其在「尿素循環」中尿素的代謝中發揮重要作用。這種解毒作用由活性的肝細胞保證。如圖4D所示，對於從可程序化幹細胞得到的肝細胞和陽性對照(人肝臟組織和HepG2腫瘤細胞系)都可以看到氨甲醯磷酸合成酶I的特異性mRNA帶(1500bp)。程序化的肝細胞(pror.hepatocyte)mRNA條帶的一定程度上較弱的表這是由於培養皿中缺乏可用的底物。
凝血因子II正向引物1458-1481(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1901-1877(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1901-1458bp＝565bp的擴增碎片，見圖4D。
同樣的如圖4D所示，這種肝細胞特異性蛋白僅能在程序化的肝細胞(pror.hepatocyte)和來自人肝臟組織的陽性對照中在mRNA水平上以444bp條帶的表述檢測到，而可程序化幹細胞(pror.stemcell)並不顯示出這個帶，即基因不在那裡轉錄。
凝血因子VII正向引物725-747(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1289-1268(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1289-725bp＝444bp的擴增碎片，見圖4D。
與凝血因子II的情形相同，這種蛋白僅在程序化的肝細胞(pror.hepatocyte)和陽性對照(人肝臟組織)中轉錄(見656bp的帶)，儘管弱於凝血因子II。可程序化幹細胞和陰性對照(水)都不顯示該特異性mRNA帶。
甘油醛脫氫酶這種基因也稱之為「看家基因」，能夠在每個真核細胞中檢測到，被作為PCR擴增是否在所有樣品中正常進行的對照。它同時進行測定，並且由加入的確定量的來自各種細胞樣品的RNA得來。
作為陰性對照樣品的水同時在所有的檢測中共同測定。如果DNA不汙染水，在PCR中就沒有擴增，也不會檢測到條帶(以此作為反對照)。
實施例8皮膚細胞(角質細胞)的製備為了使實施例2所述單核細胞源的去分化的可程序化幹細胞在皮膚細胞中程序化，首先應製備一種條件化培養基。為此1-2cm2完整的人皮膚作如下處理。
首先將皮膚原料在無菌條件下去除皮下組織。然後將該組織在劇烈振蕩的無菌容器中用總計10×的PBS洗滌。洗滌二次之後，再次去除組織中連接著的有區別的組織殘渣。
再將皮膚原料置於直徑60mm的培養皿，混入3ml的按1∶10的比例用PBS稀釋的胰蛋白酶溶液，再將其切成小塊(約0.5-1mm3)。隨後，再向混合物中加入3ml用PBS接1∶100的比例稀釋的胰蛋白酶溶液，混合物在37℃下間歇振蕩培養。
然後使較大的顆粒沉澱，倒出包含角質細胞的上清液，在800rpm下離心5分鐘。這時吸出得到的上清液，將細胞沉澱置於3ml如下組成的培養基中，在37℃的培養箱中在培養皿(直徑100mm)中培養15天。
角質細胞生長培養基
營養培養基中包含5μg的表皮生長因子(參見實施例7的精確說明)和5mg的氫化可的松(參考Merck索引12，4828)。
在15天的培養期間，角質細胞條件化培養基KCCM形成上清液。每種情形中2-4天後用新鮮的營養培養基取代上清液。將每次換培養基得到的KCCM過濾除菌在-20℃下貯存。
然後，在培養皿(直徑100mm)或培養瓶中用10ml如下組成的培養基培養1×106去分化幹細胞。
角質細胞分化培養基
如Finch等人，Gastroenterology 110441(1996)中所述，角質細胞生長因子的使用濃度為25ng/ml。
幾天後可以觀察到細胞出現形態學上的變化。6天之後能夠檢測到角質細胞特異性抗原，即與使用的一抗都能夠結合的細胞角蛋白5和6(見圖5A)(Exp.Cell.Res.162114(1986))。10天之後培養基中較大的細胞個體開始粘著，這樣就能夠看到聚集在一起的細胞形成的可見細胞組織(圖5B)。
實施例9由分化的程序化幹細胞製備胰島素產生性細胞胰島素產生性細胞的製備是在體積約250ml和平壁的培養瓶(T75細胞培養瓶)中進行的。根據實施例13製備的約5×106的細胞懸浮在約5ml的如下所述的培養基(胰島素產生性細胞分化培養基)中，當其被引入培養瓶後，進一步與15ml的培養基混合。為了使細胞去分化，須將培養瓶在37℃和5％CO2，水平放置在培養箱中培養。
培養基(根據Rameya V.K.等人，Nature Medicine，6(3)，278-282(2000)改良的)
營養培養基還包含量為10ng/ml的表皮生長因子和量為20ng/ml的肝細胞生長因子。
在第一個小時中，細胞貼附於培養容器的底部。幹細胞的分化根據胰島素的產生進行監控。為此在間隔約2-3天後要改變培養基，每次收集細胞上清液，並於-20℃下冷凍。貼附於培養瓶底部的細胞可通過實施例2中所述的胰蛋白酶作用而被剝離。
不同分化時間收集到的上清液中胰島素含量可通過用於測定人胰島素的ELISA法(酶聯免疫吸附測定法)測定(Bruhn D.H FlschU.R.(Eds)，Lehrbuch der LabormedizinGrundlagen，Diagnostik，Klinik Pathobiochemie[Textbook of Laboratory Medicine，Principles，Diagnosis，Clinical Pathobiochemistry](1999)，189頁)，並與培養基的空白讀數進行比較。圖8中重複的結果表明培養至14天，細胞胰島素產量達到最大值。處在分化處理過程中的細胞產生的胰島素的含量14天之後增加到3μU/ml，而在對照組中沒有檢測到人胰島素。圖8中的柱狀圖形分別代表三個各自獨立的試驗每次確定的三個獨立的數值。
在確定分化成本發明所述胰島素產生性細胞的去程序化幹細胞的胰島素的含量之後，進而要確定去分化進行3周之後仍然能夠表達單核細胞特異性表面抗原CD14的產生胰島素的細胞的比例。結果發現，3周以後有很大比例(約30-40％)的這些細胞上都檢測到了單核細胞特異性抗原CD14。
實施例10由去分化可程序化幹細胞製備肝細胞的可選擇的方法如實施例7中所述，作為使用肝細胞條件化培養基(LCCM)的替代，幹細胞在下述營養培養基(Ha)中被誘導分化成肝細胞。來源於幹細胞的肝細胞的製備在體積約250ml和平壁的培養瓶(T75細胞培養瓶)中進行。根據實施例13製備的約5×106的細胞被引入約5ml的如下面所述的改良培養基(Ha，肝細胞分化培養基)中，當其被引入培養瓶中之後，進一步與15ml的培養基混合。為了細胞去分化，須將培養瓶在37℃和5％CO2的培養箱中水平放置培養。
肝細胞分化培養基(Ha)(根據Schwarz等人，「Multipotentadult progenitor cells from 6one marrow differentiae intofunctional nepatodyte-like cells」，J.Clin.Invest.10(109)，1291-1302(2002))
營養培養基中還含有量為3ng/ml的成纖維細胞生長因子(FGF-4)。
在第一個小時之內細胞貼附於培養容器底部。根據白蛋白產生來監控幹細胞的分化。為此約間隔2-3天換培養基，每次收集的細胞上清液在-20℃下冷凍。貼附於培養瓶底部的細胞可用實施例2中所述的胰蛋白酶作用進行剝離。
不同時間收集到的上清液中白蛋白含量可通過用於測定人白蛋白的ELISA法(酶聯免疫吸附測定法)測定(根據BethylLaboratories Inc.的規程和Schwarz等人，在上述引文中)，並與培養基的空白讀數進行比較。圖9的結果顯示培養14-28天期間細胞的白蛋白生產保持大致恆定。分別在相對於加入Ha培養基的時間的第0(培養基的空白讀數)、14、21、28和30天進行檢測。每次檢測結果分別為5ng/ml、450ng/ml、425ng/ml、440ng/ml和165ng/ml。圖9中的柱狀圖形分別代表三個各自獨立的試驗每次確定的三個獨立的數值。
實施例11來源於去分化幹細胞的肝細胞中共表述的白蛋白和單核細胞特異性抗原CD14的測定在來源於去分化幹細胞的肝細胞中共表達的白蛋白和單核細胞特異性抗原CD14的測定一方面是通過雙重染色(A)，另一方面是通過FACS分析(B)進行的。
A)將根據實施例10所述的本發明所述分化成肝細胞的幹細胞在6孔板中的蓋玻片上培養，並按照實施例4所述用甲醇固定。為了檢測同時表達的抗原CD14(單核細胞表型標記)和白蛋白(肝特異性標記)要使用雙重染色。
為此如實施例4所述首先將細胞與抗人白蛋白(豚鼠抗人白蛋白)的一抗一起在按1∶50稀釋的PBS中培養。洗滌步驟後，然後將細胞也在按1∶50稀釋的PBS中與二抗小鼠抗大鼠培養45分鐘，該二抗結合豚鼠抗體。然後再根據實施例4採用Cordell J.L等人(在上述引文中)的方法用APAAP紅色複合物進行染色。
在第二步染色步驟中，細胞與一抗即小鼠抗人CD14抗體一起培養，根據實施例4洗滌後再使用Hsu，S.M等人在「The use ofantiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex inimmunoperoxidanse，technics」Am.J.Clin.Pathol.75(6)816-821(1981)中dem DAB複合物(褐色)(Vector Laboratories)的方法用Vectastain(Vector)的ABC鏈黴抗生物素蛋白試劑盒進行染色。
然後按照實施例4所述用haemalaun進行核對染，接著將其嵌入Kaiser’s甘油明膠。
結果如圖10所示。圖中表明抗原CD14表述為褐色，其顏色隨著細胞轉變成肝細胞的形態學變化慢慢褪去，而白蛋白表達為紅色，其顏色隨著肝細胞的不斷成熟而加深。圖10中第4號圖顯示的是用肝細胞條件化培養基刺激三周後的細胞。
B)雙重標記進行的同時，利用FACS(螢光激活細胞分類術)分析對本發明所述幹細胞分化成肝細胞進行分析。
根據實施例10的由幹細胞分化成的肝細胞首先用細胞刮棒將細胞從培養瓶中機械分離。小心的用PBS將細胞從瓶上洗下，共洗滌兩次，每次使用10mlPBS溶液。為此，將PBS溶液中細胞懸液置於15ml離心管中，在1600rpm下離心沉澱。得到的細胞沉澱用PBS稀釋至每100μl PBS含有1×105個細胞。
然後在該細胞懸液中加入各10μl的FITC-標記的抗CD14抗體(BD Pharmigen)或FITC-標記的抗白蛋白抗體(Beckmann)以及FITC-標記的非特異性IgG1小鼠抗人抗體。培養20分鐘之後，細胞在500μl的PBS中重懸兩次，每次在1600rpm下沉澱5分鐘，最後再轉入200μl的PBS中。將細胞再次混懸後，利用BD Bioscience公司出產的BD FACScalibur流式細胞儀檢測螢光(參見FranklinLakes，NJ)(參見Bruhn H.D Flsch U.R.(eds.)，Lehrbuch derLabormedizinGrundlagen，Diagnostik，Klinik Pathobiochemie[Textbook of Laboratory Medicine，Principles，Diagnosis，Clinical Pathobiochemistry]，395-403(1999)，以及Holzer U等人，「Differential antigen sensitivity and costimulatoryrequirements in human Th1 and Th2 antigen-specific CD4(+)cells with similar TCr anidity」J.Immunol.170(3)1218-1223(2003))。使用Marquez M.G.等人「Flow cytometric analysisof intestinal intra-epithelial lymphocytes in a model ofimmunodeficiency in Wistar rats」Cytometry 41(2)115-122(2000)中介紹的微軟WinMDI程序對結果進行評價。
FACS分析的結果在圖11中再現。圖中顯示了在本發明所述去分化單核細胞(左欄)和分化成肝細胞的幹細胞(右欄)中測量的CD14(上面一排)和白蛋白抗原(下面一排)的表達。在去分化單核細胞中能檢測到CD14的大量表達，檢測不到白蛋白的表達。而在由去分化單核細胞生成的肝細胞中檢測到較少的CD14的表達，白蛋白的表達則很強。
實施例12單核細胞來源的去分化程序化幹細胞的體內應用為了闡明可程序化幹細胞在體內利用肝臟中存在的信號提供者而進行特異分化的程度，首先將雌性LEW大鼠的肝臟用倒千裡光鹼處理來抑制肝臟中已有肝細胞的增殖活性(參見Lacone，E等人「Long-term，11 ear-total liver replacement bytransplantation of isolated hepatocytes in rats treated withretrorsine」Am.J.Path.153319-329(1998))，然後將所述可程序化幹細胞經門靜脈注射入遺傳上相同的受體動物的肝臟。
為此LEW大鼠在14天內腹膜內兩次注射30mg雙吡咯烷類生物鹼倒千裡光鹼。隨後切除經上述方法處理的肝臟的80％，然後將含有5×105的可程序化幹細胞的1mlPBS溶液注入剩餘肝臟的門靜脈。如實施例2所述幹細胞來自於雄性LEW大鼠的單核細胞。注入幹細胞5天以後，利用肝臟活組織穿孔對肝臟進行組織學評價，利用具有Y染色體特異性探針的螢光原位雜交(FISH)方法檢測由幹細胞分化的細胞的類型(詳細記載見Hoebee，B.等人「Lsolation of ratchromosome-Specific paint probes by bivariate flow sortingfollowed by degenerate oligonucleo tide primed-PCR」Cytogenet.Cell Genet.66277-282(1994)。
圖7A顯示的是給倒千裡光鹼預處理過並切除80％的雌性受體動物的肝臟進行門脈內注射第五天時，由雄性LEW幹細胞生成的Y染色體陽性(細胞核中有紅點)的肝細胞。幹細胞注射後第25天選擇性去除同樣的肝臟表明幹細胞分化成肝細胞、內皮細胞和膽管上皮(圖7B)。與此同時，肝臟已經達到正常大小，＞90％的細胞具有Y染色體。由此可以推斷注射的同源的可程序化的單核細胞源的幹細胞能夠在體內有效的完全恢復肝臟正常代謝動能。與此相關，圖7C表示在施用倒千裡光鹼和80％肝臟切除後，幹細胞處理的對未處理的受體大鼠的Kaplan-Meier存活曲線(每組n＝4)。
功能性參數膽紅素和氨證實了幹細胞處理的長期存活的動物具有完整的代謝功能(圖7D和7E)實施例13細胞培養瓶中單核細胞的增殖和去分化在含有相同的營養培養基的培養瓶中，一方面進行單核細胞的大規模培養和增殖，另一方面進行細胞大量去分化，這也可以用於孔板中的培養(參見實施例2)。營養培養基中包含2.5μg/500ml的M-CSF和0.2μg/500ml白細胞介素3(IL-3)。
將實施例1中分離的單核細胞轉入體積為250ml和平壁的培養瓶底部(T-75細胞培養瓶)。約10倍×106的細胞被轉入每個裝有20ml上述營養培養基的培養瓶中。根據已知的方法(參見Hay R.J.，「」，Academic Press(2002)，第4章，55-84頁)確定每瓶中確切的細胞數量。
細胞培養瓶在37℃培養箱中培養6天。24小時之後，細胞貼附於瓶底。每隔一天移走上清液，並加入20ml新鮮的培養基。
第六天，將營養培養基從瓶中吸出，然後將每個培養瓶用10ml PBS漂洗兩次。至此，所有沒有貼附於瓶底的細胞都被移走。隨後將貼附於瓶底的生長的細胞用無菌細胞刮棒剝離下來。用PBS衝洗從瓶上剝離的分離的細胞，收集在50ml的Falcon管中，1800rpm下離心10分鐘。然後棄去上清液，沉澱再用新鮮的RPMI1640培養基再次懸浮(2ml/105細胞)。
細胞懸浮液可直接用於分化成不同的靶細胞。
也可以離心後將細胞與作為冷凍培養基的DMSO/FCS混合，以106/ml的濃度深度冷凍。
冷凍培養基含有95％的FCS和5％DMSO。約106的細胞加入1ml介質中。按照如下的步驟冷卻
冰浴30分鐘；在-20℃預冷的可發泡性聚苯乙烯盒中2個小時；在-80℃的可發泡性聚苯乙烯盒中24個小時；在-180℃液氮(N2)中的試管中貯存。
權利要求
1.製備來源於人單核細胞的去分化的可程序化幹細胞的方法，其特徵在於a)從人血液中分離單核細胞；b)在含有細胞生長因子M-CSF的適宜的培養基中增殖單核細胞；c)同時或在步驟b)之後在含有IL-3的培養基中培養單核細胞；d)從培養基中分離得到人成體的去分化的可程序化幹細胞。
2.權利要求1所述方法，其特徵在於在步驟c)中向培養基中再加入巰基化合物。
3.權利要求2所述方法，其特徵在於使用的巰基化合物中至少有一個碳基團與硫鍵合，和烴基可以被一個或多個其它的功能基團取代。
4.權利要求2或3所述方法，其特徵在於巰基化合物是2-巰基乙醇或二甲基亞碸。
5.權利要求1-4所述方法，其特徵在於在步驟c之後和步驟d之前，細胞與一種生物學上可接受的有機溶劑接觸。
6.權利要求5所述的方法，其特徵在於生物學上可接受的有機溶劑是具有1-4個碳原子的醇。
7.權利要求6所述的方法，其特徵在於所述醇為乙醇。
8.權利要求5至7所述的方法，其特徵在於使細胞與生物學上可接受的有機溶劑的蒸汽相接觸。
9.權利要求1至8所述的方法，其特徵在於在步驟d之後，將細胞懸浮於適宜的細胞培養基中。
10.權利要求9所述的方法，其特徵在於所述培養基為RPMI或DMEM。
11.權利要求9或10所述的方法，其特徵在於培養基中包含一種細胞因子或LIF。
12.權利要求9至11所述的方法，其特徵在於將細胞懸浮於液體培養基中並隨後深度冷凍。
13.權利要求12所述的方法，其特徵在於所述培養基為細胞培養基。
14.來源於人單核細胞的去分化的可程序化幹細胞。
15.權利要求14所述的幹細胞，其可以通過權利要求1至13的方法獲得。
16.藥物組合物，其包含權利要求14或15所述去分化的可程序化幹細胞。
17.權利要求14或15所述去分化的可程序化幹細胞在製備靶細胞和靶組織中的用途。
18.權利要求17所述的用途，其特徵在於a)壓碎包含期望的靶細胞的組織；b)從壓碎的組織中獲得靶細胞和/或其碎片；c)在適宜的培養基中培養靶細胞和/或其碎片；d)在培養過程中和之後收集培養基上清液，作為靶細胞條件化培養基；和e)使幹細胞在靶細胞條件化培養基中生長以使幹細胞再程序化/分化為期望的靶細胞。
19.權利要求17或18所述的用途，用於製備脂肪細胞、神經元和神經膠質細胞、內皮細胞、角質細胞、肝細胞或胰島細胞。
20.權利要求1至13所述的方法，其特徵在於去分化的可程序化幹細胞被一個或多個基因轉染。
21.權利要求14所述來源於人單核細胞的去分化的可程序化幹細胞，其特徵在於膜聯單核細胞特異性表面抗原CD14和至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。
22.權利要求14、15或21所述的幹細胞，其特徵在於去分化的可程序化幹細胞被一個或多個基因轉染。
23.幹細胞製劑，其中含有在適宜的培養基中的權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞的。
24.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療肝硬變的藥物組合物中的用途。
25.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療胰機能不全的藥物組合物中的用途。
26.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療急性或慢性腎功能衰竭的藥物組合物中的用途。
27.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療激素功能低下的藥物組合物中的用途。
28.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療心肌梗塞的藥物組合物中的用途。
29.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療肺栓塞的藥物組合物中的用途。
30.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療中風的藥物組合物中的用途。
31.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞在製備治療皮膚損傷的藥物組合物中的用途。
32.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞用於製備用於體內生成靶細胞和靶組織的藥物組合物中的用途。
33.由權利要求14、15、21或22所述幹細胞再次程序化獲得的分化的、分離的靶體細胞和/或靶組織，其特徵在於膜聯表面抗原CD14。
34.權利要求33所述靶體細胞和/或靶組織，其選自脂肪細胞、神經元和神經膠質細胞、內皮細胞、角質細胞、肝細胞或胰島細胞。
35.權利要求33或34所述靶體細胞和/或靶組織，其特徵在於它們被一個或多個基因轉染。
36.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞或權利要求33-35所述靶體細胞和/或靶組織包被的可移植物。
37.權利要求36所述的可移植物，其特徵在於所述可移植物是假器官。
38.權利要求37所述的可移植物，其特徵在於所述假器官選自心臟瓣膜、血管假器官、骨和關節假器官。
39.權利要求36所述的可移植物，其特徵在於所述可移植物是包含權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化幹細胞或權利要求33-35所述靶細胞的人工的和/或生物的載體材料。
40.權利要求39所述的可移植物，其特徵在於所述載體材料是介入人體的囊或室。
41.包含權利要求33所述的胰島細胞的權利要求40所述囊或室在製備藥物構建體中的用途，該藥物構建體作為提供胰島素的人工胰島細胞孔口室。
42.包含權利要求33所述的脂肪細胞的權利要求40所述囊或室在製備用於手術後乳房重塑和整形和/或美容矯正的藥物構建體中的用途，該藥物構建體中包含填充有脂肪細胞的人工聚合物。
43.權利要求36或40所述可移植物，其特徵在於所述可移植物是含有權利要求33所述分化的分離的靶體細胞的半透性孔口室系統。
44.權利要求43所述的半透性孔口室系統在製備用於體內治療內分泌、代謝或凝血疾病的藥物構建體中的用途。
45.M-CSF和IL-3在製備來源於人單核細胞的去分化的可程序化幹細胞中的用途。
全文摘要
本發明涉及從人單核細胞製備成體去分化可程序化幹細胞，所述製備通過將單核細胞在含有M－CSF和IL－3的培養基中培養而進行。本發明進一步涉及含有去分化可程序化幹細胞的藥物組合物以及這些幹細胞在靶細胞和靶組織製備中的用途。
文檔編號A61K35/12GK1643137SQ03807128
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月28日 優先權日2002年3月28日
發明者B·K·F·克雷默, F·費恩德裡希, M·魯恩克 申請人:布拉斯蒂康生物科技研究有限責任公司