利用雙重標記固定化探針的固相中的靶核酸序列檢測的製作方法

2023-06-16 06:27:51

專利名稱：利用雙重標記固定化探針的固相中的靶核酸序列檢測的製作方法
利用雙重標記固定化探針的固相中的靶核酸序列檢測
技術領域：
本發明涉及利用雙重標記固定化探針及該雙重標記固定化探針對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性，在固相中檢測靶核酸序列的新穎方法。
背景技術：
基於DNA的微陳列技術作為能夠對基因或基因簇的存在、水平或表達模式進行分析的有前途的技術備受矚目(Schena et al., 1995.Quantitative Monitoring of GeneExpression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science,270:467-470;DeRisi et al.,1996,Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patternsin Human Cancer, Nature Geneticsl4:457_460)o現有的DNA微陳列一般來說是將已標記的靶序列與固定於固相基質的探針進行雜交，來對標記中的信號進行檢測，從而檢測靶序列。但是，向靶序列直接進行標記在費用及時間方面不具有有效性，並且，對靶序列的水平(level)產生影響的可能性高。為了克服此類現有的微陳列技術的問題，提出了代替利用標記的靶序列的分子信標探針(molecular beacon probe)(Steemers et al.,Nat Biotechnol, 18:91-94 (2000)；Kim et al., Biosensors Bioelectronics, 22:1041-1047 (2007))。利用突光共振能量轉移(FRET, fluorescence resonance energy transfer)現象的分子信標探針技術只在上述探針與靶序列進行雜交的情況下提供螢光信號，因此，能夠對靶序列以實時方式進行檢測。但是,大大依賴與祀序列的雜交的很多方法由於交叉反應(cross reactions),在假陽性數據產生嚴重的問題，因此，存在需要改善最終雜交信號的可靠性的問題。在利用固定化的雙重標 記探針的雜交過程之外，利用追加性的外切核酸酶反應的幾個接近法，提出了例如，固相中的TaqMan (拖慢)探針法(Liu et al., Nucleic AcidRes.34:e4 (2006))。Liu等在固相基質上利用固定化的雙重標記探針，並在探針的5』-末端與猝滅分子相連接，在3』 -末端與螢光報導分子相連接。上述探針在上遊引物的延長過程中，被DNA聚合酶的5』 一3』核酸酶活性切割。在進行切割反應後，猝滅分子會分離，而螢光報導分子殘留於固相基質，對固相基質中生成的螢光信號進行檢測，從而最終對靶序列進行檢測。不僅僅是雜交，利用引物依賴性5』 一 3』核酸酶活性的TaqMan探針陳列方法在提高固相中的靶特異性的同時，還能以實時方式檢測靶序列。但是，TaqMan探針陳列方法中的DNA聚合酶的引物依賴性5』 一 3』核酸酶活性連螢光報導分子標記的核苷酸也能切割，因此，在固相基質無法殘留螢光報導分子。為了克服此類問題，設計雙重標記探針使螢光報導分子位於不被DNA聚合酶的引物依賴性5』 一 3』核酸酶活性切割的非切割部位。由於在切割反應期間被切割而縮短的探針由靶核酸序列得到改性，因此可決定探針上的非切割部位。為了這種目的，將螢光報導分子位於3』 -末端。因此，TaqMan探針的陳列方法中，猝滅分子和螢光報導分子之間的距離逐漸變大。探針上的雙重標記的距離越遠，雙重標記系統的猝滅效率會降低。較低的猝滅效率根據位點產生相互不同的本底信號，最終表示錯誤的結果。
而且，由於TaqMan探針陳列方法利用DNA聚合酶的引物-依賴性5』 一 3』核酸酶活性，因此，需要上遊引物。這種對追加的寡核苷酸(上遊引物)的使用相關的限制很難定立用於多重靶檢測的微陳列上的反應條件，並且，這會成為產生假陽性結果的因素之一。另一方面，W02008/011004公開一種利用DNA聚合酶的引物獨立性切割活性的線性指數聚合酶鏈式反應(LATE-PCR, Linear-After-The-Exponential PCR)中的祀檢測方法。利用DNA聚合酶的引物依賴性5』 一 3』核酸酶活性的基於TaqMan探針的方法，與該方法不同，W02008/011004中的DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』核酸酶活性並不需要引物的幫助。而且，W02008/011004公開通過3個以上的亞甲基(CH2)的標記和探針的5』 -末端之間的結合，使探針被DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』核酸酶活性更加有效的切割，相反，未利用亞甲基(CH2)鏈的標記和探針的5』-末端的結合，使探針對DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』核酸酶活性具有抵抗性。在沒有引物的幫助下，利用對於通過探針的改性得以調節的DNA聚合酶的引物獨立性5』 一3』核酸酶活性的敏感度或抵抗性的反應能夠通過追加性的研究及開發，適用於固相中的靶檢測。在本發明所屬技術領域中，出現了對於新的DNA微陳列技術研發的要求，該新的DNA微陳列技術能夠克服與現有的DNA的微陳列方法相關的問題，並且在一個DNA微陳列上，能更加便捷並具有可靠性及再現性地檢測靶序列，優選為多個靶序列。而且，在靶核酸序列的定量分析領域中還需要以實時方式在固相中實施反應，並對信號進行檢測的新的實時微陳列方法。在本說明書全文中參照多篇專利及文獻，並用括號來表示其引用部分。這樣的專利及文獻，作為參照全部包括在本說明書中，因此，能夠更加明確地說明本發明所屬的技術領域的水準及本發明的內容。

發明內容

在此情況下，本 發明者精心研究、努力研發一種新的靶檢測技術，上述技術利用具有相互作用性雙重標記的探針，以更加便捷的方式，在沒有假陽性及假陰性結果的情況下，對革G核酸序列進行檢測、識別及定量。本發明者對雙重標記探針上的標記的結合位點及模式進行多種調節。有趣的是，本發明者發現了 DNA聚合酶對引物獨立性5』 一 3』核酸酶活性的鹼基標記核苷酸抵抗性，並且，發現了一種能夠有效適用於靶核酸序列檢測的雙重標記探針上的標記的結合位點及模式，這在雙重標記中，第一標記與探針的5』 -末端相結合，第二標記與位於第一標記的下遊的核苷酸鹼基相結合。本發明的獨特的標記方式誘導探針使其根據靶核酸序列的存在與否來產生信號(包括信號的產生、增加及減少)，而且對DNA聚合酶的5』 一 3』核酸酶活性具有抵抗性。本發明的內部阻斷雙重標記探針(internally blocked dual-labeled probe)可自由決定內部標記(即，第二標記)的位點，並且，在沒有假陽性及假陰性數據的情況下，能夠有再現性地從固相基質上最終殘留的標記中獲得信號。本發明者判斷，本發明利用探針在固相基質上對靶核酸序列進行檢測時，提供最優化的實驗方案。因此，本發明的目的在於，提供一種在固相利用對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性，檢測靶核酸序列的方法。
本發明的再一目的在於，提供一種在固相利用對於DNA聚合酶的5』 一3』外切核酸酶活性的抵抗性，從DNA或核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒。本發明的另一目的在於，提供一種將對於DNA聚合酶的5』 一3』外切核酸酶活性的抵抗性賦予給寡核苷酸的方法。本發明的其他目的及優點通過以下實施例及權利要求書變得更加明確。

圖1表示本發明的過程。圖2-圖4表示通過探針的核苷酸鹼基成分和標記的結合來賦予的，對一部分DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性結果。圖2-圖4分別利用Taq、Tth及TflDNA
聚合酶。圖5表示利用對於微陳列上的雙重標記探針及DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性的靶核酸序列的檢測結果。利用具有現有結構的雙重標記探針。圖6表示利用對於微陳列上的雙重標記探針及DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性的靶核酸序列的檢測結果。利用具有改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO，modified dual specificity oligonucleotide)結構的雙重標記探針。實施方式本發明涉 及一種靶檢測方法，上述方法利用通過將探針寡核苷酸的核苷酸的鹼基上結合有標記而被賦予的，對DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』外切核酸酶活性獨特的抵抗性。根據本發明的一實施方式，本發明涉及一種在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，包括以下步驟:步驟(a)，將上述靶核酸序列與固定化探針進行雜交；上述固定化探針包括與上述靶核酸序列互補的核苷酸序列；通過3』 -末端在固相基質上進行固定化的上述探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記；上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅；第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子；上述第一標記與上述固定化探針的5』 -末端相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸鹼基相結合，這種上述第二標記的結合使上述核苷酸對上述DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性；步驟(b)，在切割上述固定化探針的條件下，使上述步驟(a)的結果物與具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接觸；與上述靶核酸序列互補的上述固定化探針通過上述DNA聚合酶的外切核酸切割反應被切割，使得上述第一標記從上述固定化探針分離，來引起在上述固相基質上實現的信號變化；步驟(C)，在標有上述第二標記的上述核苷酸中結束上述DNA聚合酶的上述外切核酸切割反應；上述外切核酸切割反應的結束被具有與上述第二標記相結合的鹼基的上述核苷酸的抵抗性誘導，上述第二標記殘留於上述固相基質上；以及步驟(d)，對上述固相基質上的信號變化進行檢測；通過上述固定化探針的上述切割而引起的上述信號變化表示上述靶核酸序列的存在。
本發明者精心研究、努力研發一種新的靶檢測技術，上述技術利用具有相互作用性雙重標記的探針，在固相以更加便捷的方式，在沒有假陽性及假陰性結果的情況下，對靶核酸序列進行檢測、識別及定量。本發明者對雙重標記探針上的標記的結合位點及模式進行多種調節。有趣的是，本發明者發現了 DNA聚合酶對引物獨立性5』 一 3』核酸酶活性的鹼基標記核苷酸抵抗性，並且，發現了一種能夠有效適用於靶核酸序列檢測的雙重標記探針上的標記的結合位點及模式，這在雙重標記中，第一標記與探針的5』 -末端相結合,第二標記與位於第一標記的下遊的核苷酸鹼基相結合。本發明的獨特的標記方式引起探針根據靶核酸序列的存在與否來產生信號(包括信號的生成、增加及減少)，而且，對DNA聚合酶的5』 一 3』核酸酶活性具有抵抗性。本發明的內部阻斷雙重標記探針(internally blocked dual-labeled probe)可自由決定內部標記(即，第二標記)的位點，並且，在沒有假陽性及假陰性數據的情況下，能夠有再現性地從固相基質上最終殘留的標記中獲得信號。本發明者判斷，本發明利用探針在固相基質上對靶核酸序列進行檢測時，提供最優化的實驗方案。本發明者精心研究、努力研發對DNA聚合酶的引物-獨立性5』 一3』外切核酸酶活性的調節，有趣的是，發現了鹼基與標記相結合的核苷酸對DNA聚合酶的引物-獨立性5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性。
基於這些發現，本發明者定立了一種新的接近法，上述接近法將對於DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性賦予給寡核苷酸。並且，本發明者將這些發現適用於固定化的雙重標記探針，來定立了一種新的靶檢測方法，上述方法在不會受到標記位點的限制的情況下，在固相中利用雙重標記探針。在本發明者知曉的限度內，此類接近法由本發明者首次提出，這有助於更有效而正確地檢測靶核酸序列。在利用雙重標記探針的切割反應的現有的固相方法中，靶核酸序列只能在切割反應中與探針上的內部核苷酸相結合的標記殘留於固相基質上的情況下進行檢測。利用DNA聚合酶的引物依賴性5』 一3』核酸酶活性的基於TaqMan (拖慢)探針的方法而言，在切割反應中逐漸縮短的探針根據探針序列及反應條件由靶核酸序列得到改性(denaturation)，有可能致使非切割部位形成在探針上。因此，標記位於探針上的非切割部位的情況下，標記可最終殘留於固相基質上。但是，此類方法還存在一種嚴重的問題，即，為了使與探針上的內部核苷酸相結合的標記位於非切割部位上，需要考慮反應條件。由於受到此類限制，需要以雙重標記隔開的相當遠的方式設計雙重標記探針。探針上的雙重標記的距離越遠，雙重標記系統的猝滅效率越低。較低的猝滅效率根據位點，會引起相互不同的本底信號的產生，最終表示錯誤結果。本發明克服上述的現有方法的問題，並利用雙重標記探針在固相中檢測靶核酸序列。根據本發明，探針的內部核苷酸鹼基和標記的結合使內部核苷酸對DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性。在固相基質上進行固定化的探針會進行DNA聚合酶的切割反應，並且，與內部核苷酸的鹼基相結合的標記因抵抗性而會殘留於固相基質上。與利用DNA聚合酶的引物依賴性5』 一 3』外切核酸酶活性的基於TaqMan探針的方法不同，本發明無需根據反應條件來考慮非切割部位，能夠自由決定探針上的內部標記的位點，並將標記位於適合對探針上的雙重標記系統的粹滅效率進行最大化的位點(site),從而使本底信號最小化。優選地，用於本發明的固定化探針通過固相基質上的其3』 -末端進行固定化。相互作用性雙重標記中的一個通過碳間隔區與除了位於固定化探針的5』 -末端的鹼基以外的核苷酸結構相結合，而另一個與內部核苷酸鹼基相結合。根據本發明，與靶核酸序列進行雜交的固定化探針通過DNA聚合酶的引物獨立性5』 一 3』外切核酸酶活性，從固定化探針的5』 -末端向5』 一 3』方向逐漸被切割,來分離5』 -末端的第一標記。上述酶與鹼基成分上標記的內部核苷酸接觸時，因其抵抗性而使切割反應結束，並將內部核苷酸標記最終殘留於固相基質。一般來說，DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性分為上遊核苷酸依賴性活性及上遊寡核苷酸獨立性活性。上遊寡核苷酸包含引物、引物的延長產物及位於切割的寡核苷酸的上遊的探針。本發明由於利用上遊寡核苷酸獨立性活性，因此，本說明書中所使用的術語「DNA聚合酶的5』 一3』外切核酸酶活性」只要沒有特別的說明，就意味著DNA聚合酶的上遊寡核苷酸獨立性5』 一 3』外切核酸酶活性。對本發明的詳細說明如下。根據本發明，靶核酸序列與在固相基質上進行固定化的雙重標記探針進行雜交。

本說明書所使用的術語「靶核酸」、「靶核酸序列」或「靶序列」意味著所要檢測的核酸序列，並在雜交、退火或擴增條件下，與探針或引物進行退火或雜交。本說明書中使用的術語「探針(probe)」意味著與靶核酸序列實質上互補的部位或者包含這些部位的單鏈核酸分子。優選地，探針是單鏈脫氧核苷酸分子。並且，探針可包含核糖核酸。在本說明書中使用的術語「引物」意味著寡核苷酸，在誘導與核酸鏈(模板)互補的引物延長產物的合成的條件，即，如核苷酸和DNA聚合酶一樣的聚合劑的存在以及適合的溫度與PH的條件下，可起到合成的起始點的作用。優選地，引物在擴增中作為具有最大有效性的單鏈。優選地，引物為寡脫氧核糖核苷酸。在本發明中所利用的探針或者引物可包含自然(naturally occurring)脫氧單磷酸核苷(dNMP) (S卩，脫氧腺苷酸(dAMP)、脫氧鳥苷酸(dGMP)、脫氧胞苷酸(dCMP)及脫氧胸苷酸(dTMP))、改性核苷酸或者非自然核苷酸。改性核苷酸或者非自然核苷酸可包含非自然鹼基。就引物而言，應充分長，以便能夠在聚合劑的存在之下引發延長產物的合成。引物的適合的長度取決於多個因素，例如，溫度，應用領域及引物的根源(source)。在本說明書中使用的術語「退火」或者「引發」意味著在模板核酸並置(apposition)寡脫氧核苷酸或者核酸，就上述並置而言，通過聚合酶對核苷酸進行聚合而形成模板核酸或者與該模板核酸的一部分互補的核酸分子。在本說明書中使用的術語「雜交(hybridization)」意味著互補的單鏈核酸形成雙鏈核酸。雜交在兩個核酸鏈之間完全互補時(perfect match)產生,或存在部分錯配的(mismatch)鹼基也會產生雜交。雜交所需的互補程度可隨著雜交條件而不同，尤其可以根據溫度進行調節。在本說明書中使用的術語「退火」和「雜交」沒有區分，在本說明書中混用。在本發明中使用的固定化探針具有與靶核酸序列互補的核苷酸序列。術語「互補的」意味著在預定的退火條件或者嚴格條件下引物或者探針以選擇性地與靶核酸序列雜交的程度充分地互補，並包括「實質上互補的(substantially complementary)」及「完全互補的(perfectly complementary)」的意思,優選地,意味著完全互補的意思。 在本發明中使用的固定化探針通過其3 』 -末端在固相基質上實現固定化。優選的固相基質包含適合的固相或者半-固相載體，例如，膜、過濾器、晶片、載玻片、晶片、纖維、磁珠或者非磁性磁珠、凝膠、管材、板、高分子、微粒及毛細管。雖然，在一部分實例中，優選地，針對互不相同的化合物，以物理方式分離合成區域，該合成區域例如為，孔板、凸起區域(raised region)、銷、蝕刻溝槽(etched trench)等,但是,在多個實例中，固相基質的至少一個表面實質上可以是平面。根據本發明的其他實例，這些固相基質將會具有磁珠、樹脂、凝膠、微球或者其他幾何排列形態。優選地，固相基質包含微陣列。探針在固相基質的表面直接或者間接地實現固定化(優選地，間接地實現固定化)。並且，探針能夠以共價鍵或者非共價鍵方式在固相基質的表面上實現固定化。在探針間接地在固相基質的表面上實現固定化的情況下，可利用合適的連接肽。可利用於本發明的連接肽均包含用於在微陣列中使探針固定化的任何連接肽。例如，具有胺基的烷基或者芳基化合物或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作為連接肽利用於探針固定化。並 且，可將聚尾(poly T tail)或者聚腺苷酸尾(poly A tail)作為連接肽來利用，從而能夠減少有可能將酶作用(例如，酶性切割反應)抑制的可能性高的空間性妨礙(space hindrance)或者增加雜交效率。聚尾(poly T tail)或者聚腺苷酸尾(polyA tail)不包含於探針的序列。本發明所利用的固定化探針具有相互作用性雙重標記系統，上述相互作用性雙重標記系統包含報導分子及猝滅分子。上述相互作用性標記系統是能量非-放射性地(non-radioacively)傳遞到供體分子(報導分子)及受體分子(猝滅分子)之間的信號產生系統。作為相互作用性標記系統的代表性例子，螢光共振能量轉移(FRET，fluorescenceresonance energy transfer)標記系統包含報導分子(供體分子)及粹滅分子(受體分子)。螢光共振能量轉移中，能量供體為螢光性，但是，能量受體可以是螢光性或非螢光性。相互作用性標記系統的再一形態中，能量供體為非螢光性，例如，為發色團(chromophore),能量受體為突光性。在相互作用性標記系統的另一形態中，能量供體為發光性，例如，生物發光性、化學發光性或電化學發光性，受體為螢光性。更優選地，表示靶核酸序列的信號通過相互作用性標記來產生，並且，最優選地，上述信號為螢光共振能量轉移標記系統。對探針而言，有用的報導分子及猝滅分子還可包含所屬領域公知的任何分子。其例子如下:Cy2 (506)、YO-PROtm-1 (509)、YOYOtm-1 (509)、Calcein (517)、FITC (518)、FluorX (519) > Alexa (520)、RhodaminellO (520)、Oregon Green 500 (522)、OregonGreen 488 (524)、RiboGreen (525)、Rhodamine Green (527)、Rhodaminel23 (529)、Magnesium Green (531 (、Calcium Green (533)、TO-PROtm-1 (533)、TOTOl (533)、JOE (548)、B0DIPY530/550(550)、Dil (565)、BODIPY TMR (568)、B0DIPY558/568 (568)、B0DIPY564/570 (570)、Cy3 (570)、Alexa 546 (570)、TRITC (572)、Magnesium Orange (575)>Phycoerythrin R&B (575)、Rhodamine Phalloidin (575)、Calcium Orange (576)、Pyronin Y (580)、Rhodamine B (580)、TAMRA (582)、Rhodamine Red (590)、Cy3.5 (596),ROX (608),Calcium Crimson (615),Alexa 594 (615),Texas Red (615),Nile Red(628)、Y0-PR0 -3 (631)、Y0Y0 -3 (631)、R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648)、T0-PR0 -3 (660)、T0T03 (660)、DiD DilC (5) (665)、Cy5 (670)、Thiadicarbocyanine(671)、Cy5.5 (694)、HEX (556)、TET (536)、Biosearch Blue (447)、CAL Fluor Gold540(544)、CAL Fluor 0range560(559)、CALFluor Red590(591)、CAL Fluor Red610(610)、CALFluor Red635 (637)、FAM (520)>Fluorescein (520)>Fluorescein-C3 (520)、Pulsar650(566)、Quasar570 (667)、Quasar670 (705)及 Quasar705 (610)。括號內的數字是以納米單位表示的最大發光波長。適合的報導-粹滅對公開在如下的許多文獻中:Pesce等，editors, (MarcelDekker, New York, 1971) ；ffhite 等，Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker, New York,1970) ；Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules,2nd Edition (Academic Press, New York,1971) !Griffiths, ColorANDConstitution of Organic Molecules (Academic Press, New York,1976) ；Bishop,editor,IndicatorsCPergamon Press, Oxford,1972);Haugland, Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene,1992) ；Pringsheim,Fluorescence and Phos phorescence (Interscience Publishers, New York,1949)；Haugland,R.P.,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,6th Edition(Molecular Probes, Eugene, Oreg.，1996)美國專利第 3996345 號及美國專利第 4351760號。報導分子及猝滅分子可以分別呈現螢光性。並且，報導分子可以呈現螢光性，或者猝滅分子可以呈現非螢光性。例如，在本發明中可利用能夠對廣範圍波長或特定波長的螢光進行猝滅的非螢光性黑猝滅分子。猝滅分子呈現螢光性的情況下，可通過螢光性猝滅分子的信號變化來檢測靶核酸序列。固定化探針上的雙重標記系統中，報導分子包含螢光共振能量轉移的供體，猝滅分子包含突光共振能量轉移的剩餘夥伴(受體)。例如，突光素染料(fluorescein dye)用作報導分子，羅丹明染料(rhodamine dye)用作粹滅分子。報導分子及猝滅分子能夠通過現有的方法，與探針相連接。例如，報導分子及猝滅分子可通過包含至少3個碳原子的間隔區(例如，3-碳間隔區、6-碳間隔區、9-碳間隔區或者12-碳間隔區)與探針相連接。本發明所利用的固定化探針中，選自報導分子及猝滅分子的第一標記與固定化探針的5』 -末端相結合，選自報導分子及猝滅分子的第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸的鹼基相結合。優選地，與固定化探針的5』 -末端相結合的第一標記能夠與5』 -末端的磷酸鹽基進行直接或間接(例如，通過連接肽)的結合。選擇性的，第一標記能夠與5』 -末端的核糖(ribose)相結合,優選地,與核糖的5_碳相結合。固定化探針上的第二標記與位於第一標記的下遊的核苷酸的鹼基相結合。第二標記能夠與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或硫胺相結合，優選地，與硫胺相結合。基於第二標記的鹼基的標記優選地結合在除了鹼基成為氫鍵的位點之外的位點。例如，第二標記能夠與硫胺的第5碳或第6碳相結合，優選地，與硫胺的第5號碳的甲基相
彡口口 有趣的是，本發明者發現了基於第二標記的鹼基的標記將對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性賦予給已標記的核苷酸。本說明書中所使用的術語「抵抗性」意味著核苷酸分子通過DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性幾乎未被切割或完全未被切割，優選地，是完全未被切割。根據本發明的優選實例，第一標記為猝滅分子，第二標記為報導分子。選擇性的，第一標記為報導分子，第二標記為粹滅分子。本發明所利用的第一標記及第二標記提供相互作用性雙重標記系統。雙重標記尤其在固定化探針未與所要分析的試樣的核酸序列進行雜交的情況下，位於可發生雙重標記之間的能量猝滅的固定化探針的位點(site)。為了實現能量猝滅，雙重標記以特定距離或三維結構(例如，隨機線圈或髮夾結構)位於探針上。與靶核酸序列進行雜交的固定化探針通過DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性，從固定化探針5』-末端向5』一 3』方向逐漸被切割，來分離位於固定化探針5』-末端的第一標記。最終，第二標記殘留於固相基質，第一標記及第二標記之間不再發生能量猝滅，從而引起表示靶核酸序列的存在的信號變化(信號的產生、衰落、增加或減少)。在第一標記為猝滅分子、第二標記為報導分子的情況下，固定化探針的5』 -末端通過外切核酸切割反應被切割，來分離第一標記，相反，第二標記殘留於固相基質上。作為第二標記的報導分子中檢測信號，來檢測靶核酸序列。在第一標記為報導分子、第二標記為猝滅分子的情況下，固定化探針的5』 -末端通過外切核酸切割反應被切割，來分離第一標記，相反，第二標記殘留於固相基質上。猝滅分子呈現螢光性的情況下，殘留於固相基質上的猝滅分子產生與第一標記被分離前的初期信號不同的螢光信號，由此，檢測靶核酸序列。作為第二標記的報導分子中檢測信號，來檢測靶核酸序列。本發明的最主要的優點在於，能夠不受限制地決定內部標記的位點。由於對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的內部標記引起的抵抗性(internal label-causedresistance),內部標記還可位於從固定化探針的5』 -末端隔開的任何位點。優選地，內部標記位於能夠充分使雙重標記的粹滅效率最大化的位點。根據本發明的優選實例，第一標記和第二標記相互隔開，使DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性作用於第一標記和第二標記之間的部位。根據本發明的優選實例，第二標記通過被5』 一 3』外切核酸酶活性切割的固定化探針上的切割位點(cleavage site),從第一標記中分離。根據本發明的優選實例，第二標記位於能夠在特定反應條件下以抵抗性結束切割反應的適合的位點。優選地，第二標記位於從第一標記隔開至少2核苷酸的位點，更優選地，位於隔開至少3核苷酸的位點，進而優選地，位於隔開至少3核苷酸的位點。優選地，第二標記位於從第一標記隔開2-25核苷酸、2-20核苷酸、2_15核苷酸、
3-25核苷酸、3-20核苷酸、3-15核苷酸、4_25核苷酸、4_20核苷酸或4_15核苷酸的位點。根據本發明的優選實例， 第二標記由於被切割的探針由靶核酸序列得到改性，從而並不位於非切割部位。由於上述的理由，非切割部位對反應條件或探針序列具有依賴性，這也成為決定第二標記的位點的決定因素。根據本發明的優選實例，杜爾標記位於從固定化探針的3』-末端隔開至少10核苷酸的位點，更優選地，隔開至少15核苷酸的位點，進而優選地，隔開至少20核苷酸的位點，尤其優選地，隔開至少25核苷酸的位點。本發明所要檢測的靶核酸序列並不要求任何特定的序列或長度，並包含DNA(gDNA或者cDNA)以及RNA分子。在將mRNA作為初期物質來利用的情況下，在實施退火步驟之前必需要進行反轉錄步驟，以上詳細的內容公開在Joseph Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001) ;&Noonan，K.F.等，Nucleic Acids Res.16:10366( 1988)。為了反轉錄反應，可利用隨機六聚體或者與mRNA雜交的寡核苷酸dT引物。在本發明能夠進行檢測的靶核酸序列還均包含任何自然(naturally occurring)原核細胞核酸、真核細胞(例如,原生動物和寄生動物、菌類、酵母、高等植物、低等動物及包含哺乳動物和人類的高等動物)核酸、病毒(例如，皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV，HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS)、流感病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒以及脊髓灰質炎病毒等)核酸或者類病毒核酸。探針或者引物的退火或者雜交可根據本發明所屬技術領域公知的多種雜交方法來實施。在本發明中，適合的雜交條件藉助最優化程序決定為一連串的過程。溫度、成分的濃度、雜交及清洗時間、緩衝液成分及它們的PH及離子強度等條件根據多種因子而變得多樣，例如，探針及靶核酸序列的寡核苷酸的長度及糖皮質激素(GC)含量。對於雜交的詳細條件可以在 Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001);及M.L.M.Anderson,NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)石角認。例如，靶核酸序列和固定化探針的雜交溫度為40°C -80°C，更優選為45°C -75°C，進而優選為50°C -72°C。 緊接著雜交反應，在切割固定化探針的條件下，使步驟(a)的結果物與具有5』 一3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接觸。僅在固定化探針與靶核酸序列進行雜交的情況下，由具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶所切割，使第一標記從固定化探針分離，這會引起固相基質上的信號變化(參照圖1)。這種信號變化表示靶核酸序列的存在。本說明書中的「切割固定化探針的發生條件」意味著有助於由具有5』 一3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶致使固定化探針被切割的反應條件，包括溫度、pH、離子強度、緩衝液、探針長度、序列及外切核酸酶的種類。例如，利用Taq DNA聚合酶的情況下，發生固定化探針的切割的條件包括三輕甲基氨基甲燒(Tris-HCl, Tris (hydroxymethyl)aminomethane)緩衝液、KCl、MgCl2 及溫度。本發明所利用的具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶包含一種酶，該酶作用於與靶核酸序列的雜交相關聯的探針，來向5』 一 3』方向促進外切核酸切割反應。優選地，本發明中所利用的具有5』 一3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶(例如，E.coliDNA聚合酶1、熱穩定性DNA聚合酶及噬菌體T7DNA聚合酶)為具有5』 一 3』外切核酸酶活性的熱穩定性DNA聚合酶，例如包含Thermus aquaticus (Taq)、ThermusthermophiIus、Thermus filiformis、Thermus flavus、Thermus antranikiani1、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermusoshima1、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05 及 Thermus species spsl7。與靶核酸序列進行雜交的固定化探針由具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶所切割，使上述第一標記從固定化探針分離，從而引起固相基質上實現的信號變化。具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶引起固定化探針的外切核酸切割反應後，上述反應在與第二標記相結合的核苷酸中結束。外切核酸切割反應的結束由與第二標記相結合的核苷酸抵抗性來引導，最終，第二標記殘留於固相基質上。外切核酸切割反應結束之後，緊接著對固相基質上實現的信號變化(信號的增加或減少)進行檢測，並且，固定化探針的切割引起信號變化表示靶核酸序列的存在。信號能夠通過對於各個標記的現有的方法來檢測或測定。例如，螢光信號能夠通過現有的方法，如通過螢光檢測儀來進行檢測或測定。最終，在固相檢測到表示靶核酸序列存在的信號變化。優選地，通過固定化探針的切割的信號變化為固相基質上的信號的增加。在本發明中提供反應環境的固相基質優選包括在本發明所屬領域中公知的任何微陣列。本發明的全部過程，即與靶序列的退火、延長/切割反應及螢光的檢測在微陣列上完成。在微陣列中固定化探針利用為雜交陣列因素(hybridizable array element)。用於製備微陣列的固相基質(solid substrate)包含,例如金屬(例如,金、金與銅的合金及招)、金屬氧化物、玻璃、陶瓷、石英、矽、半導體、Si/Si02晶片、鍺、砷化鎵、碳、碳納米管、聚合物(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚丙烯醯胺)、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖及膠體，但是不局限於此。本發明的多個固定化探針固定化在固相基質上的一個可設定地址的(addressable)區域(region)或者多個可設定地址的區域(region),固相基質可包括2-1000000個可設定地址的區域(region)。為了通過如光刻`法、噴墨列印法、機械點樣法及與其類似的方法等現有製備技術，生產陣列或者用於特定應用的陣列而可以製備(fabricate)固定化探針。在本發明中，由於在固相基質上實現固定化的探針以物理方式相互隔開，因此，SP使利用一種的雙重標記，也可以在固相基質上檢測多個靶核酸序列。由此，通過本發明在固相中檢測到的靶核酸序列的數量並不受限。根據本發明的優選實例，本發明的方法在反覆循環之間包括變性過程，還包括至少反覆進行上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟(優選為2次，更優選為至少5次，進而優選為至少10次)。反覆進行上述步驟(a)_ (b)或(a)_ (C)的情況下，優選地，本發明還包括將靶序列的雙鏈以單鏈進行改性的過程。反覆進行上述步驟(a)_ (b)或(a)_ (C)，來引導反覆的外切核酸切割反應的情況下，信號的變化程度根據靶核酸序列的量來增加，從而使靶核酸序列的定量成為可能。將本發明根據反覆的外切核酸切割反應來實施的情況下，步驟(d)的檢測能夠分別在反覆的結束點(即，終點方式)，反覆的各個周期(即，實時方式)，或反覆期間的預定的時間間隔實施。實時的檢測適合對靶核酸序列進行定量化。清洗步驟可在步驟(d)之前實施。但是，本發明不受從固相基質上的雙重標記探針分離的標記分子的幹涉，並利用未清洗固相基質的如共聚焦雷射掃描儀等適合的設備，能夠僅檢測存在於固相基質上的信號。根據本發明的優選實例，步驟(a)中還包含反向引物，上述反向引物用於生成與固定化探針進行雜交的靶核酸序列。靶核酸序列的追加性的生成使信號變化較強地發生。例如，利用至少兩種擴增引物，對最少兩種的靶核酸序列進行多重-增幅，與至少兩種固定化探針進行雜交，並利用至少兩種反向引物及具有5』一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶實施延長及切割反應，最終，獲得比未使用反向引物的反應還要增加的信號變化。根據本發明的優選實例，固定化探針具有改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結構。改性雙重特異性寡核苷酸結構與現有的探針相比，具有相當高的靶特異性(參照:W02011/028041)。根據本發明的優選實例，固定化探針是具有一種用於區分靶核酸序列和非靶核酸序列的以下通式I的改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結構的靶區分性探針(targetdiscriminative probe:TD probe):5，-V -V -V -v(I)在上述通式中，V p是具有與·上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列的5』 -第二雜交部位(5』-second hybridization portion);Y』q是包含至少3個通用鹼基的分離部位(separation portion) 'V r是具有與上述祀核酸序列互補的雜交核苷酸序列的3』 -第一次雜交部位(3』 -first hybridization portion);上述祀區分性探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記，上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅；上述第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子；上述第一標記與上述5』 -第二次雜交部位的5』 -末端相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸的鹼基相結合；P、q及r表示核苷酸的數量，並且，X』、Y』及Z』是DNA或核糖核酸；上述5』 -第二次雜交部位的Tm比上述3』 -第一次雜交部位的Tm低，上述分離部位在上述V P、Y』 q、Z』 r3個部位中具有最低的Tm ;上述分離部位在對於上述靶核酸序列的雜交方面，使上述5』 -第二次雜交部位從3』 -第一次雜交部位分離，由此，上述靶區分性探針的雜交特異性藉助上述5』 -第二次雜交部位及上述3』 -第一次雜交部位來雙重性地決定，其結果，提高上述靶區分性探針的整體雜交特異性；上述靶區分性探針與上述靶核酸序列進行雜交的情況下，上述5』 -第二次雜交部位及上述3』 -第一次雜交部位都與上述靶核酸序列進行雜交，上述5』 -第二次雜交部位的5』 -末端通過上述DNA聚合酶的外切核酸切割反應被切割，上述第一標記從上述靶區分性探針分離，來引起上述固相基質上實現的信號變化；通過具有與上述第二標記相結合的鹼基的上述核苷酸的抵抗性，上述第二標記殘留於上述固相基質上；上述靶區分性探針與非靶核酸序列進行雜交的情況下，上述5』 -第二次雜交部位及上述分離部位都形成單鏈，從而使上述5』 -第二次雜交部位不被DNA聚合酶切割，因此，不會引起上述固相基質上的信號變化，由此，上述靶區分性探針對上述靶核酸序列及非靶核酸序列進行區分，上述固相基質上實現的上述信號變化表示上述靶核酸序列的存在。本說明書所使用的術語「祀區分性探針(target discriminative probe)」具有上述的改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結構，並意味著與靶核酸序列和非靶核酸序列以不同模式進行雜交，來對靶核酸序列和非靶核酸序列進行區分。上述具有改性雙重特異性寡核苷酸結構的，用於本發明的靶區分性探針包括以下序列:(i)與靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列對靶核酸序列和非靶核酸序列的區分起到關鍵作用的5』 -第二次雜交部位和分離部位。上述改性雙重特異性寡核苷酸結構是雙重特異性寡核苷酸(DSO，dualspecificity oligonucleotide)改性的新結構，上述雙重特異性寡核苷酸(DSO)由本發明者第一次提出(參照W02006/095981)。並且，上述雙重特異性寡核苷酸結構起到引物作用時，命名為雙重引發寡核苷酸(DPO, dual priming oligonucleotide) (Chun 等，Dualpriming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratoryviruses and SNP genotyping of CYP2C19gene， Nucleic Acid Research，35:6e40(2007))。雙重特異性寡核苷酸體現一種由雜交或退火通過分離區域相互分離的5』 -高Tm特異性部位(或5』 -第一次雜交部位、5』 -第一次引發部位)及3』 _低Tm特異性部位(或3』 -第二次雜交部位，3』 -第二次引發部位)雙重性地決定的新的概念，並表示顯著提高的雜交特異性(參照:W02006/095981 ;Kim 等，Direct detection of lamivudine-resistanthepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotideprimers,Journal of Virological Methods, 149:76-84 (2008);Kim 等，Rapid detectionand identification of12respiratory viruses using a dual priming oligonucleotidesystem-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, do1:10.1016/j.jviromet.2008.11.007 (2008) ;Horii 等，Use of dual priming oligonucleotidesystem to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinicalspecimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))。如上所述，上述雙重特異性寡核苷酸最終獲得具有相互不同的雜交特性的兩個片段，即，造成初期的穩定的雜交的5』 -第一次雜交部位及決定靶特異性的3』 -第二次雜交部位。上述雙重特異性寡核苷酸由於雙重性地決定雜交，因此，能夠顯示大大提高的雜交特異性。上述改性雙重特異性寡核苷酸結構是由上述雙重特異性寡核苷酸結構逆轉而成的，即，決定靶特異性的5』 -第二次雜交部位及造成初期的穩定的雜交的3』 -第一次雜交部位。僅在靶區分性探針的5』 -第二次雜交部位與靶核酸序列完整地進行雜交的情況下，通過具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶切割探針的5』 -末端，而這貢獻於靶區分性探針的驚人的靶特異性。本發明中，靶區分性探針在靶核酸序列的檢測，尤其在靶核酸序列的多重檢測中，向假陽性數據的去除以部分性地進行貢獻，這是由於靶區分性探針對靶核酸序列和非靶核酸序列明確地表示不同的雜交行為(behavior)。靶區分性探針與靶核酸序列進行雜交的情況下，靶區分性探針的5』 -第二次雜交部位及3』 -第一次雜交部位都與靶核酸形成雙鏈。靶區分性探針與非靶核酸序列進行雜交(即，非靶雜交或非靶結合)的情況下，其3』 -第一次雜交部位優勢性地與非靶核酸序列相結合，但5』 -第二次雜交部位及分離部位都不能與非靶核酸進行雜交，並形成單鏈。靶區分性探針與靶核酸序列進行雜交的情況下，其5』 -第二次雜交部位被具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶切割，第一標記(例如，猝滅分子)被分離，來發生信號變化。由於標有第二標記的核苷酸的抵抗 性，第二標記會殘留於固相基質上。因此，獲得一種信號變化，上述信號變化表示固相基質上的靶核酸序列的存在，並由此決定靶核酸序列的存在。相反，靶區分性探針與非靶核酸序列進行雜交的情況下，5』-第二次雜交部位及分離部位都形成單鏈，從而不會被具有5』 一3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶切割。在不會發生靶區分性探針的切割反應時，最終也不會發生信號變化。根據本發明的優選實例，第二標記位於靶區分性探針的5』 -第二次雜交部位。由於標有第二標記的核苷酸的抵抗性，在靶區分性探針與靶核酸序列雜交後進行切割的情況下，5』 -第二次雜交部位的第二標記也不會切割，並殘留於固相基質上。根據本法的優選實例，位於分離部位的通用鹼基選自脫氧肌苷(Deoxy inosine)、肌苷(inosine)、7_ 去氮-2』 -脫氧肌苷(7_diaza_2』-deoxy inosine)、2_ 氮雜 _2』 -脫氧肌苷(2_aza_2』-deoxy inosine)、2』 -甲氧基肌苷(2』 -OMe inosine)、2』 -F 肌苷(2』 -Finosine)、脫氧 3_ 硝基批咯(deoxy3_nitro pyrrole)、3_ 硝基批咯(3_nitro pyrrole)Λ2』 -甲氧基 3-硝基吡咯(2』 -0Me3-nitro pyrrole).-F3-硝基吡咯(2，-F3-nitropyrrole)、l- (2，-脫氧-β-D-呋喃核糖)_3_ 硝基卩比咯(1- (2，-deoxy-bata-D-Ribofuranose) -3-nitro pyrrole)Λ 脫氧 5_ 硝基批咯(deoxy5_nitro pyrrole)、5-硝基卩引哚(5-Nitro indole).-甲氧基 5-硝基吲哚(2』 -0Me5_Nitro indole)、2』 _F5_ 硝基吲哚(2』 -F5~Nitro indole)、脫氧 4_ 硝基苯並咪唑(deoxy4_Nitrobenzimidazole)、4-硝基苯並咪唑(4-Nitrobenzimidazole)、脫氧 4_ 氨基苯並咪唑(deoxy4-Aminobenzimidazole)、
4-氨基苯並咪唑(4-Aminobenzimidazole)、脫氧水粉蕈素(Deoxy nebularin)、2』 -F 水粉蕈素(2』 -F nebularin)、2』 _F4_ 硝基苯並咪唑(2』 -F4_Nitrobenzimidazole)、妝核酸-5-硝基卩引哚(PNA-5-1ntroindole)、肽核酸-水粉蕈素(PNA-nebularin)、肽核酸-肌苷(PNA-1nosine)、妝核酸-4-硝基苯並咪唑(PNA-4-Nitrobenzimidazole)、妝核酸 _3_ 硝基批咯(PNA-4-nitro pyrrole)、嗎啉基-5-硝基卩引哚(Morpholino-4-Nitro indole)、嗎啉基-水粉蕈素(Morpholino-nebularin)λ 嗎啉基-肌苷(Morpholino-1nosine)、嗎啉基-4-硝基苯並咪唑(Morpholino-4-Nitrobenzimidazole)、嗎啉基-3-硝基卩比咯(Morpholino-3-nitro pyrrole)、氨基憐酸酯-5-硝基卩引哚(phosphoramidate-5-Nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularin)、氨基磷酸酯-肌苷(phosphoramidate-1nosine)、氨基憐酸酯 ~4~ 硝基苯並咪唑(phosphoramidat-4-Nitrobenzimidazole)λ 氨基憐酸酯-3-硝基卩比咯(phosphoramidat-3-nitropyrrole)、2』 -O-甲氧基乙基肌苷(2』 -O-methoxyethyl inosine)、2』 -O-甲氧基乙基水粉蕈素(2』 -O-methoxyethyl nebularin)、2』 -O-甲氧基乙基5_硝基卩引哚(2』-0-methoxyethyl5_Nitro indole)、2』-O-甲氧基乙基 4_ 硝基苯並咪唑(2』-0_methoxyethyl4-Nitrobenzimidazole)、2』_0-甲氧基乙基3_硝基批咯(2』-0-methoxyethyl3_nitropyrrole)及由上述鹼基的組合組成的組中。更優選地，位於分離區域的通用鹼基是脫氧肌苷、1- (2』 -脫氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚，最優選為脫氧肌苷。分離部位包含核苷酸，該核苷酸優選地具有至少3個通用鹼基，更優選地具有至少4個通用鹼基，最優選地具有至少5個通用鹼基。分離部位包含連續的核苷酸，該核苷酸更優選地具有至少3個通用鹼基，進而優選地具有至少4個通用鹼基，最優選地具有至少5個通用鹼基。選擇性的，分離部位包含3-10、3-8、4-7或4-5連續的通用鹼基。

優選地，3』 -第一次雜交部位的長度比5』 -第二次雜交部位的長度長。3』 -第一次雜交部位優選地具有15-60核苷酸的長度，更優選地具有15-40核苷酸的長度，進而優選地具有15-30核苷酸的長度。5』 -第二次雜交部位優選地具有至少3核苷酸的長度，更優選地具有5核苷酸的長度，進而優選地具有6核苷酸的長度。5』 -第二次雜交部位優選地具有最大15核苷酸的長度，更優選地具有最大13核苷酸的長度，進而優選地具有12核苷酸的長度。5』 -第二次雜交部位優選地具有3-15核苷酸的長度，更優選地具有3-13核苷酸的長度，進而優選地具有4-12核苷酸的長度，最優選地具有5-11核苷酸的長度。分離部位優選地具有3-10核苷酸的長度，更優選地具有3-8核苷酸的長度，進而優選地具有4-7核苷酸的長度，最優選地具有4-5核苷酸的長度。5』 -第二次雜交部位及分離部位的長度優選地具有至少6核苷酸的長度，更優選地具有至少9核苷酸的長度，進而優選地具有至少12核苷酸的長度，最優選地具有至少15核苷酸的長度。根據本發明的優選實例，3』 -第一次雜交部位具有40°C -80°C^^Tm，優選為450C -70°C的Tm。5』 -第二次雜交部位優選地具有6°C _40°C的Tm，更優選為10°C _40°C的Tm。分離部位優選地具有2V -15°C的Tm，更優選為3°C -15°C的Tm。根據本發明的優選實例，第二標記位於靶區分性探針的5』 -第二次雜交部位。更優選地，5』 -第二次雜交部位上的第二標記位於從與5』 -第二次雜交部位的5』 -末端相結合的第一標記隔開2-15核苷酸的位點，更優選地，位於隔開2-10核苷酸的位點。根據本發明的優選實例，本發明所利用的靶核酸序列是一種通過擴增用引物進行預-擴增的核酸序列。利用預-擴增的核酸序列會增加本發明的靶檢測的敏感度和特異性。根據本發明的優選實例，反向引物或擴增用引物具有雙重引發寡核苷酸(DPO)結構。雙重引發寡核苷酸結構,如作為參照插入到如本說明書全文中的W02006/095981所述，與現有的弓I物相比，具有相當高的靶特異性。提及引物或探 針時所使用的術語「現有」意味著不具有改性雙重特異性寡核苷酸結構或雙重引發寡核苷酸結構的所有引物或探針。它們在本說明書中被說明為現有引物或現有探針。本發明很好地適用於至少兩種靶核酸序列的同步(多重)檢測。根據本發明的優選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優選地，包含至少3種，進而優選地，包含至少5種)，而探針(和/或反向引物)包含至少兩種探針(更優選地，包含至少3種，進而優選地，包含至少5種)。而且，本發明對核苷酸變異的檢測也非常有用。本說明書中所使用的術語「核苷酸變異(nucleotide variation)」意味著在連續的DNA片段或者序列類似的DNA片段中存在於特定位點的D NA序列的核苷酸的多樣性。這種連續的D NA片段包含一個基因或者一個染色體的某些其他部位。例如，可以通過本發明的方法而檢測的核苷酸變異包括單核苷酸多態性(SNP, single nucleotide polymorphism)、缺失、插入、置換及易位。核苷酸變異的例子包括:人類基因組的多種變異(例如，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase)基因的變異)、與病原體的藥物耐性相關的變異及癌產生-相關變異。根據本發明的優選實例，固定化探針包含與核苷酸變異互補的核苷酸或者相當於核苷酸變異的核苷酸。根據本發明的再一實施方式，本發明提供一種在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，該試劑盒包含:(a)，固相基質；(b)，固定化探針，其包含與上述靶核酸序列互補的核苷酸序列；通過上述固定化探針的3』 -末端在固相基質上進行固定化的上述固定化探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記；上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅；第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子；上述第一標記與上述固定化探針的5』 -末端相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸的鹼基相結合，這種上述第二標記的結合使上述核苷酸對上述DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性；以及(C)，上述DNA聚合酶，其具有5』 一3』外切核酸酶活性。本發明的試劑盒是為了實施上述的本發明的檢測方法製備的，為了避免本說明書的過度的複雜性，將省略其之間共同的內容。根據本發明 的優選實例，第一標記為猝滅分子，第二標記為報導分子。選擇性的，第一標記為報導分子，第二標記為粹滅分子。根據本發明的優選實例，第二標記通過被5』 一 3』外切核酸酶活性切割的固定化探針上的切割位點(cleavage site)從第一標記分離。優選地,第二標記位於從第一標記隔開2-20核苷酸的位點。進而優選地，第二標記位於從第一標記隔開4-15核苷酸的位點。根據本發明的優選實例，第一標記與固定化探針的5』 -末端的磷酸鹽基相結合。根據本發明的優選實例，第二標記在上述固定化探針中與胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧唳相結合。根據本發明的優選實例，具有5』 一3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶為具有5』 一 3』外切核酸酶活性的熱穩定性DNA聚合酶。根據本發明的優選實例，本試劑盒還包含反向引物，上述反向引物用於生成在固定化探針進行雜交的靶核酸序列。根據本發明的優選實例，固定化探針為祀區分性探針(target discriminativeprobe:TD probe)，上述靶區分性探針是對靶核酸序列和非靶核酸序列進行區分的，具有通式I的改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結構。優選地，本試劑盒還包含靶核酸序列擴增用引物套組，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。根據本發明的優選實例，靶核酸序列包含至少兩種的核酸序列，固定化探針包含至少兩種探針。優選地，靶核酸序列包括核苷酸變異。本發明的試劑盒可選擇性地包含在實施靶擴增聚合酶鏈式反應(PCR)(例如，聚合酶鏈式反應)時所需的如緩衝液、DNA聚合酶輔因子及脫氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等試齊U。選擇性地，本發明的試劑盒還可包含多種多聚核苷酸分子、反轉錄酶、多種緩衝液、試劑以及抑制DNA聚合酶活性的抗體。並且，本發明的試劑盒可包含實施陽性對照組及陰性對照組反應時所需的試劑。熟知本說明書的公開事項的本領域的技術人員能夠容易地決定在特定反應中所使用的試劑的最適量。典型的是，本發明的試劑盒由包含在前面揭示的組成成分的額外的包裝或者組分(compartment)而製備。
根據本發明的另一實施方式，本發明提供一種將對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性賦予給寡核苷酸的方法，該方法包括以下步驟:步驟(a)，決定上述寡核苷酸的核苷酸序列；以及步驟(b)，對上述寡核苷酸中的一個核苷酸的鹼基上結合有標記的寡核苷酸進行合成，由此,上述核苷酸對上述DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性。本發明是上述的檢測方法所利用的對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的鹼基標記核苷酸的抵抗性相關的，為了避免本說明書的過度的複雜性，將省略這兩者之間共同的內容。寡核苷酸的核苷酸序列能夠具有與靶核酸序列互補的序列。在核苷酸能夠與靶核酸序列進行特異性雜交的範圍內，核苷酸序列可具有相對於靶核酸序列的一個或一個以上的錯配核苷酸。根據本發明的優選實例，寡核苷酸為探針。寡核苷酸的合成能夠通過公開的現有的方法來實施(例如，Needham-VanDevanter等在Nucleic Acids Res.,12:6159-6168 (1984))中公開的利用自動合成器的固相亞磷醯胺酉旨的方法(solid phase phosphoramidite triester method,Beaucage and Caruthers,Tetrahedron Letts.,22 (20):1859-1862 (1981))。根據本發明的優選實例，具有與標記相結合的鹼基的核苷酸為寡核苷酸的內部核苷酸。

核苷酸鹼基成分和標記的結合能夠通過公開的現有方法來實施(Nelson，等，Nucleic Acids Research20 (23):6253-6259 (1992);美國專利第 4757141 號，美國專利第5559767 號及美國專利第 5231191 號；及 Haralambidis 等，Nucleic Acids Research, 15:4856-4876 (1987))。與標記相結合的鹼基成分包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及硫胺，優選為硫胺。基於標記的鹼基成分的標記優選地結合在除了靶核酸序列成為氫鍵的位點之外的位點。例如，標記能夠與硫胺的第5碳或第6碳相結合，優選地，與硫胺的第5碳的甲基相結合。對本發明的特徵及優點如下進行概括:(a)本發明利用寡核苷酸的核苷酸鹼基成分與標記的結合使寡核苷酸對DNA聚合酶的5』 一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的獨特的特徵。本發明與在固相進行固定化的探針上的雙重標記系統一同將此類獨特的特徵適用於靶檢測系統。在5』 -末端及內部部位具有標記的固定化探針與靶核酸序列進行雜交的情況下，固定化探針通過DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性,從5』 -末端向5』 一 3』方向逐漸被切割,來分離5』 -末端的標記。由於抵抗性，在鹼基成分進行標記的內部核苷酸中結束切割反應，結果，內部核苷酸的標記殘留於固相基質，最終提供顯示靶核酸序列的存在的信號變化。(b)本發明通過由內部核苷酸的鹼基成分的標記引起的DNA聚合酶的引物獨立性5』一 3』外切核酸酶活性的抵抗性，使第二標記殘留於固相基質上，因此，無需考慮固相基質上殘留第二標記的適合的點位。與此相反，利用DNA聚合酶的引物依賴性5』 一3』核酸酶活性的固相基質中的基於TaqMan探針的方法為了在固相基質上殘留第二標記，考慮反應條件，應嚴格決定第二標記的位點。
(c)本發明能夠自由決定探針上的內部標記的位點，因此，使標記位於適合對雙重標記系統的猝滅效率進行最大化的適合的探針上的位點，從而使本底信號最小化。(d)本發明中所使用的，作為優選探針的具有改性雙重特異性寡核苷酸結構的靶區分性探針是由現有探針與非靶核酸序列進行非特異雜交，因此，對一般產生的假陽性信號的去除進行部分性的貢獻。(e)利用相互作用性雙重標記的本發明能夠以終點方式或實時方式對固相中的信號變化(信號的減少或增加)進行檢測，並且，不僅能夠進行靶核酸序列的正常分析，還能進行定量分析。(f)本發明不僅通過探針及靶核酸序列之間的雜交，還通過酶反應(基於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性進行)提供信號變化。即，本發明的靶特異性進行雙重性的決定，從而成功解決由探針的非特異性雜交引起的假陽性結果問題。而且，本發明的循環反覆(cyclic repetition)使固定化探針提供信號變化，因此能夠使信號的變化程度最大化。(g)本發明與基於TaqMan探針方法不同，在不使用引物的情況下,僅用固定化的探針來實施。因此，本發明解決了多個寡核苷酸序列的決定及反應條件的最優化中的困難性及費用對比的非有效性之類的利用多個寡核苷酸的方法所表現的問題。此類的優點在多重靶檢測中顯得更為明確。(h)本發明中，由於固相基質上的固定化探針以物理方式分離，因此，即使利用一種雙重標記,也能在固相基質上同時檢測多個靶核酸序列。下面，將通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例僅用於更加具體說明本發明，根據本發明的宗旨，本發明的範圍不局限於這些實施例，這對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。實施例實施例1:對DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性的評價本發明者評價鹼基上結合有標記的核苷酸對DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性是否具有抵抗性。為了這種評價,將金黃色葡萄球菌(SA, Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸用作模板。將具有5』核酸酶活性的Taq、Tth及TflDNA聚合酶利用於5』 一 3』外切核酸切割反應(5，一 3』 exonucleolytic reaction)。並且,將雙重標記探針利用於該評價。上述探針具有突光報導分子(fluorescent reporter molecule, FAM),該突光報導分子與探針的5』 -末端的磷酸基(phosphate group) (SEQ ID NO:2)或胸腺卩密唳核苷的胸腺喃唳(thymine of a thymidine nucleotide) (SEQ ID NOs:3、4、5、6 及 7)相結合,而上述探針的3』-末端具有猝滅分子(BHQ-1)。本實施例中所利用的探針是由百思勤科技有限公司(美國)(Biosearch Technologies Inc.,USA)提供。將包含碳間隔區(C6spacer)的突光報導分子利用於探針(百思勤科技有限公司(美國))的製備。在本實施例中所利用的合成模板及探針的序列如下:SA-T5，-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3』 (SEQ ID N O:1)SA-Con-Ml
[FAM]TCAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1] (SEQ ID NO:2)SA-Con-DO (dT)「T(FAM) ICAATCATTCGGTTTACGGCGTTG「BHQ-11 (SEQ ID NO:3)SA-Con-Dl (dT ) G「T (FAM) I CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG「BHQ-11 (SEQ ID NO:4)SA-Con-D3 (dT) TGGΓΤ(FAM) ICAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1](SEQ ID NO:5)SA-Con-D5 (dT ) CGTGGΓΤ(FAM) I CAATCATTCGGTTTACGGCGTTG[BHQ-1](SEQ ID NO:6)SA-Con-D8 (dT) TTCCGTGGiT(FAM) ICAATCATTCGGTTTACGGCGTTG「BHQ-11 (SEQ IDNO:7)(下劃線部分的文字是指結合有螢光報導分子的胸腺嘧啶。)
以含有對於金黃色葡萄球菌(SA)的合成模板(SEQ ID NO:1) 0.5pmole、探針(SEQ ID N0s:2、3、4、5、6 或 7) 5pmole、10X 反應緩衝液(5mM MgCl2) 2 μ 1、各 50 μ M 三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)、Taq (索爾傑恩特公司，韓國:Solgent，Korea)、Tth (生物谷公司，英國:Epicentre Biotechnologies, US)或 TfIDNA 聚合酶(生物谷公司，英國:EpicentreBiotechnologies, US)2單元(unit)的20 μ I的最終體積實施了反覆性外切核酸切割反應。將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環器(CFX96，伯樂公司:Bio-Rad)。將上述反應混合物在95 °C內進行2分鐘的改性，並在95 °C中進行20秒鐘，在55 °C中進行20秒鐘，並將此過程反覆進行50次。在各個周期的55°C中檢測信號。如圖2、圖3及圖4所示，在靶核酸存在的情況下，位於5』 -末端的磷酸基與螢光報導分子相結合的探針(SEQ ID NO:2)產生螢光信號。但是，即使靶核酸存在，在胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶結合螢光報導分子的探針(SEQ ID NOs:3、4、5、6及7)也不會產生螢光信號。在沒有IE核酸的情況下，未產生突光信號。此類結果表示，在鹼基具有標記的核苷酸對DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性。實施例2:利用雙重標記探針及對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性的微陳列上的靶核酸序列的檢測本發明者在利用雙重標記探針的固相中的靶核酸序列檢測中，適用鹼基與標記結合的的核苷酸的抵抗性。具有5』核酸酶活性的TaqDNA聚合酶利用於5』 一 3』外切核酸切割反應。雙重標記探針在其5』 -末端具有猝滅分子(BHQ-2)，並在內部具有與胸腺嘧啶核苷的胸腺卩密卩定相結合的突光報導分子(Quasar570 )。利用包含碳間隔區(C6spacer )的Quasar570製備上述探針(百思勤科技有限公司，美國:Biosearch Technologies Inc.,USA)。通過追加性插入的碳間隔區(C6spacer)，來結合BHQ-2。利用位於探針的3』-末端的氨基(AminnoC7)，將探針固定於載玻片上。利用位於3』-末端的氨基將在5』-末端具有突光報導分子(Quasar570)的標記探針固定於載玻片上。將對於黃金色葡萄球菌的合成寡核苷酸用作模板。本實施例中所利用的合成模板、雙重標記探針及標記的序列如下:SA-T5』 -GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGA TTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3』 (SEQ ID NO:1)SA-Con-M[BHQ-2] [C6spacer] TCATTCCG ΓΤ (Quasar570) IGGTCAATCATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCT TTTT[AminoC7] (SEQ ID NO:8)Marker[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7] (SEQ ID NO:9)(下劃線部分的文字是指結合有螢光報導分子的胸腺嘧啶。)將NSB9NHS載玻片(NSB浦項科技有限公司，韓國:NSB POSTECH, Korea)用於上述雙重標記探針(SEQ ID NO:8)及標記(SEQ ID NO:9)的製備。將利用NSB測定位點緩衝液(NSB spotting buffer)溶解成最終濃度為50 μ M的上述雙重標記探針及標記，利用 PersonalArrayer 16 微陳列點樣儀(Microarray Spotter)(博奧生物:CapitalBio,China:中國)印刷在NSB9NHS載玻片上。將上述雙重標記探針及標記以2 X I格式(雙重點duplicate spots)並行了測定點位(spotting),將由此製備的載玻片在約85%的溼度的培養皿中培養一宿。為了去除非特異性結合的雙重標記探針及標記，在37°C下，用含有 2XSSPE (0.3M 氯化鈉(sodium chloride), 0.02M 憐酸氫鈉(sodium hydrogenphosphate)及 2.0m M 乙二胺四乙酸(EDTA，ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID))及 7.0mM十二烷基硫酸鈉(SDS =Sodium dodecyl sulfate)的pH7.4緩衝液溶液中，對上述載玻片進行30分鐘清洗之後用蒸餾水清洗。隨後，利用玻片離心分離器，對上述DNA-功能化(DNA-functionalized)的載玻片進行乾燥,保管在4°C的暗室內以備後用。以含有對於金黃色葡萄球菌(SA)的合成模板(SEQ ID NO:1) 10pmole、10X反應緩衝液(6mM MgCl2) 3 μ 1、各200 μ M三磷酸脫氧核苷酸及Diastar-TaqDNA聚合酶(索爾傑恩特公司，韓國:Solgent, Korea) 1.2單元的30 μ I的最終體積，實施了反覆性外切核酸切割反應。將上述整體混合物適用於由上述雙重標記探針(SEQ ID NO:8)進行交聯(cross-linked)的載玻片的表面上組裝的培養皿。利用原處(in situ)塊方式使載玻片位於熱循環儀(基因擴增儀B4I,中國:Genepro B4I,China)。如下實施上述反應:在95°C下進行2分鐘的改性及在55°C下進行60分鐘的改性，最終，將上述載玻片在100°C下利用蒸餾水清洗I分鐘。分別進行清洗後，利用共聚焦雷射掃描儀Axon Genepix4100A (分子器件，美國:Molecular Device, USA),並通過10_μ m像素解析度的掃描獲取了各個載玻片的圖像。利用定量的微陣列分析軟體GenePix pro6.0軟體(分子器件,美國:Molecular Device,USA)分析了螢光強度。去除周邊本底後用點-中央值表示螢光強度。為了勘察再現性，按每兩個點進行測定點位。用2個點的平均值表示了螢光強度。如圖5所示，在存在靶核酸的情況下，產生螢光信號(RFU:6486±0.7)。在沒有靶核酸的情況下，未產生突光信號。實施例3:利用雙重標記靶區分性(TD)探針及對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性的微陳列上的靶核酸序列的檢測本發明者在利用雙重標記靶區分性探針的固相中的靶核酸序列檢測中，適用對於鹼基與標記相結合的核苷酸DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性。具有5』核酸酶活性的TaqDNA聚合酶利用於5』 一 3』外切核酸切割反應。雙重標記探針在其5』 -末端具有猝滅分子(BHQ-2)，並具有與位於5』 -第二次雜交部位的內部胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相結合的螢光報導分子(Quasar570)。利用包含碳間隔區(C6spacer)的Quasar570製備上述探針(百思勤科技有限公司，美國:BiosearchTechnologies Inc., USA)。通過追加性插入的碳間隔區(C6spacer),來結合BHQ-2。利用位於靶區分性探針的3』-末端的氨基(AminnoC7)，將靶區分性探針固定於載玻片上。利用位於3』 -末端的氨基,將在5』 -末端具有突光報導分子(Quasar570)的標記探針固定於載玻片上。將黃金色葡萄球菌的合成寡核苷酸用作模板。本實施例中所利用的合成模板、雙重標記TD探針及標記的序列如下:SA-T5，-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3』 (SEQ ID NO:1)SA-TD-M [BHQ2] [C6spacer] TCATTCCG ΓΤ (Quasar570) IGGI11IICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7] (SEQ ID NO:10)Marker[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7] (SEQ ID NO:9)(下劃線部分的文字是指結合有螢光報導分子的胸腺嘧啶。)將NSB9NHS載玻片(NSB浦項科技有限公司，韓國:NSB POSTECH, Korea)用於上述雙重標記靶區分性探針(SEQ ID NO:10)及標記(SEQ ID N0:9)的製備。將利用NSB測定位點緩衝液(NSB spotting buffer)溶解成最終濃度為50 μ M的上述雙重標記靶區分性探針及標記，利用PersonalArrayer 16微陳列點樣儀(Microarray Spotter)(博奧生物:CapitalBio, China:中國)印刷在NSB9NHS載玻片上。將上述雙重標記靶區分性探針及標記以2X1格式(雙重點:duplicate spots)並行了測定點位(spotting),將由此製備的載玻片在85%的溼度的培養皿中培養一宿。為了去除非特異性結合的雙重標記靶區分性探針及標記，在37°C下，用含有2X SSPE (0.3M氯化鈉，0.02M磷酸氫鈉及2.0mM乙二胺四乙酸)及7.0mM十二烷基硫酸鈉的pH7.4緩衝液溶液中，對上述載玻片進行30分鐘清洗之後用蒸餾水清洗。隨後，利用玻片離 心分離器，對上述DNA-功能化(DNA-functionalized)的載玻片進行乾燥，保管在4°C的暗室內以備後用。以含有對於金黃色葡萄球菌(SA)的合成模板(SEQ ID NO:1) IOpmoleUOX反應緩衝液(6mM MgCl2) 3 μ 1、各200 μ M三磷酸脫氧核苷酸及Diastar-TaqDNA聚合酶(索爾傑恩特公司，韓國:Solgent, Korea) 1.2單元的30 μ I的最終體積,實施了反覆性外切核酸切割反應。將上述整體混合物適用於由上述雙重標記靶區分性探針(SEQ ID Ν0:10)進行交聯(cross-linked)的載玻片的表面上組裝的培養皿。利用原處(in situ)塊方式使載玻片位於熱循環儀(基因擴增儀B4I,中國:Genepro B4I,China)。如下實施上述反應:在95°C下進行2分鐘的改性及在55°C下進行60分鐘的改性，最終，將上述載玻片在100°C下利用蒸餾水清洗I分鐘。分別進行清洗後，利用共聚焦雷射掃描儀Axon Genepix4100A (分子器件，美國:Molecular Device, USA),並通過10-μ m像素解析度的掃描獲取了各個載玻片的圖像。利用定量的微陣列分析軟體GenePix pro6.0軟體(分子器件,美國:Molecular Device,USA)分析了螢光強度。去除周邊本底後用點-中央值表示螢光強度。為了勘察再現性，按每兩個點進行測定點位。用2個點的平均值表示了螢光強度。如圖6所示，在存在靶核酸的情況下，產生螢光信號(RFU:65486±0.0)。在沒有靶核酸的情況下，未產生突光信號。對本發明的優選實例進行了詳細記述，可以進行根據本發明的原理的變形及修改，本發明的範圍根據所附的權利要求書及其等同替代而定義，這對於本發明所屬的技術領域的普通技術人員來 說是顯而易見的。
權利要求
1.一種在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟(a)，將上述靶核酸序列與固定化探針進行雜交；上述固定化探針包括與上述靶核酸序列互補的核苷酸序列；通過3』 -末端在固相基質上進行固定化的上述探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記；上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅；第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子；上述第一標記與上述固定化探針的5』 -末端相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸鹼基相結合，這種上述第二標記的結合使上述核苷酸對上述DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性； 步驟(b)，在切割上述固定化探針的條件下，使上述步驟(a)的結果物與具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接觸；與上述靶核酸序列互補的上述固定化探針通過上述DNA聚合酶的外切核酸切割反應被切割，使得上述第一標記從上述固定化探針分離，來引起在上述固相基質上實現的信號變化； 步驟(C)，在標有上述第二標記的上述核苷酸中結束上述DNA聚合酶的上述外切核酸切割反應；上述外切核酸切割反應的結束被具有與上述第二標記相結合的鹼基的上述核苷酸的抵抗性誘導，上述第二標記殘留於上述固相基質上；以及 步驟(d)，對上述固相基質上的信號變化進行檢測；通過上述固定化探針的上述切割而引起的上述信號變化表示上述靶核酸序列的存在。
2.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於， 上述第一標記為猝滅分子； 上述第二標記為報導分子。
3.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於， 上述第一標記為報導分子； 上述第二標記為猝滅分子。
4.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述第二標記通過被5』 一 3』外切核酸酶活性切割的固定化探針上的切割位點，從上述第一標記分離。
5.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述第二標記位於從上述第一標記隔開2-20核苷酸的位點。
6.根據權利要求5所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述第二標記位於從上述第一標記隔開4-15核苷酸的位點。
7.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針， 從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述第一標記與上述固定化探針的5』 -末端的磷酸鹽基相結合。
8.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述第二標記在上述固定化探針中與胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相結合。
9.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述方法在反覆循環之間包括變性過程，還包括至少反覆進行上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)-步驟(c)的步驟。
10.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述步驟(d)的上述檢測以實時方式、終點方式或預定時間間隔方式實施。
11.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，具有上述5』 一 3』外切核酸酶活性的上述DNA聚合酶是具有5』 一 3』外切核酸酶活性的熱穩定性DNA聚合酶。
12.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述步驟(a)中還包含反向引物，上述反向引物用於生成與上述固定化探針進行雜交的上述靶核酸序列。
13.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述固定化探針是具有用於區分靶核酸序列和非靶核酸序列的以下通式I的改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結構的靶區分性探針: `5，-V -V -V -V (I) 在上述通式中， Vp是具有與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列的5』 -第二雜交部位； Y』 q是包含至少3個通用鹼基的分離部位； Vr是具有與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列的3』 -第一次雜交部位； 上述靶區分性探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記，上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅； 上述第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子； 上述第一標記與上述5』 -第二次雜交部位的5』 -末端`相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸的鹼基相結合； P、q及r表示核苷酸的數量,並且，X』、Y』及`Z』是DNA或核糖核酸； 上述5』 -第二次雜交部位的Tm比上述3』 -第一次雜交部位的Tm低，上述分離部位在上述V p、Y』 q、V r3個部位中具有最低的Tm ； 上述分離部位在對於上述靶核酸序列的雜交方面，使上述5』 -第二次雜交部位從3』_第一次雜交部位分離，由此，上述靶區分性探針的雜交特異性藉助上述5』-第二次雜交部位及上述3』 -第一次雜交部位來雙重性地決定，其結果，提高上述靶區分性探針的整體雜交特異性； 上述靶區分性探針與上述靶核酸序列進行雜交的情況下，上述5』 -第二次雜交部位及上述3』 -第一次雜交部位都與上述靶核酸序列進行雜交，上述5』 -第二次雜交部位的5』 -末端通過上述DNA聚合酶的外切核酸切割反應被切割，上述第一標記從上述靶區分性探針分離，來引起上述固相基質上實現的信號變化； 通過具有與上述第二標記相結合的鹼基的上述核苷酸的抵抗性，上述第二標記殘留於上述固相基質上； 上述靶區分性探針與非靶核酸序列進行雜交的情況下，上述5』 -第二次雜交部位及上述分離部位都形成單鏈，上述5』 -第二次雜交部位不被DNA聚合酶切割，因此，不會引起上述固相基質上的信號變化，由此，上述靶區分性探針對上述靶核酸序列及非靶核酸序列進行區分，上述固相基質上實現的上述信號變化表示上述靶核酸序列的存在。
14.根據權利要求13所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述第二標記存在於上述5』 -第二次雜交部位。
15.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
16.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於， 上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列； 上述固定化探針包含至少兩種探針。
17.根據權利要求1所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
18.—種在固相利用對DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，包含: (a),固相基質； (b)，固定化探針，其包含與上述靶核酸序列互補的核苷酸序列；通過上述固定化探針的3』 -末端在固相基質上進行固定化的上述固定化探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記；上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅；第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子；上述第一標記與上述固定化探針的5』 -末端相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸的鹼基相結合，這種上述第二標記的結合使上述核苷酸對上述DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性；以及 (C)，上述DNA聚合酶，其具有5』 一 3』外切核酸酶活性。
19.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於， 上述第一標記為猝滅分子； 上述第二標記為報導分子。
20.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於， 上述第一標記為報導分子； 上述第二標記為猝滅分子。
21.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述第二標記通過被5』 一3』外切核酸酶活性切割的固定化探針上的切割位點，從第一標記分離。
22.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述第二標記位於從上述第一標記隔開2-20核苷酸的位點。
23.根據權利要求22所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述第二標記位於從上述第一標記隔開4-15核苷酸的位點。
24.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述第一標記與上述固定化探針的5』 -末端的磷酸鹽基相結合。
25.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述第二標記在上述固定化探針中與胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相結合。
26.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，具有上述5』 一 3』外切核酸酶活性的上述DNA聚合酶是具有5』 一 3』外切核酸酶活性的熱穩定性DNA聚合酶。
27.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述試劑盒還包含反向引物，上述反向引物用於生成與上述固定化探針進行雜交的上述靶核酸序列。
28.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述固定化探針是具有用於區分靶核酸序列和非靶核酸序列的以下通式I的改性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結構的靶區分性探針: .5，-V -V -V -V (I) 在上述通式中， Vp是具有與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列的5』 -第二雜交部位； Y』 q是包含至少3個通用鹼基的分離部位； Vr是具有與上述靶核酸序列互補的雜交核苷酸序列的3』 -第一次雜交部位； 上述靶區分性探針具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性雙重標記，上述相互作用性雙重標記位於上述固定化探針，用於誘導上述報導分子及上述猝滅分子間的能量猝滅； 上述第一標記及第二標記選自上述報導分子及上述猝滅分子； 上述第一標記與上述5』 -第二次雜交部位的5』 -末端相結合，上述第二標記與位於上述第一標記的下遊的核苷酸鹼基相結合； P、q及r表示核苷酸的數量,並且，X』、Y』及Z』是DNA或核糖核酸； 上述5』 -第二次雜交部位的Tm比上述3』 -第一次雜交部位的T1JS，上述分離部位在上述V p、Y』 q、V r3個部位中具有最低的Tm ； 上述分離部位在對於上述靶核酸序列的雜交方面，使上述5』 -第二次雜交部位從上述3』_第一次雜交部位分離，由此，上述靶區分性探針的雜交特異性藉助上述5』-第二次雜交部位及上述3』 -第一次雜交部位來雙重性地決定，其結果，提高上述靶區分性探針的整體雜交特異性； 上述靶區分性探針與上述靶核酸序列進行雜交的情況下，上述5』 -第二次雜交部位及上述3』 -第一次雜交部位都與上述靶核酸序列進行雜交，上述5』 -第二次雜交部位的5』 -末端通過上述DNA聚合酶的外切核酸切割反應被切割，上述第一標記從上述靶區分性探針分離，來引起上述固相基質上的信號的變化； 通過具有與上述第二標記相結合的鹼基的上述核苷酸的抵抗性，上述第二標記殘留於上述固相基質上； 上述靶區分性探針與非靶核酸序列進行雜交的情況下，上述5』 -第二次雜交部位及上述分離部位都形成單鏈，上述5』 -第二次雜交部位不被DNA聚合酶所切割，因此，不會引起上述固相基質上的信號的變化，由此，上述靶區分性探針對上述靶核酸序列及非靶核酸序列進行區分，上述固相基質上實現的上述信號變化表示上述靶核酸序列的存在。
29.根據權利要求28所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述第二標記存在於上述5』 -第二次雜交部位。
30.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於， 上述試劑盒還包含上述靶核酸序列擴增用引物組； 上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
31.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於， 上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列； 上述固定化探針包含至少兩種探針。
32.根據權利要求18所述的在固相利用對DNA聚合酶的5』一3』外切核酸酶活性具有抵抗性的雙重標記探針，從DNA或核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
33.一種將對於DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性的抵抗性賦予給寡核苷酸的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟(a)，決定上述寡核苷酸的核苷酸序列；以及 步驟(b)，對上述寡核苷酸中的一個核苷酸的鹼基上結合有標記的寡核苷酸進行合成，由此，上述核苷酸對上述DNA聚合酶的5』 一 3』外切核酸酶活性具有抵抗性。
34.根據權利要求33所述的將對於DNA聚合酶的5』一 3』外切核酸酶活性的抵抗性賦予給寡核苷酸的方法，其特徵在於，具有結合上述標記的上述鹼基的上述核苷酸為上述寡核苷酸的內部 核苷酸。
全文摘要
本發明涉及利用雙重標記固定化探針及該雙重標記固定化探針對於DNA聚合物的5』→3』外切核酸酶活性的抵抗性，在固相檢測靶核酸序列的新穎方法。本發明中，由於通過內部核苷酸鹼基成分的標記引發的對於核酸酶的抵抗性，使標記殘留在固相基質上，因此，無需考慮在固相基質上使標記殘留的適合的位點。本發明由於能夠自由決定探針上的內部標記的位點，因此，將標記位於使探針上的雙重標記系統的猝滅效率最大化的適合的位點，從而使本底信號最小化。
文檔編號C12Q1/68GK103228797SQ201180050984
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月20日 優先權日2010年10月22日
發明者千鍾潤 申請人:Seegene株式會社