新的藥物組合物的製作方法

2023-06-15 23:59:46 2

專利名稱：新的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有促紅細胞生成素，在適合將溶液pH保持在大約5.5至大約7.0範圍的藥學可接受緩衝劑中的多電荷無機陰離子，和任選地，一種或多種藥學可接受賦形劑的液體藥物組合物。該組合物特別有用於與紅細胞生成相關疾病的預防和治療。
紅細胞生成是產生紅細胞，其發生抵消細胞破壞。紅細胞生成是一種受控生理機理，其使得正常組織氧化作用可獲得足夠的紅細胞。腎中產生天然存在的人促紅細胞生成素(hEPO)，並且人促紅細胞生成素是體液血漿因子，其刺激紅細胞產生(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143432；Erslev，AJ(1953血液(Blood)8349；Reissmann，KR(1950)Blood 5372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，Freid，W和Plzak，LF(1957)自然(Nature)1796331-4)。天然存在的EPO刺激骨髓中定向紅細胞祖先的分裂和分化，並且通過與紅細胞類原代上的受體結合而表現出其生物活性(Krantz，BS(1991)Blood 77419)。
應用重組DNA技術(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(1986)免疫生物學(Immunobiol.)72213-224)通過生物合成製備了促紅細胞生成素，其是克隆的人EPO基因插入中國倉鼠卵巢組織細胞(CHO細胞)中並且表達的產物。SEQ ID NO1中描述了hEPO的主要的，完全加工的形式的一級結構。Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之間有兩個二硫鍵。沒有糖基的EPO多肽鏈的分子量是18,236Da。在完整的EPO分子中，分子量的大約40％來自碳水化合物基團，其在蛋白質的糖基化位點將蛋白質糖基化(Sasaki，H，Bothner，B，Dell，A和Fukuda，M(1987)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)26212059)。
因為人促紅細胞生成素在紅細胞形成中是必需的，該激素在特徵在於低或者有缺陷的紅細胞產生的血液病的治療中是有用的。臨床上，對慢性腎衰竭患者(CRF)(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR等(1987)NEJM31673-78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK等(1989)Ann.Intern.Med.111992；Egrie，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)Kidney Intl.33262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D等(1989)Ann.Intern.Med.110108-114)和愛滋病和接受化學治療的癌症患者(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI InMB，Garnick，編著，EPO的臨床應用-國際觀察(Erythropoietin in ClinicalApplications-An International Perspective).New York，N.Y.MarcelDekker；1990p.301-324)的貧血的治療使用EPO。
已知的藥物組合物具有下面缺點的至少一項—它們是凍乾物。除了製備方法複雜之外，凍乾物具有在注射給人體之前要重新溶解配製的缺點。這使得醫藥人員必須額外操作，不方便而且有對藥物產物操作不恰當的危險；—它們含有作為添加劑的人血清白蛋白。因為人血清白蛋白是從人體液衍生的產物，有白蛋白製劑中汙染物帶來的病毒感染的危險。此外，變應性反應是可能的；-現存所有商售促紅細胞生成素組合物在升高的溫度下，即高於通常在2℃和8℃之間的冰箱溫度時，是不穩定的。因此，它們必須在冰箱(2-8℃)中保存，並且不能在室溫(大約20℃)下保存。這導致在低溫下貯存和運輸帶來的成本的增加，並且還在藥物產品的操作中引起不方便。在本說明書的上下文中，所謂不穩定指在升高的溫度例如25℃下長期貯存(即幾個月，或者多於6個月)導致蛋白質降解。在本說明書中，所謂降解描述的是已知優選在升高的溫度(高於8℃)下發生的蛋白分子的物理變化(例如聚集和變性)和化學變化(例如一般來說化學鍵的氧化或修飾)。在接近或者高於其轉變溫度(transition temperature)(也稱為解鏈溫度)下溫育一種蛋白質導致該蛋白質的解摺疊，即該多肽失去了天然結構和生物活性。轉變溫度與蛋白質的溫度穩定性密切相關，並且取決於蛋白質的環境(例如pH，鹽，離子強度，緩衝物質等)。例如，變性可以導致促紅細胞生成素分子的聚集，即二聚體(共價或者非-共價)，更高級聚集體和甚至顆粒的的形成。這導致藥物效力降低並且在對人注射之後可能引起不期望的副作用。
因此，本發明要解決的問題是提供能最小化或克服上述缺點的組合物。
根據本發明，通過提供含有促紅細胞生成素，在pH是大約5.5至大約7.0的緩衝溶液中的多電荷無機陰離子，和任選地，一種或多種藥學可接受賦形劑的藥物組合物解決了所述問題。
令人驚奇地發現在這種組合物中配製促紅細胞生成素改進了其在高於冰箱(2-8℃)，特別是在室溫下(即低於25℃)，甚至在更高溫度例如40℃下的穩定性。這意味著所述組合物不冷卻就能夠長時期貯存，而活性沒有明顯降低，並且沒有明顯降解。
除非另有說明，提出下面的定義描述和定義這裡用來描述本發明的各種術語的定義和範圍。
術語″多電荷無機陰離子″指每個分子具有兩個或多個負電荷的無機陰離子，例如硫酸根SO42-，或者磷酸根陰離子，即磷酸氫根HPO42-。加入的多電荷無機陰離子可以是其相應鹽例如鈉鹽，鉀鹽及其混合物形式，和/或緩衝物質，例如磷酸緩衝液形式。
術語″等滲或等張″指能夠與體液混合而不影響其成分的溶液。與血液等滲的溶液，例如0.9％氯化鈉，和血清具有相同的滲透壓，並且它們不影響紅細胞的膜。一般情況下，與血液等滲的溶液是大約290mosm/kg H2O。
術語″強無機酸″指在1N溶液，例如H2SO4中表現出20至100％解離的無機酸。
這裡使用的術語″藥學可接受的″是指緩衝劑或者鹽從毒性角度來說是可接受的。
術語″稀釋劑″指藥物製劑中沒有藥理活性但是是藥學上必需或期望的成份。例如稀釋劑可以是用來溶解要注射的藥物的液體，例如水。
術語″溶劑″指將另一種物質保持在溶液中，即將其溶解的液體，例如水。
術語″防腐劑″指加給藥物組合物防止細菌生長的物質，例如潔爾滅或者苯甲醇。
術語″多元醇″指具有多個羥基的任何物質，包括多羥基醇和碳水化合物。多羥基醇包括這樣的化合物如山梨糖醇，甘露糖醇和甘油。碳水化合物是可以具有酮基或醛基的環狀分子，象例如蔗糖或者海藻糖。
術語″促紅細胞生成素″或者″促紅細胞生成素蛋白″指具有引起骨髓細胞提高網狀細胞和紅細胞生產的體內生物活性的蛋白質，並且選自人促紅細胞生成素和下面定義的類似物。
術語″聚乙二醇基化促紅細胞生成素(Peg-EPO或者PEG-EPO)″指與一種至三種如下所述聚乙二醇(polyethylene)衍生物共價連接的促紅細胞生成素蛋白。
術語″裝置″指用於特定目的的發明物。在本發明中，該目的是使，支持或者有利於施用液體藥物組合物。


圖1人EPO的一級結構(165胺基酸)(SEQ ID NO1)。
圖2人EPO的一級結構(166胺基酸)(SEQ ID NO2)。
圖3pH對熱穩定性的影響。轉變溫度對pH作圖。
圖4離子強度對熱穩定性的影響。轉變溫度對磷酸根濃度作圖。
圖5熱穩定性對緩衝物質的依賴性。
圖6說明在低pH(例如pH6.2)時，硫酸根也是一種合適的緩衝劑/添加劑，而與pH7.5相比，磷酸根在pH6.2下較不合適。這表明即使是在低pH時，硫酸根也能保持熱穩定性高。
圖7peg-EPO聚集對pH的依賴性。通過SDS-PAGE分析熱應力(如上所述)之後的Peg-EPO樣品。用銀對蛋白質染色。泳道1分子量標準。泳道2pH5。泳道3pH5，還原的。泳道4pH6。泳道5pH6，還原的。泳道6pH6.5。泳道7pH6.5，還原的。泳道8pH7。泳道9pH7，還原的。泳道10peg-EPO，沒有應力的。
圖8說明1mg/ml乙醯基半胱氨酸作為抗氧化劑防止熱應力下聚集物形成的用途。pegEPO在熱應力下(20分鐘80℃)的聚集作用泳道1pH7.5下的pegEPO，沒有應力；泳道2pH7.5下的pegEPO，有應力；泳道3pH6.2下的pegEPO，有應力；泳道4pH6.2下的pegEPO，有應力，還原的；泳道5pH7.5下的pegEPO，+1mg/ml N-乙醯基-半胱氨酸，應力；泳道6pH7.5下的pegEPO，+1mg/ml N-乙醯基-半胱氨酸，應力，還原的。
圖9各種溫度下貯存六個月的新配方中peg-EPO樣品的唾液酸(NANA)含量。
圖10在10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2中在幾個溫度下貯存6個月之後，peg-EPO樣品的小鼠生物活性測定。
圖11在10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2中貯存6個月的peg-EPO樣品的大小排阻色譜覆蓋圖(底部至頂部緩衝劑，起始材料，4℃，25℃，30℃和40℃)。
更具體地，本發明涉及含有促紅細胞生成素蛋白，在適合將溶液pH保持在大約5.5至大約7.0範圍的藥學可接受緩衝劑中多電荷無機陰離子，和任選地，一種或多種藥學可接受賦形劑的液體藥物組合物。
在優選的實施方案中，所述組合物是液體溶液，例如水溶液。在本發明優選的實施方案中，上述藥物組合物是等滲溶液。
陰離子優選選自無機強酸的陰離子，例如H2SO4，H3PO4或者檸檬酸。因此，優選的陰離子選自硫酸根，磷酸根和檸檬酸根，優選硫酸根或磷酸根，並且最優選硫酸根。多電荷無機陰離子的濃度可以自10至200mmol/l變化，例如10至200mmol/l之間的硫酸根陰離子。
本發明所用來保持pH在大約5.5至大約7.0的範圍內，優選在5.8至6.7的範圍內，更優選在6.0至6.5的範圍內，最優選大約pH6.2的緩衝劑可以是常規有機酸或無機酸緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝劑，精氨酸/H2SO4/Na2SO4緩衝劑，或者任何其它的藥學可接受緩衝劑體系)。在優選的實施方案中，組合物包括磷酸鹽或者精氨酸/H2SO4/Na2SO4緩衝劑，更優選10至50mmol/l磷酸鹽緩衝劑。當然，這些緩衝劑體系的組合也是本發明的部分。可以分別使用磷酸鹽緩衝體系中相應的鹼例如NaOH和精氨酸緩衝體系中相應的酸例如硫酸來調節pH。
本發明的藥物組合物可以含有一種或多種藥學可接受賦形劑。這些藥學可接受賦形劑可以選自藥學可接受鹽，稀釋劑和/或溶劑和/或防腐劑等，例如張度劑(使等滲劑)，多元醇，抗氧化劑或者非離子去汙劑。這些物質的例子是氯化鈉，氯化鈣，山梨糖醇，甘露糖醇，甘油，蔗糖，海藻糖，乙醯半胱氨酸，多乙氧基醚20(polysorbate 20)，多乙氧基醚80(polysorbate 80)，或者pluronic F68。
在本發明優選的實施方案中，藥物組合物可以含有選自甘露糖醇，山梨糖醇，甘油，海藻糖和蔗糖的多元醇，優選甘露糖醇的多元醇。多元醇的濃度可以在1和10％(w/v)之間變化。
抗氧化劑的例子是半胱氨酸，蛋氨酸，乙醯半胱氨酸或者抗壞血酸，優選蛋氨酸。通常可以以0.01和0.5％(w/v)之間的濃度加入氧化劑，或者，例如在蛋氨酸的情況下，以1-20mM的濃度加入。
還有，上述組合物可以任選地含有0.01至大約0.9％w/w的使等滲劑。這些化合物是本領域公知的；這些試劑的例子是氯化鈉或硫酸鈉。在本發明優選的實施方案中，組合物是等滲溶液。上述組合物還可以含有非離子去汙劑，象多乙氧基醚20，多乙氧基醚80，或者pluronic F68，優選pluronic F 68，例如多達1％(w/v)，更優選多達0.1％(w/v)，例如0.001％至0.01％(w/v)。
上述組合物還可以含有另外的鹽，例如多達1mmol/l CaCl2。
本發明特別用於製備含有促紅細胞生成素作為藥物活性成分的藥物組合物。術語″促紅細胞生成素″或者″促紅細胞生成素蛋白″或者″EPO″是如下的特別地，該術語指糖蛋白，例如人促紅細胞生成素，例如具有(SEQ IDNO1)或(SEQ ID NO2)列出的胺基酸序列或者基本上與其同源的其生物學性質與骨髓中紅細胞產生刺激和定向紅細胞祖先(committederythroid progenitors)的分裂和分化刺激有關的胺基酸序列。在這裡使用時，這些術語包括例如通過定點誘變或者偶然突變故意修飾的這樣的蛋白質。這些術語還包括具有1-6個另外的糖基化位點的類似物，在糖蛋白的羧基末端具有至少一個另外的胺基酸的類似物，其中說述另外的胺基酸包括至少一個糖基化位點，和具有包括至少一個糖基化位點重排的胺基酸序列的類似物。這些術語包括天然和重組製備的人促紅細胞生成素。
如下面詳細說明的，EPO的製備和純化是本領域公知的。所謂促紅細胞生成素產物是指天然的或者重組蛋白產物，優選人的，從任何常規來源獲得，例如組織，蛋白質合成，使用天然或者重組細胞的細胞培養。包括具有促紅細胞生成素活性的任何蛋白質，例如突變蛋白或者以其它方式的修飾的蛋白質。重組體EPO可以通過重組DNA技術或者通過內源基因激活通過在CHO-，BHK-或者HeLa細胞系中表達來製備。蛋白質的表達，包括，通過內源基因激活，是本領域公知的並且公開於例如美國專利號5,733,761，5,641,670，和5,733,746，和國際專利公開號WO93/09222，WO94/12650，WO95/31560，WO90/11354，WO91/06667和WO91/09955，各專利內容在此引作參考。用於製備促紅細胞生成素糖蛋白產物的優選的EPO物種(species)是人EPO物種。更優選地，所述EPO物種是具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2給出的胺基酸序列，更優選胺基酸序列SEQ ID NO1的人EPO。
此外，促紅細胞生成素可以是具有1-6個另外的糖基化位點的糖蛋白類似物。蛋白質的糖基化作用，帶有一個或多個寡糖基團，發生在沿著多肽主鏈的特定位置，並且極大地影響該蛋白質的物理性質例如蛋白質穩定性，分泌，亞細胞定位，和生物活性。糖基化作用通常有兩種類型。O-鍵聯的寡糖連接絲氨酸或蘇氨酸殘基，而N-鍵聯的寡糖連接天冬醯胺殘基。在N-鍵聯的和O-鍵聯的寡糖上都發現的一種類型寡糖是N-乙醯神經氨酸(唾液酸)，其是含有9個或多個碳原子的氨基糖家族。唾液酸通常是N-鍵聯的和O-鍵聯的寡糖上的末端殘基，並且，因為它帶有負電荷，因此賦予糖蛋白以酸性性質。人促紅細胞生成素，具有165個胺基酸，具有三條N-鍵聯的和一條O-鍵聯的寡糖鏈，其佔糖蛋白總分子量的大約40％。N-鍵聯的糖基化作用發生在位於24，38，和83位的天冬醯胺殘基，而O-鍵聯的糖基化作用發生在位於126位的絲氨酸殘基。用末端唾液酸殘基修飾寡糖鏈。從糖基化促紅細胞生成素酶去除所有的唾液酸殘基導致體內活性損失，但是體外活性不損失，因為促紅細胞生成素的唾液酸化防止其結合和接著的肝結合蛋白對其的清除。
術語本發明的藥學組合物″促紅細胞生成素″包括人促紅細胞生成素的胺基酸序列中有一處或多處導致唾液酸連接位點數增加的變化的人促紅細胞生成素類似物。這些糖蛋白類似物可以通過定點誘變添加，缺失或者取代胺基酸殘基增加或改變糖基化可利用的位點來產生。通過添加不擾亂生物活性所必需的二級或三級構象的糖基化位點來產生唾液酸水平高於在人促紅細胞生成素中發現的那些的糖蛋白類似物。本發明的糖蛋白還包括在通常涉及在緊接近N-鍵聯或者O-鍵聯位點一個或多個胺基酸取代的糖基化位點有增加水平的糖連接的類似物。本發明的糖蛋白還包括具有從促紅細胞生成素的羧基末端延伸的一個或多個胺基酸並且提供至少一個另外的糖基位點的類似物。本組合物的促紅細胞生成素蛋白還包括具有包括至少一個糖基化位點重排的胺基酸序列的類似物。這樣的糖基化位點重排涉及人促紅細胞生成素中一個或多個糖基化位點的缺失和一個或多個非天然存在的糖基化位點的添加。促紅細胞生成素上糖鏈的數目增加，以及因此每個促紅細胞生成素分子的唾液酸數目可以帶來有利性質，例如提高的溶解性，對蛋白水解的更大的抗性，降低的免疫原性，提高的血清半壽期，和提高的生物活性。具有另外的糖基化位點的促紅細胞生成素類似物更詳細地公開於歐洲專利申請640 619，Elliot 1995年3月1日公開。
在優選的實施方案中，本發明的藥物組合物含有具有包括至少一個另外的糖基化位點的胺基酸序列的促紅細胞生成素蛋白，例如但不限於包括經選自下面的修飾修飾的人促紅細胞生成素序列的促紅細胞生成素Asn30Thr32；Asn51Thr53，Asn57Thr59；Asn69；Asn69Thr71；Ser68Asn69Thr71；Val87Asn88Thr90；Ser87Asn88Thr90；Ser87Asn88Gly89Thr90；Ser87Asn88Thr90Thr92；Ser87Asn88Thr90Ala162；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；Asn89Ile90Thr91；Ser87Asn89Ile90Thr91；Asn136Thr138；
Asn138Thr140；Thr125，和Pro124Thr125。
這裡對於胺基酸序列的修飾使用的標註指上角標數指示的相應的沒有修飾的蛋白質(例如SEQ ID NO1或者SEQ ID NO2的hEPO)的位置改變為各個上角標數前面的胺基酸。
促紅細胞生成素蛋白產物還可以在糖蛋白的羧基末端具有至少一個另外的胺基酸，其中該另外的胺基酸包括至少一個糖基化位點的類似物。該另外的胺基酸可以包括從人絨毛膜促性腺激素的羧基末端衍生的肽片段。優選地，該糖蛋白是選自下面的類似物(a)具有從羧基末端延伸的胺基酸序列，Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro SerArg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln(SEQ ID NO3)的人促紅細胞生成素；(b)進一步包括Ser87Asn88Thr90EPO的(a)中的類似物和(c)進一步包括Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO的(a)中的類似物。
促紅細胞生成素蛋白質還可以是具有包括至少一個糖基化位點重排的胺基酸序列的類似物。重排可以包括人促紅細胞生成素中N-鍵聯的任何糖基位點的缺失和人促紅細胞生成素的胺基酸序列的88位的N-鍵聯的糖基位點的添加。優選地，所述糖蛋白是選自Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO；和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO的類似物。
更特別地，如上所述本發明藥物組合物的促紅細胞生成素蛋白還可以包括其聚乙二醇化(pegylated)的衍生物。促紅細胞生成素的聚乙二醇化的衍生物及其製備是本領域公知的並且描述於例如EP-A-539,167，EP-A-605,963，WO93/25212，WO94/20069，WO95/11924，U.S.Pat.No.5,56，EP-A-584,876，WO92/16555，WO94/28024，WO97/04796，美國專利5,359,030和5,681,811，美國專利4,179,337，日本專利，WO98/32466，美國專利5,324,650。聚乙二醇化促紅細胞生成素物種的一個優選的實施方案涉及下面描述的衍生物。
因此，本發明還涉及促紅細胞生成素綴合物(conjugate)，所述綴合物包含如上所述的具有至少一個游離氨基並且具有引起骨髓細胞增加網狀細胞和紅細胞的產生的體內生物活性的促紅細胞生成素蛋白並且選自人促紅細胞生成素和具有通過加入1-6個糖基化位點或者重排至少一個糖基化位點而修飾的人促紅細胞生成素序列的其類似物；所述促紅細胞生成素共價連接於式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的「n」聚(乙二醇)基，各聚(乙二醇)基的-CO(即羰基)與所述氨基中的一個形成醯胺鍵；其中R是低級烷基；x是2或3；m是大約450至大約900；n是1至3；並且選擇n和m，使得減去促紅細胞生成素糖蛋白的綴合物的分子量從20千道爾頓到100千道爾頓。本發明進一步提供含有這裡所述綴合物的藥物組合物，其中n是1的綴合物的百分比至少是組合物中所有綴合物的90％，優選至少92％，更優選96％。
更具體地，上述綴合物可以用式(I)表示P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I)其中P是這裡所述促紅細胞生成素蛋白的殘基，(即沒有與式(I)中所示羰基形成醯胺鍵的氨基)，具有引起骨髓細胞增加網狀細胞和紅細胞的產生的體內生物活性；並且其中R是低級烷基；x是2或3；m是大約450至大約900；n是1至3；並且選擇n和m，使得減去促紅細胞生成素糖蛋白的綴合物的分子量從20千道爾頓到100千道爾頓。
如這裡使用的，″低級烷基″指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。低級烷基的例子包括甲基，乙基和異丙基。根據本發明，R是低級烷基。其中R是甲基的綴合物是優選的。
符號″m″代表聚(環氧乙烷)基中環氧乙烷殘基(OCH2CH2)的數目。環氧乙烷的一個PEG(聚乙二醇)亞基具有大約44千道爾頓的分子量。因此，綴合物的分子量(不包括EPO的分子量)取決於″m″數。在本發明的綴合物中，″m″是從大約450至大約900(相應於大約20kDa至大約40kDa的分子量)，優選是大約650至大約750(相應於大約30kDa的分子量)。選擇數值m，使得得到的本發明綴合物具有可與未修飾EPO相比的生理活性，其活性可以代表與未修飾的EPO的相應活性相同，或者比其大，或者是其的一部分。「大約」某一數值的分子量是指根據常規分析技術測定的，其在某一數值的合理範圍內。選擇數值″m″使得與促紅細胞生成素糖蛋白共價連接的各個聚(乙二醇)基團的分子量是大約20kDa至大約40kDa，並且優選是大約30kDa。
在本發明的綴合物中，數值″n″是通過醯胺鍵與促紅細胞生成素蛋白的自由氨基(包括賴氨酸的ε-氨基和/或氨基末端氨基)共價鍵合的聚(乙二醇)基團的數目。本發明的綴合物對於每個EPO分子可以具有一個，兩個或者三個PEG基團。″n″是1-3的整數，優選″n″是1或2，更優選″n″是1。上述綴合物中優選的綴合物包括其中x是2，m是650-750，n是1並且R是甲基的化合物。
式(I)的化合物可以通過使式II的化合物與促紅細胞生成素糖蛋白縮合而從已知的聚合物材料製備 其中R和m如上所述。其中x是3的式(II)的化合物是α-低級烷氧基，聚(乙二醇)的丁酸琥珀醯亞胺酯(低級烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的式(II)的化合物是α-低級烷氧基，聚(乙二醇)丙酸琥珀醯亞胺酯(低級烷氧基-PEG-SPA)。可以使用活化酯與胺反應生成醯胺的任何常規方法。在上述反應中，例舉的琥珀醯亞胺酯是引起醯胺形成的離去基團。使用琥珀醯亞胺酯例如式(II)的化合物產生和蛋白質的偶聯物描述於美國專利No.5,672,662，1997年9月30日頒發(Harris，等)。
人EPO包含9個自由氨基，氨基-末端氨基加8個賴氨酸殘基的ε-氨基。當聚乙二醇化試劑與式(II)的SBA化合物化合時，發現在pH7.5，蛋白質∶PEG之比是1∶3，反應溫度是20-25℃，產生一-，二-和痕量三-聚乙二醇化物種的混合物。當聚乙二醇化試劑是式(II)的SPA化合物時，採用類似條件，除了蛋白質∶PEG之比是1∶2，主要產生一-聚乙二醇化物種。聚乙二醇化EPO可以作為混合物或者作為離子交換色譜分離的不同的聚乙二醇化物種加以施用。通過操作反應條件(例如，試劑比例，pH，溫度，蛋白質濃度，反應時間等)，不同聚乙二醇化物種的相對量可以變化。
如上所述的藥物組合物還可以含有如上定義的具有至少一個游離氨基並且具有引起骨髓細胞增加網狀細胞和紅細胞的產生的體內生物活性的促紅細胞生成素蛋白並且選自人促紅細胞生成素和具有通過加入1-6個糖基化位點而修飾的人促紅細胞生成素一級結構的其類似物；所述糖蛋白被共價連接到一至三個低級烷氧基聚(乙二醇)基團，各聚(乙二醇)基團通過式-C(O)-X-S-Y-的接頭與糖蛋白共價連接，所述接頭的C(O)與所述氨基中的一個形成醯胺鍵，X是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，Y是 或者 各個聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓，綴合物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓。
這種促紅細胞生成素物種還可以用式(III)表示P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n(III)其中R可以是任何低級烷基，意思是指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基，乙基，異丙基等。優選的烷基是甲基。X可以是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大約10。優選地，k是1至大約4，更優選，k是1或2。更優選，X是-(CH2)。
在式1中，Y是 或 優選地 或者 更優選地 在式(III)中，選擇數值m使得得到的式(III)綴合物具有可與未修飾EPO相比較的生理活性，其活性可以代表與未修飾的EPO的相應活性相同，或者比其大，或者是其的一部分。m代表PEG單元中環氧乙烷殘基的數目。-(OCH2CH2)-的一個PEG亞基具有大約44道爾頓的分子量。因此，綴合物的分子量(不包括EPO的分子量)取決於m數值。″大約″某一數值的分子量指它在通過常規分析技術測定的那個數值的合理範圍內。m是大約450至大約900的整數(相應於20至40kDa的分子量)，優選m是大約550至大約800(大約24至35kDa)，最優選m是大約650至大約700(大約29至大約31kDa)。
在式(III)中，數值n是通過醯胺鍵與PEG單元共價結合的促紅細胞生成素蛋白中賴氨酸胺基酸的ε-氨基的數目。本發明的綴合物對於每個EPO分子可以含有一個，兩個，或者三個PEG單元。n是1-3的整數，優選n是1或2，並且更優選n是1。
下式代表式(III)優選的促紅細胞生成素蛋白 和 下式代表更優選的促紅細胞生成素糖蛋白產物 其中在上述結構式中，n是1-3的整數；m是450-900的整數；R是低級烷基；X是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，並且P是沒有與X形成醯胺鍵的一個或者多個氨基基團的促紅細胞生成素糖蛋白的殘基。
下式代表另一個優選的促紅細胞生成素糖蛋白產物 和 下式代表更優選的促紅細胞生成素糖蛋白產物 這些促紅細胞生成素蛋白可以通過下述製備(a)式P-[NH2]n代表的促紅細胞生成素蛋白的賴氨酸的ε-氨基與式Z-CO-X-S-Q代表的雙官能試劑共價反應，生成下式代表的具有醯胺鍵的中間體P-[NH-CO-X-S-Q]n其中P是沒有形成醯胺鍵的氨基的促紅細胞生成素蛋白；n是1-3的整數；Z是反應基團，例如羧酸(carboxylic)-NHS酯；X是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大約10；而Q是保護基團，象烷醯基，例如乙醯基。
(b)來自步驟(a)的具有醯胺鍵的中間體與式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化聚(乙二醇)衍生物共價反應，生成下式代表的促紅細胞生成素糖蛋白產物 其中W是Y的巰基反應形式；m是大約450至大約900的整數；R是低級烷基；而Y如上定義。
在該實施方案中，雙官能團試劑優選是N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯硫代丙酸酯或者N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯硫代乙酸酯，Z優選是N-羥基-琥珀醯亞胺，而活化的聚(乙二醇)衍生物W-[OCH2CH2]m-OR優選選自碘-乙醯基-甲氧基-PEG，甲氧基-PEG-乙烯碸，和甲氧基-PEG-馬來醯亞胺。
更詳細地說，式(III)的促紅細胞生成素蛋白可以通過巰基與EPO共價連接(「活化作用」)並且將得到的活化的EPO與聚(乙二醇)(PEG)衍生物反應來製備。根據本發明的製備聚乙二醇化EPO的第一步驟包括通過EPO的NH2-基團共價連接巰基基團。使用雙官能試劑進行EPO的活化作用，所述雙官能試劑帶有保護的巰基和另外的反應基團，例如分別是活性酯(例如琥珀醯亞胺酯)，酸酐，磺酸酯，羧酸和磺酸的滷化物。用本領域公知的基團例如乙醯基保護巰基。這些雙官能試劑能通過形成醯胺鍵而與賴氨酸的ξ-氨基反應。下面給出該反應的第一步 EPO，n和X如上定義並且Z是本領域公知的反應基團，例如下式的N-羥基-琥珀醯亞胺(NHS)取代基 在優選的實施方案中，通過與帶有琥珀醯亞胺基的雙官能試劑反應進行ε-氨基賴氨酸基團的活化作用。雙官能試劑可以帶有不同的間隔基團，例如-(CH2)k-或者-CH2-(O-CH2-CH2-)k-基團，其中k是1至大約10，優選1至大約4，更優選1或2，最優選1。這些試劑的例子是N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯硫代乙酸酯(SATA) 乙醯基硫烷基-羧酸-NHS-酯，象 或 2-(乙醯基硫)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯其中k如上定義。
雙官能試劑的製備是本領域公知的。2-(乙醯基硫)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的母體公開於DE-3924705，而March，J.，Advanced OrganicChemistry，McGraw-Hill，1977，375-376描述了生成乙醯基硫基化合物的衍生化作用。SATA是商業上可獲得的(Molecular Probes，Eugene，OR，USA和Pierce，Rockford，Ill.)。
通過調節反應參數例如蛋白質(EPO)濃度和蛋白質/雙官能試劑比例可以選擇加給EPO分子的巰基數目。優選地，通過每個EPO分子共價連接1-5個巰基來活化EPO，更優選每個EPO分子共價連接1.5-3個巰基。這些範圍指巰基對EPO蛋白質總體的統計學分布。
例如在pH6.5-8.0的緩衝水溶液中，例如在10mM磷酸鉀，50mM NaCl，pH7.3中進行反應。可以在DMSO中加入雙官能試劑。反應完全後，優選30分鐘之後，通過加入賴氨酸來中止反應。通過本領域公知的方法例如通過透析和柱過濾可以分離過量的雙官能試劑。通過例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49(1967)中描述的光測定方法能夠測定加給EPO的巰基的平均數。
上述反應之後，共價偶聯活化的聚(乙二醇)(PEG)衍生物。合適的PEG衍生物是具有大約20至大約40kDa平均分子量的活化的PEG分子，更優選大約24至大約35kDa，最優選大約30kDa。
活化的PEG衍生物是本領域公知的，並且對於PEG-乙烯碸描述於例如Morpurgo，M.等J.Bioconj.Chem.(1996)7，363頁ff。直鏈和支鏈PEG物種適合製備式1的化合物。活性PEG試劑的例子是碘-乙醯基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯碸 或 這些碘-活化的物質是本領域公知的，並且描述於例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148。
更優選地，使用(烷氧基-PEG-馬來醯亞胺)，例如甲氧基-PEG-馬來醯亞胺(MW30000；Shearwater Polymers，Inc.)通過馬來醯亞胺活化PEG物種。烷氧基-PEG-馬來醯亞胺的結構如下 或 R和m如上定義，優選地 在緩衝水溶液例如10mM磷酸鉀，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.2中原位裂解巰基保護基之後發生與烷氧基-PEG-馬來醯亞胺的偶聯反應。例如在25℃下在DMSO，pH6.2中用羥基胺進行保護基團的裂解大約90分鐘。對於PEG修飾，活化EPO/烷氧基-PEG-馬來醯亞胺的摩爾之比應該是大約1∶3至大約1∶6，優選1∶4。通過加入半胱氨酸和使殘留的巰基(-SH)與N-甲基馬來醯亞胺或者能夠形成二硫鍵的其他合適的化合物反應可以中止反應。因為所有殘留的活化的巰基與保護基團例如N-甲基馬來醯亞胺或者其他合適的保護基團反應，本發明綴合物中的EPO糖蛋白可以含有這樣的保護基團。一般情況下，這裡描述的方法將產生不同保護基團數保護的不同巰基數的分子的混合物，取決於不與PEG-馬來醯亞胺偶聯的糖蛋白上的活化巰基的數目。
而N-甲基馬來醯亞胺在用來封閉(block)聚乙二醇化蛋白質上的殘留巰基時形成相同類型的共價鍵，二硫化合物將導致分子內硫化物/二硫化物互換反應導致封閉試劑的二硫鍵偶聯。對於那種類型的封閉反應優選的封閉試劑是氧化穀胱甘肽(GSSG)，半胱氨酸和胱胺。而半胱氨酸沒有帶給聚乙二醇化蛋白質另外的淨電荷，使用封閉試劑GSSG或者胱胺導致另外的負電荷或正電荷。
通過本領域公知的方法例如柱層析可以對式(III)的化合物的進一步純化，包括一-，二-和三-聚乙二醇化EPO物種的分離。
含有聚乙二醇化促紅細胞生成素衍生物的組合物優選含有至少90％的一-PEG綴合物，即其中n是1，可以根據實施例5所示製備。通常，促紅細胞生成素糖蛋白的一-PEG綴合物是期望的，因為它們趨向於具有比二-PEG綴合物更大的活性。通過將洗脫峰附近的更寬級分合併可以控制一-PEG綴合物的百分比以及一-和二-PEG物種的比例來降低一-PEG在該組合物中的百分比或者合併洗脫峰附近的更窄級分來增加組合物中一-PEG的百分比。大約90％一-PEG綴合物是產率和活性的好的平衡。有時期望其中例如至少92％或者至少96％的綴合物是一-PEG物質(n等於1)的組合物。在本發明的實施方案中，其中n是1的綴合物百分比是90％至96％。
根據本發明的組合物如上所述每毫升可以含有10-10000微克的促紅細胞生成素蛋白。優選地，該組合物含有每毫升10-1000微克，例如10，50，100，400，800或者2500微克/毫升。
此外，根據本發明的組合物可以含有每毫升10-10000微克的促紅細胞生成素蛋白，10-200mmol/l硫酸鹽，10-50mmol/l磷酸鹽，pH6.0-6.5。該組合物還可以含有多達20mM甲硫氨酸，1-5％的多元醇(w/v)，多達0.1％pluronic F68(w/v)和任選的多達1mM CaCl2。該組合物的一個例子含有每毫升10-10000微克的促紅細胞生成素蛋白，40mmol/l硫酸鹽，10mmol/l磷酸鹽，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH6.2。
在本發明另一個實施方案中，組合物可以含有每毫升10-10000微克的促紅細胞生成素蛋白，10-100mmol/l NaCl，10-50mmol/l磷酸鹽pH6.0-7.0，任選的1-5％(w/v)多元醇。此外，該組合物可以含有多達20mM甲硫氨酸，多達0.1％ pluronic F68(w/v)和任選的7.5mmol/l CaCl2。具體地說，該組合物可以含有每毫升10-10000微克的促紅細胞生成素蛋白，100mmol/l NaCl，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronicF68(w/v)，和10mmol/l磷酸鹽，pH7.0。
本發明還涉及上述含有10-10000微克/ml的促紅細胞生成素蛋白，10-50mmol/l精氨酸，pH6-pH6.5，10-100mmol/l硫酸鈉的組合物。另外，該組合物可以含有多達20mM甲硫氨酸，多達0.1％pluronic F68(w/v)，任選的多達1mmol/l CaCl2和任選的1-5％(w/v)多元醇。具體地說，該組合物可以含有每毫升10-10000微克的促紅細胞生成素蛋白，40mmol/l精氨酸，pH6.2，30mmol/l硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)和任選的1mmol/lCaCl2。
本發明優選的實施方案涉及含有10-10000微克/毫升促紅細胞生成素，優選25-2,500微克/毫升促紅細胞生成素，和a)10mM磷酸鈉/磷酸鉀，100mM NaCl，pH7.0或者b)10mM磷酸鈉，120mM硫酸鈉，pH6.2或者c)10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，pH6.2或者d)10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)，pH6.2或者e)40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，pH6.2或者f)40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)，pH6.2。
在最優選的實施方案中，組合物含有50，100，400，800或2,500微克/毫升量的促紅細胞生成素蛋白。最優選的組合物含有10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)，pH6.2或者40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)，pH6.2。
本發明組合物的可以是噴霧乾燥粉末形式。
此外本發明涉及組合物，其是如上所述的水溶液的凍乾物或者噴霧乾燥粉末。凍乾物或者噴霧乾燥組合物可以通過加入溶劑例如水重新配製形成液體溶液或者通過例如吸入裝置或透皮施用裝置直接施用。
本發明還涉及製備如上所述組合物的方法，包括混合促紅細胞生成素蛋白和含有帶多個負電荷陰離子的溶液和任選的如上所述一種或多種藥學可接受賦形劑。
另外，本發明涉及如上所述組合物製備用於治療和預防與慢性腎衰竭患者(CRF)和愛滋病中的貧血相關的疾病和/或治療接受化學治療的癌症患者的藥物的用途。這包括治療和預防與慢性腎衰竭患者(CRF)，愛滋病和接受化學治療的癌症患者中的貧血相關的疾病的方法，包括對患者施用如上所述組合物的步驟。
本發明的另一個實施方案涉及用於局部和全身緩釋的含有如上所述組合物的裝置。這可以是包括上述組合物的提供促紅細胞生成素的控制釋放的任何類型的植入劑，象例如以聚合物為基礎的微米-或納米顆粒。也可以以預先裝入的注射器或者任何其它施用裝置例如沒有針頭的注射裝置或者吸入裝置提供上述組合物。
本發明的組合物可以以用於可注射或者靜脈內施用的單位劑量存在。另一方面，本發明的組合物可以以液體或者固體的形式貯然後分成單位劑量形式用於靜脈內或者可注射施用。因此本發明的液體組合物可以以0.3毫升這樣少存在用作施用的單位劑量形式。另一方面，在分裝成劑量形式之前貯存時，要求的組合物的體積可以象60升這樣大。從其增強的穩定性來看，本發明的組合物可以在大容器中貯存隨後包裝到適合分布給醫生，患者和醫院的包裝器具中。
本發明可注射溶液可以通過注射器這樣的常規注射方式施用，其一般作為單位劑量施用0.3毫升至20毫升這種組合物。另一方面，本發明的組合物可以通過注射使用安瓿施用，安瓿含有隨後在注射之前以常規方法重新配製的凍乾物或者噴霧乾燥粉末的這種組合物。另一方面，由於本發明的組合物的穩定性，組合物可以分裝成單位劑量形式，例如含有大約0.3毫升至大約10毫升這種組合物的小瓶。另外，本發明的組合物可以使用靜脈包靜脈內施用。這些包含有大約20毫升至大約500毫升這種溶液，取決於要對患者施用這種溶液的時間。根據本發明，本發明的液體溶液可以在貯存器中貯存，從該容器進一步分裝成小劑量包裝形式分發給醫生，醫院和患者。由於本發明的組合物的穩定性，在施用之前這些組合物可以長時間貯存在這樣的貯存器中。
作為如上所述組合物的成分或者作為用於製備如上所述促紅細胞生成素衍生物的起點的促紅細胞生成素的製備詳細描述於例如美國專利5,547,933和5,621,080，EP-B 0 148 605，Huang，S.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712，EP-B 0 205 564，EP-B 0 209 539和EP-B 0 411 678以及Lai，P.H.等，J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121，an Sasaki，H.等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076。通過重組方法可以製備用於治療應用的促紅細胞生成素(EP-B 0 148 605，EP-B 0209 539和Egrie，J.C.，Strickland，T.W.，Lane，J.等(1986)Immunobiol.72213-224)。
在無血清培養基中表達和製備促紅細胞生成素的方法描述於例如WO96/35718，Burg 1996年11月14日公開，和歐洲專利公開No.513 738，Koch 1992年6月12日公開。除了上述提到的公開物之外，已知可以進行包含EPO基因的重組CHO細胞的無血清發酵。這樣的方法描述於例如EP-A 0 513 738，EP-A 0 267 678，並且一般性描述於Kawamoto，T.等，Analytical Biochem.130(1983)445-453，EP-A 0 248 656，Kowar，J.和Franek，F.，Methods in Enzymology 421(1986)277-292，Bayister，B.，Expcology 271(1981)45-51，EP-A 0 481 791，EP-A 0 307 247，EP-A0 343 635，WO88/00967。
在EP-A0267678中，對於在無血清培養物中產生的透析之後的EPO純化描述了S-瓊脂糖上的離子交換色譜，C8柱上製備反相HPLC和凝膠過濾色譜。與此相關，可以用S-瓊脂糖快速流動的離子交換色譜代替凝膠過濾色譜步驟。也提出過在離子交換色譜之前進行Blue Trisacryl柱上染料色譜。
Nobuo，I.等，J.Biochem.107(1990)352-359描述了重組EPO的純化方法。但是在該方法中，在純化步驟之前，用Tween20，苯基甲基磺醯氟，乙基馬來醯亞胺，胃蛋白酶抑制劑A，硫酸銅和草氨酸的溶液處理EPO。公開文獻，包括WO96/35718，Burg 1996年11月14日公開，公開了用無血清發酵方法製備促紅細胞生成素的方法(EPOsf)。
通過本領域公知的各種測試方法可以測定根據本發明的EPO或EPO綴合物的比活。本發明經純化的EPO蛋白質的生物活性如此，通過對人患者注射施用EPO蛋白質導致與沒有注射或者對照組受試者相比骨髓細胞增加網狀細胞和紅細胞的產生。通過根據Annable，等，Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)4799-112和Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRPBio 1997(2)的方法可以測試根據本發明獲得和純化的EPO蛋白質或者其片段的生物活性。測定EPO蛋白質活性的另一種生物測試，normocythaemic小鼠測試，描述於實施例6。
通過參考下面的實施例將更好地理解本發明，實施例詳細說明本發明但是不限制所述本發明。
實施例實施例1人EPO的發酵和純化a)接種物製備和發酵從液氮貯存罐的氣相取出一小瓶工作細胞庫，來自EPO-產生CHO細胞系(可以使用ATCC CRL8695，公開於EP 411 678(GeneticsInstitute))。將細胞轉移到玻璃錐形瓶中並且在潮溼的CO2恆溫箱中在碳酸氫鹽緩衝培養基中培養。用於接種物製備和發酵的典型無血清培養基公開於歐洲專利申請513 738，Koch 1992年6月12日公開，或者WO96/35718，Burg 1996年11月14日公開，例如含有培養基DMEM/F12(例如JRH Biosciences/Hazleton Biologics，Denver，US，順序號57-736)和另外的碳酸氫鈉，L+穀氨醯胺，D+葡萄糖，重組胰島素，亞硒酸鈉，二氨基丁烷，氫化可的松，硫酸鐵(II)，天冬醯胺，天冬氨酸，絲氨酸和用於哺乳動物細胞的穩定劑，例如聚乙烯醇，甲基纖維素，葡聚糖，聚(乙二醇)，Pluronic F68，血漿擴張劑polygelin(HEMACCEL(R))或者聚乙稀吡咯烷酮(WO 96/35718)。
對培養物顯微鏡檢查沒有汙染的微生物，並且測定細胞密度。在各分解步驟進行這些測試。
最初的生長期之後，用新鮮培養基稀釋細胞培養物開始細胞密度和經歷另一個生長周期。重複該程序直到獲得每個玻璃錐形瓶的培養物體積大約2升。大約重複12次，可獲得1-5升該培養物，其然後用作10升接種物發酵器的接種物。
3-5天之後，10升發酵器中的培養物被用作100升接種物發酵器的接種物。
另外培養3-5天之後，100升發酵器中的培養物被用作1000升生產發酵器的接種物。
b)收穫和細胞分離使用間歇式再加料方法，即但達到期望的細胞密度時，收穫大約80％的培養物。用新鮮培養基再次充滿殘留的培養物，並且在下次收穫之前培養。一個生產周期由最多10次連續收穫9部分收穫和發酵最後一次總收穫組成。每3-4天進行收穫。
將測定的收穫體積轉移到冷卻的容器中。通過離心或者過濾取出細胞並且去除。排列過濾含有離心步驟上清液的EPO並且收集在第二個冷卻的容器中。純化期間分開進行各次收穫。
純化EPO-蛋白質的典型方法公開於WO96/35718，Burg 1996年11月14日公開。下面解釋純化方法。
a)藍色瓊脂糖凝膠層析藍色瓊脂糖凝膠(Blue Sepharose)(Pharmacia)由瓊脂糖凝膠小球組成，其表面共價鍵合Cibacron藍色染料。因為EPO比大多數非蛋白質汙染物，一些蛋白質雜質和PVA更強地結合藍色瓊脂糖凝膠，在該步驟中能富集EPO。通過提高鹽濃度及pH對藍色瓊脂糖凝膠柱進行洗脫。
柱子中裝有80-100升用NaOH再生並且用平衡緩衝液(氯化鈉/鈣和乙酸鈉)平衡過的藍色瓊脂糖凝膠。加載酸化並且過濾的發酵器上清液。加載完全之後，用和平衡緩衝液類似的含有更高濃度的氯化鈉的緩衝液第一次衝洗柱子並且連續用Tris-基緩衝液衝洗。用Tris-基緩衝液洗脫產物並且根據總洗脫曲線收集在一個級分中。
b)丁基Toyopearl層析丁基Toyopearl(Butyl Toyopearl)650 C(Toso Haas)是共價偶聯脂肪族丁基殘基的聚苯乙烯基基質。因為EPO比大多數雜質和PVA更強地結合這種凝膠，用含有異丙醇的緩衝劑將其洗脫。
柱子中裝有30-40升用NaOH再生並且用Tris-基緩衝液衝洗過並且用含有異丙醇的Tris-基緩衝液平衡過的丁基Toyopearl 650C。
將藍色瓊脂糖凝膠洗出物調節至柱平衡緩衝劑中異丙醇的濃度並且加載到柱子上。然後用具有提高的異丙醇濃度的平衡緩衝液衝洗柱子。用洗脫緩衝劑(具有高異丙醇含量的Tris-基緩衝劑)洗脫產物並且根據總洗脫曲線收集在一個級分中。
c)羥基磷灰石超凝膠層析羥基磷灰石超凝膠(Hydroxyapatite Ultrogel)(Biosepra)由羥基磷灰石組成，其摻入到瓊脂糖基質中改善機械性能。EPO對羥基磷灰石具有低親和力，因此可以在比蛋白質雜質低的磷酸鹽濃度下被洗出。
柱子中裝有30-40升羥基磷灰石並且用磷酸鉀/氯化鈣緩衝劑和NaOH再生，並且接著用Tris-基緩衝液再生。然後用含有低含量異丙醇和氯化鈉的Tris-基緩衝液平衡。
將含有EPO的丁基Toyopearl層析洗出物加載到柱子上。然後用平衡緩衝液和沒有異丙醇和氯化鈉的Tris-基緩衝液衝洗柱子。用含有低濃度磷酸鉀的Tris-基緩衝液洗脫產物，並且根據總洗脫曲線收集在一個級分中。
d)Vydac C4上反相HPLCRP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由矽膠顆粒組成，其表面帶有C4-烷基鏈。從蛋白質雜質分離EPO以疏水性相互作用強度差異為基礎。用稀釋的三氟乙酸中乙腈梯度進行洗脫使用不鏽鋼柱進行製備HPLC(裝有2.8-3.2升Vydac C4矽膠)。通過加入三氟乙酸將羥基磷灰石超凝膠洗出物酸化並且加載到Vydac C4柱子上。對於衝洗和洗脫，使用稀釋的三氟乙酸中乙腈梯度。收級分並且立即用磷酸鹽緩衝劑中和。合併IPC限度內的EPO級分。
e)DEAE瓊脂糖凝膠層析DEAE瓊脂糖凝膠(Pharmacia)材料由與瓊脂糖凝膠小球表面共價連接的二乙基氨基乙基(DEAE)-基團組成。離子相互作用介導EPO與DEAE基團的結合。乙腈和三氟乙酸通過柱子不滯留。將這些物質洗出之後，通過用低pH的乙酸鹽緩衝劑衝洗柱子去除痕量雜質。然後用中性磷酸鹽緩衝劑衝洗柱子並且用增強離子強度的緩衝劑洗脫EPO。
柱子裝有DEAE瓊脂糖凝膠快速流。調節柱體積保證以3-10mg EPO/ml凝膠範圍加載EPO。用水和平衡緩衝劑(磷酸鈉/鉀)衝洗柱子。加載HPLC洗出物的合併級分並且用平衡緩衝劑衝洗。然後用衝洗緩衝劑(乙酸鈉緩衝劑)衝洗柱子接著用平衡緩衝劑衝洗。接著，用洗脫緩衝劑(氯化鈉，磷酸鈉/鉀)將EPO從柱子中洗脫出來，並且根據總洗脫曲線收集在一個級分中。
將DEAE瓊脂糖凝膠柱的洗出物調節至規定的導電率。得到的藥物物質無菌過濾到聚四氟乙烯瓶中並且在-70℃下貯存。
實施例2使用mPEG-SBA對EPO聚乙二醇化根據分析方法測定，根據實施例1無血清方法純化的EPO(EPOsf)是均勻的，並且表明由8個同種型組成的典型同種型模式。根據normocythaemic小鼠測試，其具有190,000 IU/mg的比生物活性。使用的聚乙二醇化試劑是甲氧基-PEG-SBA，其是式II的化合物，其中R是甲基；x是3；並且m是650-750(平均大約680，相當於大約30kDa平均分子量)。
聚乙二醇化反應向100毫克EPOsf(9.71ml的10.3mg/ml EPOsf原液，5.48微摩爾)加入含有506mg的30kDa甲氧基-PEG-SBA(16.5微摩爾)(得自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Ala.)的10ml的0.1M磷酸鉀緩衝劑，pH，7.5，並且在室溫下(20-23℃)混合2小時。最終蛋白質濃度是5mg/ml並且蛋白質∶PEG試劑之比是1∶3。2個小時之後，通過用冰醋酸調節pH至4.5終止反應，並且在-20℃貯存，以備純化。
純化1.綴合物混合物向AMICON玻璃柱(2.2×7.5cm)裝入大約28ml的SP-SEPHAROSE FF(磺-丙基陽離子交換樹脂，並且用20mM乙酸鹽緩衝劑pH，4.5以150ml/h的流速平衡。用平衡緩衝液將含有30mg蛋白質的6毫升反應混合物稀釋5倍並且加到柱子上。用緩衝劑洗出沒有吸附的物質，並且用平衡緩衝液中0.175M NaCl從柱子上洗出吸附的PEG綴合物混合物。用750mM NaCl洗出依然保留在柱子上的沒有修飾的EPOsf。柱子在起始緩衝劑中再平衡。通過SDS-PAGE分析樣品，並且測定它們聚乙二醇化程度。發現0.175M NaCl洗出物含有一-和二-和痕量三-聚乙二醇化物質，而750mM NaCl洗出物含有沒有修飾的EPOsf。
2.二-PEG和一-PEG-EPOsf用緩衝劑將從前一步驟的柱子中洗出的純化的綴合物混合物稀釋4-倍，並且再加載到柱子上並且如所述的衝洗。分別用0.1M NaCl和0.175M NaCl從柱子上分別洗出二-PEG-EPOsf和一-PEG-EPOsf。還用750mM NaCl進行洗脫洗出所有的殘留的沒有修飾的EPOsf。
或者，用乙酸鹽緩衝劑將反應混合物稀釋5-倍，並且施加到SP-瓊脂糖凝膠柱上(0.5mg蛋白質/ml凝膠)。衝洗柱子，並且根據前面部分中描述的洗出吸附的一-PEG-EPOsf，一-PEG-EPOsf和沒有修飾的EPOsf。
結果通過具有30kDa數均分子量的線性PEG分子的化學偶聯合成PEG-EPOsf。產生醯胺鍵的EPOsf的伯胺基團和30kDa PEG-丁酸的琥珀醯亞胺酯衍生物之間的反應衍生PEG-EPOsf。
表1總結了結果。根據SDS-PAGE分析測定，純化的綴合物混合物由一-和二-PEG-EPOsf組成並且沒有未修飾EPOsf。綴合物混合物是23.4mg或者是起始材料的78％。一-和二-PEG-EPOsf的陽離子交換色譜分離表明綴合物混合物中一-與二-PEG之比幾乎是1∶1。反應完全之後，一∶二∶未修飾的各成分之比是40∶38∶20(％)，總產率幾乎是定量的。表1EPOsf聚乙二醇化作用的結果總結樣品 蛋白質(mg) 產率(％)Rxn.混合物 30 100單 12.040二 11.438未修飾6.0 20綴合物 混合物23.478實施例3用mPEG-SPA對EPO聚乙二醇化不同等份的實施例2中使用的EPOsf與30kDa甲氧基-PEG-SPA(Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)反應。在蛋白質∶試劑之比1∶2進行反應，並且純化技術根據實施例2。主要產生一-聚乙二醇化物種。
實施例4巰基與EPO的共價連接該實施例公開了對於巰基(thiol)與EPO的共價連接的反應條件的測定。為了測定該條件，向EPO溶液，這裡是向10mM磷酸鉀，50mM NaCl，pH7.3中的1ml的5mg/ml EPO加入不同量的含有封閉的巰基的試劑，這裡是SATA或SATP(溶解於DMSO ad 10mg/ml)。將反應攪拌大約30分鐘(25℃)，並且通過加入10mM的1M賴氨酸溶液終止反應。通過對10mM磷酸鉀，50mM NaCl和2mM EDTA，pH6.2透析去除過量的SATA和SATP。去除用羥胺保護的乙醯基之後，根據Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49頁(1967)中描述的方法用二硫二吡啶(dithiodipyridine)光學測定與EPO共價連接的巰基的數目。
下面給出與每個EPO共價連接的巰基的數目。

實施例5用甲氧基-PEG-馬來醯亞胺修飾活化的EPOA)EPO的活化根據實施例2用SATA(摩爾比EPO/SATA＝1/5)活化根據實施例1產生的100mg EPO(190,000IU/mg，根據normocythaemic小鼠測試)。根據實施例1所述通過透析從副產物象N-羥基-琥珀醯亞胺或者沒有反應的SATA分離帶有共價連接的封閉的巰基的得到的EPO(″活化EPO″)。得到10mM磷酸鉀，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.2中的4.5mg/ml活化的EPO溶液。
B)活化EPO的聚乙二醇化將具有上述「最優選」結構的380mg甲氧基-PEG-馬來醯亞胺(MW30.000；Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville(Alabama，USA))溶解於上述含有95mg活化EPO(4.5mg/ml，在10mM磷酸鉀，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.2中)溶液中。溶液中得到的活化EPO和甲氧基-PEG-馬來醯亞胺之間的摩爾比是1∶4。通過向上述溶液加入1M羥胺水溶液ad 30mM，pH6.2，將活化EPO的共價連接的封閉的巰基去封閉。反應混合物溶液中得到的活化EPO含有自由巰基(-SH)。巰基去封閉之後，緊接著是現在含有自由巰基的活化EPO和甲氧基-PEG-馬來醯亞胺之間的偶聯反應90分鐘(攪拌，25℃)。通過向反應混和物中加入0.2M半胱氨酸水溶液ad 2mM終止偶聯反應。30分鐘之後，通過加入DMSO中0.5M N-甲基馬來醯亞胺溶液達到5mM濃度封閉沒有與甲氧基-PEG-馬來醯亞胺反應的活化EPO的過量自由巰基。30分鐘之後，用10mM磷酸鉀，pH7.5將得到的現在含有聚乙二醇化EPO物種的反應混合物透析≥15小時。
C)聚乙二醇化EPO物種的純化對於從反應混合物分離聚乙二醇化EPO物種，進行下面的純化方法用10mM磷酸鉀，pH7.5平衡50ml Q-Sepharose ff柱。將步驟B)獲得的反應混合物加載到柱子上(流速每小時3柱體積(CV))。為了分離沒有反應的甲氧基-PEG-馬來亞醯胺試劑，用5CV’s的10mM磷酸鉀，pH7.5衝洗柱子。通過用5CV’s緩衝劑A(10mM磷酸鉀，pH7.5)和5CV’s緩衝劑B(10mM磷酸鉀，500mM NaCl，pH7.5)組成的遞增鹽梯度以每小時3CV的流速洗脫來分離聚乙二醇化EPO物種。以NaCl梯度為基礎，首先洗脫聚乙二醇化EPO物種(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物種)，接著是沒有聚乙二醇化EPO物種。合併含有聚乙二醇化EPO物種(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物種)的洗出物級分，並且過濾(用0.2微米過濾器無菌過濾)。
在考馬斯染色SDS-PAA凝膠(Laemmli，Nature 227，680-685(1970))上評價三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物種的含量和純度，同時根據Beer-Lambert定律在280nm下測定蛋白質濃度。通過SDS-PAA電泳測定的EPO物種的表觀分子量是大約68kDa(一-聚乙二醇化EPO物種)，大約98kDa(二-聚乙二醇化EPO物種)，和大約128kDa(三-聚乙二醇化EPO物種)。
通過層析法例如通過大小排阻層析(Superdex，pg200；Pharmacia)可以實現三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物種的進一步分離。通過下述方法進行含有三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物種的洗出液的體內生物活性測定。
實施例6通過normocythaemic小鼠測試測定的聚乙二醇化EPO的體內活性normocythaemic小鼠生物測試是本領域公知的(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))並且是Ph.Eur.BRP促紅細胞生成素的專論中的一個方法。用BSA-PBS稀釋樣品。對7-15周齡的正常健康小鼠皮下施用0.2ml的含有沒有聚乙二醇化EPO或者得自實施例2或3的三-，二-或一-聚乙二醇化EPO的EPO-級分。6天之後，通過對尾靜脈穿刺抽取血液並且稀釋，使得1ml的0.15微摩爾吖啶橙色染色溶液中存在1微升血液。染色時間是3至10分鐘。通過分析紅色螢光直方圖在流式細胞儀中顯微螢光法進行網狀細胞計數。以絕對數字給出網狀細胞計數(分析的每30,000血細胞)。對於給出的數據，各組每天由5隻小鼠組成，並且只對小鼠取一次血。
在單獨的實驗中，對小鼠施用單一劑量的未修飾EPO(25ng的EPO)，來自實施例2的PEG(SBA)-EPO混合物(10ng的綴合物)，來自實施例2的一-和二-聚乙二醇化EPOs(10ng的綴合物)，來自實施例3的PEG(SPA)-EPO(10ng的綴合物)，和緩衝溶液。表2給出了結果。結果表明與25ng劑量的未修飾的EPO相比，每隻小鼠使用相同劑量(10ng)，表現出由顯著增加的網狀細胞量和網狀細胞計數最大值位移表明的聚乙二醇化EPO物種的優越活性和更長的半壽期。
表2

實施例7主要是一-PEG-EPO的製備聚乙二醇化反應用根據實施例1製備的100mM磷酸鉀緩衝劑pH7.5中的100mg(5.48微摩爾)的EPOsf起始，加入溶解於3ml 1mM HCl中的329mg(10.96微摩爾)的30kDa PEG-SBA試劑。加入足夠的100mM磷酸鉀緩衝劑pH7.5使反應混合物體積達到20ml。最終蛋白質濃度是5mg/ml並且蛋白質∶PEG試劑之比是1∶2。室溫(20-22℃)下將反應混合物混合2小時。2小時之後，通過用冰醋酸調節pH至4.5終止反應並且在-20℃下冷凍貯存以備純化。
純化用10mM乙酸鈉，pH4.5將得自前一步驟的反應混合物稀釋1∶5並且施加給裝到4.2×19cm柱子中的300ml SP-瓊脂糖凝膠FF(磺丙基陽離子交換樹脂)。柱子預先用相同的緩衝劑平衡。使用Gilson UV監控器在280nm檢測柱子流出物並且用Kipp和Zonen記錄儀記錄。用300ml或者1床體積的平衡緩衝劑衝洗柱子去除過量試劑，反應副產物和寡聚PEG-EPO。接著用2床體積的100mM NaCl衝洗，去除二-PEG-EPO。然後用200mM NaCl洗脫一-PEG-EPO。洗脫一-PEG-EPO期間，棄除第一50ml蛋白質峰，並且收集一-PEG-EPO為150ml級分。用750mM NaCl洗脫留在柱子上的未修飾EPOsf。所有的洗脫緩衝劑在平衡緩衝劑中製備。通過SDS-PAGE和高效大小排阻層析(SEC)分析所有的洗脫的樣品。然後將沒有可檢測未修飾EPOsf的從150ml級分獲得的一-PEG-EPO合併液濃縮至大約4.5-7.5mg/ml並且滲濾到貯存緩衝液，10mM磷酸鉀，100mMNaCl，pH7.5中。室溫下使用裝有50kDa截留Millipore Pellicon XLBiomax 50膜的Millipore LabscaleTMTFF系統進行濃縮/滲濾。將濃縮的一-PEG-EPO無菌過濾並且在-20℃下冷凍貯存大約75％的EPOsf被聚乙二醇化。純化之後，總產率是沒有可檢測未修飾EPOsf的大約30％一-PEG-EPO和大約25％的二-PEG-EPO。對殘留的蛋白質計量寡聚物，和未修飾EPOsf。從150ml級分獲得的一-PEG-EPO合併液含有大約90％的一-PEG-EPO和大約10％的二-PEG-EPO。
實施例8各種配方中EPO和聚乙二醇化EPO的熱穩定性通過DSC(差示掃描量熱法)分析一般認為差示掃描量熱法測定的熱變性的轉變溫度是蛋白質熱穩定性的有效指標。利用Nano-DSC(Calorimetric Sciences Corporation，Utah，USA)，以2K/分鐘的加熱速度，在各種有或者無穩定劑的緩衝劑中分析濃度在0.6和1.2mg/ml之間的促紅細胞生成素或者聚乙二醇化促紅細胞生成素溶液。轉變溫度提高表明蛋白質的熱穩定性增強。測得的溫度值不應該理解為絕對值，但是確實代表各配方彼此之間穩定性差異。
為了確定配方的最佳pH，研究了在4和9之間的範圍內的聚乙二醇化促紅細胞生成素的熱變性的pH-依賴性。在30mM Na2HPO4，30mM檸檬酸鈉，30mM硼酸鹽中分析蛋白質樣品。圖1表明在大約pH6至大約pH9之間的平穩段的最大轉變溫度，和在低於pH5.5的急劇降低。這表明最大熱穩定性的最佳pH高於pH5.5(圖3)。
為了研究離子強度的作用，測定熱變性的磷酸鹽濃度依賴性。圖4表明熱穩定性隨著製劑中離子強度的增加而提高。
通過DSC也研究了緩衝物質的影響。從圖5可以看出高熱穩定性的最適合的緩衝劑或添加劑是硫酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽。現行可獲得的製劑中作為緩衝劑使用的甘氨酸(見上文)不是非常合適。
圖6表明在低pH(例如pH6.2)下硫酸鹽也是合適的緩衝劑/添加劑，而與pH7.5相比，在pH6.2下磷酸鹽較不合適。這表明即使在低pH下，硫酸鹽也能保持高熱穩定性。該發現使得製劑的pH在6.0和6.5之間，而促紅細胞生成素的熱穩定性沒有嚴重損失。
實施例9熱應力下EPO和peg-EPO的聚集作用通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析為了研究熱應力對促紅細胞生成素蛋白的作用，將不同配方中的樣品暴露給熱應力(80℃下20分鐘)，並且在還原(在樣品緩衝劑中使用DTT)和非還原(在樣品緩衝劑中w/o DTT)條件下通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。該方法可以檢測共價聚集體形成。如上文概述的，聚集體形成是蛋白質主要降解途經之一，因此應該在蛋白質藥物製劑中防止。不存在還原劑(例如DTT)下可檢測的和存在還原劑下不可檢測的聚集體高度地可能由熱應力下氧化反應，不適當的二硫鍵而形成。圖5說明熱應力下聚集作用的pH依賴性。該項實驗清楚地表明在pH低於6.5下抑制聚集體的形成。PH越高，聚集作用量越高。在SDS-PAGE期間通過用還原劑處理樣品可以減少形成的大多數聚集體，提示熱應力下形成的大部分聚集體是二硫鍵二聚體，寡聚物和更高級聚集體。總而言之，其表明可以通過將製劑的pH保持在或者低於pH6.5而在很大程度防止聚集體的形成。
圖7peg-EPO聚集作用對pH的依賴性。通過SDS-PAGE分析熱應力(如上所述)之後的Peg-EPO樣品。蛋白質用銀染色。泳道1分子量標準。泳道2pH5。泳道3pH5，還原的。泳道4pH6。泳道5pH6，還原的。泳道6pH6.5。泳道7pH6.5，還原的。泳道8pH7。泳道9pH7，還原的。泳道10peg-EPO，沒有應力。
利用抗氧化劑也可以防止聚集體的形成。圖8表明使用1mg/ml乙醯基半胱氨酸作為抗氧化劑防止熱應力下聚集體的形成。因此，使用抗氧化劑，象例如乙醯基半胱氨酸，在低pH，例如pH6.2，對於防止熱應力下聚集體形成是有用的。
圖6pH6.2和/或乙醯基半胱氨酸可以防止Peg-EPO聚集作用。通過SDS-PAGE分析熱應力後(如上所述)的Peg-EPO樣品。蛋白質用銀染色。泳道1peg-EPO，沒有應力。泳道2pH7.5，有應力。泳道3pH6.2，有應力。泳道4pH6.2，有應力，還原的。泳道5pH7.5，1mg/ml乙醯基半胱氨酸，有應力。泳道6pH7.5，1mg/ml乙醯基半胱氨酸，有應力，還原的。
實施例104，25，30和40℃下各種製劑中peg-EPO的穩定性在幾個溫度下溫育不同製劑中的聚乙二醇化EPO。在指定的時間點，取樣並且通過反相高效色譜(rpHPLC)，高效大小排阻層析(SEC)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對樣品評價穩定性。表3比較了幾個溫度下不同製劑中的peg-EPO的穩定性。這些數據清楚表明就蛋白質回收和凝集作用來說，本文涉及的製劑的優越性。
表3幾個溫度下不同製劑中的peg-EPO的穩定性

*製劑是製劑A10mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.5。
製劑B10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2。
製劑C10mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH7.0。
製劑D10mM磷酸鈉，120mM硫酸鈉，pH6.2。
製劑E40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，1mM CaCl2，pH6.2.
實施例11優化的製劑抑制EPO蛋白質中甲硫氨酸54的氧化作用，甲硫氨酸作為抗氧化劑在幾個溫度下溫育不同製劑中的聚乙二醇化EPO。6個月之後，取出樣品並且如下測定甲硫氨酸54的氧化作用程度。簡要地說，用內源蛋白酶LysC處理EPO樣品。通過反相色譜分離得到的肽。計算氧化的肽T8(含有氧化的甲硫氨酸54)與肽T8(含有沒有氧化的甲硫氨酸54)之比。表4總結了數據。
表4在指定溫度下6個月之後在不同製劑中的EPO蛋白質的甲硫氨酸54氧化作用的程度

*下面列出製劑製劑A10mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.0。
製劑B10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2。
製劑C10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，1mM甲硫氨酸，pH6.2。
這些數據清楚地表明本發明優選的製劑(10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2)就甲硫氨酸54氧化作用的程度來說，優於其它製劑，象10mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH7.0。向製劑中加入1或10mM甲硫氨酸明顯抑制甲硫氨酸54的氧化作用。因此，甲硫氨酸作為抗氧化劑起作用並且穩定EPO。
實施例12各種製劑中peg-EPO樣品的唾液酸含量為了分析peg-EPO糖蛋白的糖結構的完整性，通過標準技術分析各種溫度下貯存6個月之後的優化的製劑中的peg-EPO樣品的唾液酸含量。這些數據表明糖結構的完整性不受本文描述的新製劑中蛋白質的貯存的負面影響(圖9)。
實施例13在升高的溫度下貯存長時間之後的聚乙二醇化EPO的生物活性為了證明peg-EPO在10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2，中貯存不負面影響體內生物活性，進行標準的小鼠EPO測試(參見實施例6)。與新鮮的參照樣品相比，在4，25和30℃下貯存之後，在指定溫度下Peg-EPO樣品在10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2中貯存6個月之後，表現出體內活性沒有降低(圖10)。
實施例14在升高的溫度下貯存6個月之後peg-EPO的聚集體含量為了分析在升高的溫度下在10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％(w/v)甘露糖醇，pH6.2中貯存6個之後peg-EPO樣品中的聚集體含量，取樣並且通過大小排阻層析分析。
在4，25和30℃下沒有檢測到聚集體，證明在上述製劑中聚乙二醇化EPO的穩定性。圖11說明大小排阻層析覆蓋圖(overlay)。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱霍夫曼-拉羅奇有限公司(B)街道124 Grenzacherstrasse(C)城市巴塞爾(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)CH-4070(G)電話(61)688 11 11(H)電傳(61)688 13 95(I)電報962 292 hlr ch(ii)發明名稱新的藥物組合物(iii)序列數量2(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統WORD(D)軟體PatentIn Release 2.0170PatentIn Ver.2.02101211165212PRT213人4001Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp1652102211166212PRT213人4002Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg16權利要求
1.含有促紅細胞生成素蛋白，在適合將溶液pH保持在大約5.5至大約7.0範圍內的藥學可接受緩衝劑中的多電荷無機陰離子，和任選地，一種或多種藥學可接受賦形劑的液體藥物組合物。
2.根據權利要求1的組合物，其是水溶液。
3.根據權利要求1或2的組合物，其是等張溶液
4.根據權利要求1-3的組合物，其中所述陰離子是多電荷強無機酸的陰離子。
5.根據權利要求1-4的組合物，其中所述陰離子選自硫酸根，檸檬酸根或者磷酸根。
6.根據權利要求1-5的組合物，其中所述陰離子是硫酸根陰離子。
7.根據權利要求6的組合物，其含有10-200mmol/l硫酸根。
8.根據權利要求1-7的組合物，其中pH是5.8至6.7。
9.根據權利要求8的組合物，其中pH是6.0至6.5。
10.根據權利要求9的組合物，其中pH是大約6.2。
11.根據權利要求1-10的組合物，其中所述緩衝劑選自磷酸鹽或者精氨酸/H2SO4/Na2SO4緩衝劑。
12.根據權利要求11的組合物，其中所述緩衝劑是10-50mmol磷酸鹽緩衝劑。
13.根據權利要求1-12的組合物，其中所述組合物含有一種或多種藥學可接受賦形劑。
14.根據權利要求13的組合物，其中所述一種或多種藥學可接受賦形劑選自藥學可接受鹽，稀釋劑，溶劑和防腐劑。
15.根據權利要求13和14的組合物，其中所述藥學可接受賦形劑選自張度劑，多元醇，抗氧化劑和非離子去汙劑。
16.根據權利要求13至15的組合物，其中所述藥學可接受賦形劑是多元醇。
17.根據權利要求16的組合物，其中所述多元醇選自甘露糖醇，山梨糖醇，甘油，海藻糖和蔗糖。
18.根據權利要求17的組合物，其中所述多元醇是甘露糖醇。
19.根據權利要求13-18的組合物，其含有抗氧化劑。
20.根據權利要求19的組合物，其中所述抗氧化劑是甲硫氨酸。
21.根據權利要求13-20的組合物，其含有多達1毫摩爾/升的氯化鈣。
22.根據權利要求15-22的組合物，其中所述非離子去汙劑是多乙氧基醚80，多乙氧基醚20，或者pluronic F68。
23.根據權利要求22的組合物，其中所述非離子去汙劑是pluronicF68。
24.根據權利要求22或23的組合物，其中所述組合物含有多達1％(w/v)的非離子去汙劑。
25.根據權利要求22-24任一項的組合物，其中所述組合物含有多達0.1％(w/v)的非離子去汙劑。
26.根據權利要求1-25的組合物，其中所述促紅細胞生成素蛋白是人促紅細胞生成素。
27.根據權利要求26的組合物，其中所述促紅細胞生成素蛋白是通過內源基因激活表達的。
28.根據權利要求26-27的組合物，其中所述促紅細胞生成素蛋白具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
29.根據權利要求26-28的組合物，其中所述蛋白質具有通過加入1-6個糖基化位點而修飾的人促紅細胞生成素的序列。
30.根據權利要求26-28的組合物，其中所述促紅細胞生成素蛋白具有通過選自下面的修飾而修飾的人促紅細胞生成素序列Asn30Thr32；Asn51Thr53，Asn57Thr59；Asn69；Asn69Thr71；Ser68Asn69Thr71；Val87Asn88Thr90；Ser87Asn88Thr90；Ser87Asn88Gly89Thr90；Ser87Asn88Thr90Thr92；Ser87Asn88Thr90Ala162；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；Asn89Ile90Thr91；Ser87Asn89Ile90Thr91；Asn136Thr138；Asn138Thr140；Thr125；andPro124Thr125.
31.根據權利要求26-30的組合物，其中所述人促紅細胞生成素的序列通過至少一個糖基化位點的重排而被修飾。
32.權利要求31的組合物，其中所述重排包括人促紅細胞生成素中N-鍵聯的任何糖基位點的缺失和人促紅細胞生成素的序列的88位的N-鍵聯的糖基位點的添加。
33.權利要求31的組合物，其中所述糖蛋白具有通過選自下面的修飾作用而修飾的人促紅細胞生成素序列Gln24Ser87Asn88Thr90；Gln38Ser87Asn88Thr90；和Gln83Ser87Asn88Thr90。
34.根據權利要求26-33的組合物，其中任一項權利要求中定義的促紅細胞生成素蛋白被聚乙二醇化。
35.權利要求34的組合物，其中所述促紅細胞生成素蛋白是一種綴合物，所述綴合物包含具有至少一個游離氨基並且具有引起骨髓細胞增加網狀細胞和紅細胞的產生的體內生物活性的促紅細胞生成素糖蛋白並且選自人促紅細胞生成素和其類似物，其具有通過加入1-6個糖基化位點或者重排至少一個糖基化位點而修飾的人促紅細胞生成素序列；所述糖蛋白共價連接於式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的「n」聚(乙二醇)基，各聚(乙二醇)基的-CO與所述氨基中的一個形成醯胺鍵；其中R是低級烷基；x是2或3；m是大約450至大約900；n是1至3；並且選擇n和m，使得減去促紅細胞生成素糖蛋白的綴合物的分子量從20千道爾頓到100千道爾頓。
36.根據權利要求35的組合物，含有下式促紅細胞生成素蛋白P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I)其中m，n，x和R如上定義，而P是沒有與聚(乙二醇)基團形成醯胺鍵的n個氨基的促紅細胞生成素蛋白的殘基。
37.根據權利要求36的組合物，其中在式(I)中，x是2，m是650-750，n是1並且R是甲基。
38.根據權利要求34的組合物，其中所述促紅細胞生成素蛋白是綴合物，所述綴合物包括具有至少一個游離氨基並且具有引起骨髓細胞增加網狀細胞和紅細胞的產生的體內生物活性的促紅細胞生成素糖蛋白並且選自人促紅細胞生成素和其類似物，其具有通過加入1-6個糖基化位點而修飾的人促紅細胞生成素的一級結構；所述糖蛋白被共價連接於一至三個低級烷氧基聚(乙二醇)基團，各聚(乙二醇)基團通過式-C(O)-X-S-Y-的接頭與該糖蛋白共價連接，所述接頭的C(O)與所述氨基中的一個形成醯胺鍵，X是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，Y是 或者 各個聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓，並且綴合物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓。
39.權利要求38的綴合物，其具有結構式 其中n是1-3的整數；m是450-900的整數；R是低級烷基；X是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，並且P是沒有氨基或者與X形成醯胺鍵的基團的促紅細胞生成素糖蛋白的殘基。
40.權利要求39的綴合物，其具有結構式 其中n是1-3的整數；m是450-900的整數；R是低級烷基；X是-(CH2)k-或者-CH2(O-CH2-CH2)k-，並且P是沒有氨基或者與X形成醯胺鍵的基團的促紅細胞生成素糖蛋白的殘基。
41.權利要求1-40的組合物，每毫升含有10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白。
42.權利要求1-41的組合物，含有每毫升10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白，10-200mmol/l硫酸鹽，和10-50mmol/l磷酸鹽，pH6.0-6.5。
43.權利要求42的組合物，含有多達20mM甲硫氨酸，1-5％多元醇(w/v)，多達0.1％Pluronic F68(w/v)和任選地多達1mM氯化鈣。
44.根據權利要求42或43的組合物，含有每毫升10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白，40mmol/l硫酸鹽，10mmol/l磷酸鹽，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％Pluronic F68(w/v)，pH6.2。
45.根據權利要求1-41的組合物，含有每毫升10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白，10-100mmol/l氯化鈉，10-50mmol/l磷酸鹽，pH6.0-7.0，任選地，1-5％多元醇。
46.權利要求45的組合物，含有多達20mM甲硫氨酸，多達0.1％Pluronic F68和任選地7.5mmol/l氯化鈣。
47.根據權利要求45或46的組合物，含有每毫升10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白，100mmol/l氯化鈉，10mM甲硫氨酸，0.01％Pluronic F68，和10mmol/l磷酸鹽，pH7.0的。
48.根據權利要求1-41的組合物，含有每毫升10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白，10-50mmol/l精氨酸，pH6-6.5，10-100mmol/l硫酸鈉。
49.權利要求48的組合物，含有多達20mM甲硫氨酸，多達0.1％Pluronic F68和任選地多達1mmol/l氯化鈣和任選地1-5％多元醇。
50.權利要求48或49的組合物，含有每毫升10微克至10000微克促紅細胞生成素蛋白，40mmol/l精氨酸，pH6.2，30mmol/l硫酸鈉，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％Pluronic F68和任選地1mmol/l氯化鈣。
51.根據權利要求1-41的組合物，含有25-2,500微克/ml促紅細胞生成素和a)10mM磷酸鈉/磷酸鉀，100mM NaCl，pH7.0或者b)10mM磷酸鈉，120mM硫酸鈉，pH6.2或者c)10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，pH6.2或者d)10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68，pH6.2或者e)40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，pH6.2或者f)40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH6.2。
52.權利要求1-51的組合物，其中促紅細胞生成素的量是每毫升50，100，400，800或2,500微克。
53.權利要求52的組合物，含有10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68，pH6.2。
54.權利要求52的組合物，含有40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68，和pH6.2。
55.權利要求1-54的組合物，其是凍乾物或者噴霧乾燥的粉末。
56.製備根據權利要求1-54任一項的組合物的方法，包括混合促紅細胞生成素蛋白和含有多負電荷的陰離子的溶液和任選的一種或多種藥學可接受賦形劑。
57.根據權利要求1-54任一項的組合物製備用於治療和預防與慢性腎衰竭患者(CRF)，愛滋病中的貧血相關的疾病和/或治療接受化學治療的癌症患者的藥物的用途。
58.治療和預防與慢性腎衰竭患者(CRF)，愛滋病和接受化學治療的癌症患者中的貧血相關的疾病的方法，包括對患者施用根據權利要求1-54任一項的組合物步驟。
59.包含根據權利要求1-54的任一項的組合物的局部和全身緩釋用裝置。
60.上文描述的本發明。
全文摘要
本發明涉及含有促紅細胞生成素，在適合將溶液pH保持在大約5.5至大約7.0範圍的藥學可接受緩衝劑中的多電荷無機陰離子，和任選地，一種或多種藥學可接受賦形劑的液體藥物組合物。該組合物特別有用於預防和治療與紅細胞生成相關的疾病。
文檔編號A61P7/06GK1429116SQ01809560
公開日2003年7月9日 申請日期2001年5月8日 優先權日2000年5月15日
發明者阿波隆·帕帕季米特裡烏 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司