一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構建方法

2023-06-08 14:10:16 1

專利名稱：一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法。
背景技術：
核苷酸作為重要的食品添加劑和藥物中間體而被業界廣泛關注並研發，其中 5' -肌苷酸鈉(5' -1MP)和5' -鳥苷酸鈉(5' -GMP)具有濃烈的鮮味，是新一代雞精調味品的主要原料，而3'-肌苷酸鈉和2'-肌苷酸鈉鮮味則基本沒有鮮味(周秀芹，2010)。當前， 以肌苷和鳥苷為原料加上合適磷酸供體，採用化學法和酶法催化都可以獲得5'-肌苷酸和 5'_鳥苷酸，然而由於酶法具有催化條件溫和、專一性較強、對環境友好、特異性高等特點 (Asano 和 MIhara 等，1999;崔桂友，2003 ;宋勇波和儲炬等，2003 ；Kuninaka, 1960 )，而受到國內外科研人員和產業界的廣泛關注，發展迅速。其中，日本味之素公司已採用酶催化技術生產呈味核苷酸，韓國希傑則利用發酵直接產肌苷酸和鳥苷酸。希望能夠充分利用酸性磷酸酶這一催化特性(ZHANG Chong和XING Xinhui等，2005)，以期開發出高效生產呈味核苷酸的酶工程技術。
酸性磷酸化酶在大腸桿菌表達之後，催化過程會表現出一定程度降解肌苷成次黃嘌呤，影響了肌苷的轉化率，對後續的提取過程中肌苷的套用增加了難度。發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，用於阻斷肌苷轉變為次黃嘌呤。
嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤補救合成途徑的關鍵酶之一，廣泛存在於原核和真核生物中(Bzowska和Kulikowska等,2000 )。該是一種戍糖基轉移酶,催化嘌呤核苷與正磷酸作用生成自由嘌呤及核糖-5-磷酸的反應。
為了實現上述目的，本發明提供一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，為敲除其嘌呤核苷磷酸化酶基因(purine nucleoside phosphorylase,簡稱PNP),本發明利用Red/ET系統同源重組,在四環素(Tet)和卡那黴素 (Kam)雙重抗性下篩選嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26，沉默肌苷水解為次黃嘌呤的途徑，提高磷酸轉移酶的轉化率。
一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，包括如下步驟
(I)通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因，設計引物PCR擴增得到同源重組缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以驗證宿主中PNP的存在；
所述引物為PNP-upper:5』 -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3』 ；
PNP-1ower: 5， -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3，；
(2)通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因及其上下遊基因的同源性情況，根據 K006-Ecol1-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，擴增得到在Red/ET系統同源重組中的功能片段；
所述功能段擴徵的引物為
deoD_FRT_f
5』-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAA CCCTCACTAAAGGGCG ；
deoD-FRT-r
5』-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATAC GACTCACTATAGGGCTC ；
(3)製備宿主的感受態細胞，電轉質粒pRedET，幫助功能片段同源重組
(4)阿拉伯糖誘導含有pRedET的感受態宿主後，電轉化線性的功能片段；
(5)在pRedET質粒的幫助下，功能片段與染色體基因組上的PNP進行同源重組
(6)電轉化表達質粒706-F1P，幫助消除同源整合到染色體上的抗性標記
(7)通過溫度變化，消除抗性標記以及丟失表達質粒706-F1P。
在上述構建方法中，在該方法中用於重組和缺失抗性標記的兩個質粒pRedET和 706-FLP 均為 K006-Ecol1-Gene Deletion Kit 提供。
在上述構建方法中，步驟(3)是採用Eppendorf_Electroporator2510電轉儀,在 1350V下進行電轉。
在上述構建方法中，構建過程所用的培養基均為LB，培養溫度在30_37°C，pH在 6. 0_7· O ο
與現有技術相比，本發明具有以下有益的效果
1、本發明通過Red/ET系統同源重組的方式成功敲除了 PNP基因，提高了酶催化的轉化率和5' -磷酸化肌苷的純度，降低了肌苷的損耗和生產成本，有利於後續5' -磷酸化肌苷的提取和殘餘肌苷的套用，該發明對酶催化肌苷5'-磷酸化產業化進程的推進具有重要意義。
2、本發明運用Red/ET系統同源重組缺失PNP，該方法可以完全鏤掉PNP基因，在基因組中不會殘留抗性標記，與傳統意義的插入失活具有本質的不同。
3、經改造後的工程菌，其催化反應液在後續的提取更加簡單，有利於肌苷的回收套用。
4、經改造後的工程菌，簡化了提取工藝，更進一步的推進了酶法肌苷磷酸化的產業化進程。


圖1 為 PNP 的 PCR 圖2為含有同源的功能片段的PCR圖3為敲除後的催化液體的高效液相色譜圖。
具體的實施方式
實施例1 驗證表達磷酸轉移酶大腸桿菌是否含有磷酸化轉移酶
以大腸桿菌菌懸液為模板，利用以下引物進行菌落PCR初步驗證PNP的存在
PNP-upper: 5』 -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3』
PNP-1ower: 5』 -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3』
PCR 反應條件為變性 940C，2min ;解鏈 94°C，Imin ;退火 63 °C，Imin ;延伸 72 °C， lmin30s ;進行30個循環擴增,擴增後72°C延伸lOmin。
實施例2同源重組缺失嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因
1、擴增含有同源臂的功能PCR片段，利用引物
deoD--f
5』-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAAC A j^f^ACCCTCACTAAAGGGCG|
deoD- (FRlj ~r 5』-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAA | Α ATA C G AC TC A CTATA GGGCTC
如圖1所示。
PCR 反應條件為變性 940C，2min ;解鏈 94°C，Imin ;退火 65 °C，Imin ;延伸 72 °C， 2min50s ;進行30個循環擴增,擴增後72°C延伸lOmin。
2、缺失嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的目標菌株篩選
I)感受態製備，轉化pRedET。挑取單克隆，過夜培養後，在2°C，IlOOOrpm下離心l-3min,去上清,用Iml預冷的ddH20重懸沉澱,重複以上步驟一次,去上清,殘餘的20_30μ1 溶解沉澱即為製備好的感受態細胞，加入 μ PRedET質粒到菌體中，小心混勻後將菌體轉移至預冷的電轉杯中，在1350v進行電轉，30°C培養2-3h後塗平板，至含Tet抗性(終濃度 3 Pg/ml)的LB培養液(lml)，30°C過夜培養。篩選含有pRedET質粒的大腸桿菌。
2)製備含有pRedET質粒宿主的感受態細胞，轉化功能PCR片段進行同源重組。按同樣的方法準備感受態細胞，相同的電轉條件下電轉，37°C恢復培養3hr。塗布於Km (15 Kg/ml)抗性平板，37°C過夜培養。
3)製備同源重組成功的感受態細胞，轉化700-FLP質粒把插入的抗性標記消掉。 挑取同源重組成功的單菌落到Iml LB (Km終濃度5(^g/ml)，37°C過夜培養。按相同的方法製備感受態細胞以及轉化700-FLP，30°C培養70min (lOOOrpm)。塗布於Tet (3 μδ/πι1) +Km(15 Pg/ml)雙重抗性的平板，30°C培養24hr。如圖2為電轉質粒pRedET幫助功能片段同源重組示意4)驗證長出來的菌落是陽性克隆。塗布LB平板(確保出單菌落)，37°C過夜培養。 第二條PCR驗證抗生素去除效果，也可以分別塗布含Km抗性的LB板，以及不含任何抗生素的LB板進行雙重驗證。從圖3可以看出，基本檢測不到次黃嘌呤。
權利要求
1.一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因，設計引物PCR擴增得到同源重組缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以驗證宿主中PNP的存在； 所述引物為PNP-upper: 5』 -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3』 ；PNP-1ower: 5』 -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3』 ； (2)通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因及其上下遊基因的同源性情況，根據K006-Ecol1-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，擴增得到在Red/ET系統同源重組中的功能片段； 所述功能段擴徵的引物為deoD-FRT-f 5』-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG ；deoD-FRT-r 5』-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC ； (3)製備宿主的感受態細胞，電轉質粒PRedET，幫助功能片段同源重組 (4)阿拉伯糖誘導含有pRedET的感受態宿主後，電轉化線性的功能片段； (5)在pRedET質粒的幫助下，功能片段與染色體基因組上的PNP進行同源重組 (6)電轉化表達質粒706-F1P，幫助消除同源整合到染色體上的抗性標記 (7)通過溫度變化，消除抗性標記以及丟失表達質粒706-F1P。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，在該方法中用於重組和缺失抗性標記 的兩個質粒PRedET和706-FLP均為敲除試劑盒提供。
3.如權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，步驟(3)是採用Eppendorf-Electroporator2510 電轉儀，在 1350V 下進行電轉。
4.如權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，構建過程所用的培養基均為LB，培養溫度在 30-37°C，pH 在 6. 0-7. O。
全文摘要
本發明公開了一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構建方法，本方法採用Red/ET系統同源重組敲除嘌呤核苷磷酸化酶基因，在四環素(Tet)和卡那黴素(Kam)雙重抗性下篩選到了嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的菌株Eocli-SL26。本發明成功沉默了肌苷水解為次黃嘌呤的途徑，提高了酶催化的轉化率和5`-磷酸化肌苷的純度，降低了肌苷的損耗和生產成本，有利於後續5`-磷酸化肌苷的提取和殘餘肌苷的套用，該發明對酶催化肌苷5`-磷酸化的產業化進程具有重要意義。
文檔編號C12N1/21GK102994537SQ20121047611
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者蔡友華, 鄭明英, 嚴傑能, 陸最青 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司