抗人絨毛膜促性腺激素抗體-白介素2融合蛋白的製備及其應用的製作方法

2023-06-08 13:58:26

專利名稱：抗人絨毛膜促性腺激素抗體-白介素2融合蛋白的製備及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術和藥物領域。更具體地，本發明涉及抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)i3亞基單抗與人白細胞介素2 (以下簡稱IL2)的融合蛋白，編碼該融合蛋白的 DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，以及該融合蛋白的製法和在治療腫瘤等疾病中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤(癌症)是危害人類健康的重大疾病，在臨床治療癌症的過程中，對手術後殘留腫瘤細胞的治療是一個涉及預後情況的關鍵環節。儘管癌症的治療技術和方案在不斷改進，但癌症的復發仍然是一個棘手和致命的問題。由於各種毒副反應和有限的療效，使得化療方法有其局限性。因此，需要有一些更好的治療方法來控制癌症發展或從根本上消除癌細胞。細胞因子(Cytokine)是一類由機體的活化免疫細胞或其他細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白質的統稱，具有調節細胞生理功能、介導炎症反應、參與免疫應答和組織修復等多種生物學效應。根據細胞因子的功能又分為如白細胞介素anterleukin，IL)， 集落刺激因子(Colony-stimulating Factor, CSF)，幹擾素Qnterferon)，腫瘤壞死因子 (Tumor Necrosis Factor, TNF)等等。由於細胞因子對免疫功能具有調節作用，局部應用可以增強腫瘤的免疫原性，因而作為藥物應用治療腫瘤疾病。這些細胞因子在市場上都銷售多年並顯示出獨特的治療效果，其缺點是在體內半衰期短、缺乏特異性。例如，用細胞因子如白介素2 (IL2)、IL12和GM-CSF等，進行全身性治療，可通過激活機體的保護性免疫反應而殺死殘留的腫瘤細胞，目前在臨床上已取得了一定的療效[1. Rosenberg, S.A. , et al,1998.Durability of complete responses in patients with metastatic cancer treated with high-dose interleukin—2 -identification of the antigens mediating response. Ann. Surg. 228 :307 ；2. Ruef, C.，et al，1990. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor :pleiotropic cytokine with potential clinical usefulness. Rev. Infect. Dis. 12 41. ；3. Tsung，K.，et al.，1997. IL-12 induces T helper 1-directed antitumor response· J· Immunol· 158 :3359.]。然而，全身性使用細胞因子，常常會出現系統性問題，即嚴重的毒副作用，而且在腫瘤部位又達不到有效的治療劑量[Cohen，J.，1995. Clinical trials-IL-12 deaths-Explanation and a puzzle. Science 270 :908 ；5. Maas, R. Α.，et al, 1993. Interleukin—2 in cancer treatment :disappointing or (still)promising ？ A review.Cancer Immunol. Immunother. 36 :141.]，因此治療往往達不到理想的效果，該治療技術正處於兩難的境地。如果能研究出一種既能為治療腫瘤提供有效濃度，又能減少甚至避免全身性的毒性，將極大地推動細胞因子生物治療技術的發展。將細胞因子直接注射到腫瘤部位是一種解決方法[6. Cortesina,G. , et al, 1988.Treatment of recurrent sequamous cell carcinoma of the head and neck with low doses of interleukin-2 injected penilymphatically. Cancer 62 :2482 ；7. Maas,R. A., et al,1991. Intratumoral low-dose interleukin-2 induces rejection of distant solid tumour. Cancer Immunol. Immunother. 33 :389.],但要直接注射到腫瘤部位是很困難的，因而這一方法只適用於那些特定的、易達部位的腫瘤的治療。另一種做法是細胞因子的基因治療，就是將細胞因子轉基因癌細胞回輸到病人體內，其缺點是在治療腫瘤的同時，也使機體本身的免疫反應受到抑制[S.Hurford， R. K. J. ,et al,1995. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat. Genet. 10 :430 ；9. Maass, G.，et al, 1995. Priming of tumor-specific T cells in the draining lymph nodes after immunization with interleukin 2—secreting tumor cells three consecutive stages may be required for successful tumor vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5540·]。而且，儘管有一些研究結果表明，這種免疫治療方法在治療少量殘留腫瘤細胞時具有實際應用價值，但是體外的基因改造以及患者的細胞輸入因人而異，因此臨床應用受到限制。此外，多次的輸入接種不僅費時，而且需要昂貴的醫藥費[lO.Hrouda，D.，et al, 1999. Gene therapy for prostate cancer. Semin. Oncol. 26 :455 ；11.Simons，J. W.，et al,1999. Induction of immunity to prostate cancer antigens -results of a clinical trial of vaccination with irradiated autologous prostate tumor cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor using ex vivo gene transfer. Cancer Res. 59 :5160.]。雖然有人嘗試過在體內用過濾性病毒載體導入細胞因子基因，但是由於病毒載體轉移效率低以及免疫原性和安全性所限而未得到臨床應用。許多病毒載體的表面糖蛋白能與各種細胞受體結合，這種非特異性相互作用直接降低其體內轉染效率； 而且有相當一部分人體內存在著對病毒載體的抗體和免疫反應，這種不利免疫反應直接降低了載體的半衰期[12. Smith，R. M.，et al，1999. H印atocyte-directed gene delivery by receptor-mediated endocytosis. Semin. Liver Dis· 19 :83]。 @]ft，胃[JB一禾中能有效地提高細胞因子在腫瘤局部區域的濃度來進行腫瘤治療的新技術。抗體是能與相應抗原發生特異性結合反應的免疫球蛋白(Ig)。抗體特異性結合抗原的特性是由其可變區(Variable region)的空間構型決定的。可變區主要由輕鏈(L鏈)N端1/2處(VL)IOS-Ill個胺基酸殘基和重鏈(H鏈)N端1/5-1/4處(VH)IlS 個胺基酸殘基組成。可變區又可分為超變區(hypervariable region, HVR)和骨架區 (framework region，FR)。其中，超變區是V區中胺基酸的組成和排列順序變化頻率更高的區域，也是抗體與抗原決定簇(表位，epitope)結合的部位，稱為決定簇互補區 (complementarity-determining region, CDR)，是Ig分子獨特型決定簇主要存在的部位。 因此，對抗體分子結構的認識為人工合成抗體奠定了基礎。眾所周知，腫瘤細胞往往缺失HLA-I類分子，以及與NK細胞受體相配對的配體， 這是其逃脫腫瘤特異性CTL或NK細胞介導的免疫反應的主要機制。IL2 (也被稱為T細胞生長因子)是一種分子量為14. 5kD的糖蛋白，是由T輔助細胞(Th細胞)合成分泌的一種細胞因子。它不僅能刺激T細胞增殖並能誘導其分化為細胞毒性T細胞(CTL) [19. Grimm, Ε. Α.，et al.，1982. Lymphokine-activated killer cell phenomenon.
4Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin
2-activatedautologous human peripheral blood lymphocytes. J. Exp. Med. 155 :1823 ； 20. Hank, J. A. , et al. , Cheung, N. K. , Sondel, P.M. , 1990. Augmentation of antibody dependent cell mediated cytotoxicity following in vivo therapy with recombinant interleukin 2. Cancer Res. 50 :52.]，而且能增強NK細胞的活性[21. Grimm et al.，1982. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J. Exp. Med. 155 :1823.]。特別是，外周血淋巴細胞與IL2共培養，能產生淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)[22. Rosenberg SA, et al, 1985. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med 313 :1485-1492. ] ο像NK細胞一樣，LAK細胞也能殺死腫瘤細胞。臨床上IL2已用於許多癌症的治療，如腎癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤。然而，迄今為止本領域尚沒有將抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗與白細胞介素2融合形成高特異性和高腫瘤殺傷力的融合蛋白。因此，為了更有效的治療腫瘤病人，尤其是治療那些以傳統治療方式無能為力的病人，本領域迫切需要開發兼具腫瘤特異性抗體和IL2兩者生物活性的藥物。

發明內容
本發明的一個目的就是提供一種新的具有腫瘤特異性(或靶向性)抗體和IL2兩者生物活性的藥物。在本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，它包括(a)抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基的單抗元件，該單抗元件的結構如下L-H-Cm(式 I)；式中，L為單鏈形式的抗體輕鏈或其保留結合活性的片段；H為單鏈形式的抗體重鏈或其保留結合活性的片段；C為單鏈形式的抗體恆定區或其片段；m 為 0 或 1;「_」表示肽鍵或連接肽；(b)白細胞介素2元件，該元件由全長人白細胞介素2、或保留活性的白細胞介素 2突變蛋白或其活性片段的胺基酸序列構成；以及(c)任選的、位於抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基的單抗元件和白細胞介素2 元件之間的連接肽序列。在另一優選例中，所述的連接肽的長度為1-20個胺基酸，所述的接頭肽序列含
3-15個胺基酸。在另一優選例中，單抗元件中連接肽為(Gly Gly Gly Gly kr)^。在另一優選例中，m為1。在另一優選例中，各元件之間(單抗元件與白細胞介素2元件之間)的連接方式為「頭一頭」、「頭一尾」、「尾一頭」、或「尾一尾」連接。其中「頭」指元件的氨基端，「尾」指元
件的羧基端。在另一優選例中，所述的單抗元件包括由抗體重鏈在前和抗體輕鏈通過一接頭肽如GGlyIer) 3或ARL等其他類型接頭串聯起來，或由抗體輕鏈在前和抗體重鏈通過一接頭肽如GGlyIer) 3或ARL等其他類型接頭串聯起來，或連接抗體Fc，所形成的完整單鏈體(scFv)或(scFvFc)ο在另一優選例中，所述的單抗元件是單鏈抗體。在另一優選例中，所述的白細胞介素2突變蛋白是125位半胱氨酸取代為絲氨酸的重組人白細胞介素-2(125kr)或是125位半胱氨酸取代為丙氨酸的重組人白細胞介素-2(125Ala)。在另一優選例中，所述的抗體重鏈和抗體輕鏈為IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4亞類， 且連接肽或位於抗體重鏈或輕鏈的羧基端和白細胞介素2元件的胺基酸之間。在本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發明第一方面中所述融合蛋白。在本發明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發明上述的DNA分子。在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發明上述的載體或基因組中整合有上述的DNA分子。在本發明的第五方面，提供了一種產生本發明第一方面中所述的融合蛋白的方法，它包括步驟在表達所述融合蛋白的條件下，培養本發明第四方面中所述的宿主細胞，從而表達出所述的融合蛋白；和分離出所述的融合蛋白。在本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，包括安全有效量的本發明第一方面中所述的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑。在另一優選例中，所述的藥物組合物還含有選自下組的抗腫瘤藥物順鉬、5-Fu、 氨甲蝶呤、IFN、TNF、氮芥、環磷醯胺、阿黴素、放線菌素D、長春新鹼、喜樹鹼類或其組合。在本發明的第六方面，提供了本發明所述的融合蛋白的用途，它們被用於製備治療腫瘤的藥物。在另一優選例中，所述的腫瘤選自下組黑色素瘤、鼻咽癌、肺腺癌、肺鱗癌、小細胞性肺癌、結腸癌、直腸癌、視網膜母細胞瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、神經系統癌。 在本發明的第七方面，還提供了一種化合物，它由PEG化的本發明上述融合蛋白。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再
--累述。


圖1顯示了本發明部分融合蛋白實例的結構示意圖。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，將抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗的基因和IL2基因融合在一起，產生由合適的胺基酸連接臂連接的hCGbeta-SCFV-IL2或 hCGbeta-scFvFc-IL2的融合蛋白。所述融合蛋白具有兩者的生物學功能，既可通過抗hCG 抗體的特異性地達到腫瘤部位，或通過抗體依賴的細胞毒作用和補體介導的細胞溶解作用殺傷腫瘤細胞(僅hCGbeta-SCFvFC-IL2具有)，還可以激發機體局部和全身的抗腫瘤免疫反應，並通過IL2的生物活性提高腫瘤部位毛細血管的通透性，提高腫瘤局部攝取化療藥物的數量，同時由於和大分子抗體蛋白的融合，IL2的半衰期得以延長。因此，本發明所得到的hCGbeta-scFv-IL2或hCGbeta-scFvFc-IL2融合蛋白質可以在兩者的協同下增強抗腫瘤的效果，還可減少兩者分別給藥給患者所帶來的麻煩和痛苦，為抗腫瘤等治療提供新的化合物。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，術語「抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗和白細胞介素2的融合蛋白」、"hCGbeta-scFv-IL2或hCGbeta-SCFvFC-IL2融合蛋白」等可互換使用，都指由抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗的胺基酸序列和白細胞介素2元件的胺基酸序列融合而成的蛋白質，其中在兩者之間可以有或者沒有連接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或沒有起始的甲硫氨酸或信號肽。如本文所用，術語「hCG」指人絨毛膜促性腺激素。hCG最初被發現是由人胚胎滋養層細胞特異表達的一種由alpha和beta兩個亞基組成的異二聚體糖蛋白。1990年代，人們相繼在許多腫瘤細胞膜上也發現有hCG樣蛋白分子的表達。Acevedo等人建立了一種高度敏感的定量方法，採用針對hCG不同表位的單抗，對85株不同病理特性和組織來源的腫瘤細胞膜結合型hCG進行檢測，所檢測的癌細胞包括黑色素瘤、鼻咽癌、肺腺癌、肺鱗癌、小細胞性肺癌、結腸癌、視網膜母細胞瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、 子宮內膜癌、神經系統癌等。這些結果證實，hCGi3亞基或其片段在所有癌細胞膜上都有表達，且與癌細胞的型別和組織來源無關。雖然不同的癌細胞都特異表達hCG亞基或片段， 但在性質和數量上存在著差異[30. Acevedo HF，et al. 1992. Flow cytometry method for the analysis of membrane-associated human chorionic gonadotropin,its subunits, and fragments on human cancer cells. Cancer, 69 (7) :1818-1828]。此夕卜，各禾中證據顯不， hCG在腫瘤細胞轉化、腫瘤血管生成、腫瘤轉移和免疫逃逸中起重要作用[31. Triozzi PL, Stevens VC. 1999, Human chorionic gonadotropin as a target for cancer vaccines. Oncol Rep. 6(1) :7-17]。因此，hCG可作為腫瘤細胞表面的靶分子，用於治療惡性腫瘤。如本文所用，術語「抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗」和「hCGi3亞基單抗」可互換使用，都指針對人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基中任意一表位的單克隆抗體。 這種抗體可特異性結合腫瘤細胞膜具有hCG β亞基表達的腫瘤細胞，腫瘤特異性好。一種優選的抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗是單鏈抗體。如本文所用，術語融合蛋白中「抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗」指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的全長抗人絨毛膜促性腺激素 (hCG) β亞基單抗或其可變區片段具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗基本上相同的生物活性。應理解，在本發明中，抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗可以由抗體重鏈
7和抗體輕鏈通過接頭肽連接形成，並且在輕鏈或重鏈的一端(優選羧基端)與IL2連接。 因此，優選的抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)i3亞基單抗是全長的抗人絨毛膜促性腺激素 (hCG) β亞基單抗或其可變區片段。例如，對於重鏈而言，對於結合特異性起重要作用是區域是重鏈的⑶R1、⑶R2、和⑶R3的胺基酸序列。對於輕鏈而言，對於結合特異性起重要作用是區域是輕鏈的⑶R1、⑶R2、和⑶R3的胺基酸序列。至於重鏈和輕鏈的恆定區，可以選用人抗體的重鏈恆定區和輕鏈恆定區。也可選用人抗體的骨架區序列(FR)改造小鼠單抗可變區中的骨架區序列(FR)。 如本文所用，術語融合蛋白中「白細胞介素2元件」或「IL2元件」可互換使用，指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的全長白細胞介素2或其活性片段具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然白細胞介素2基本上相同的生物活性。優選的IL2元件是人白細胞介素2，更佳地是全長的白細胞介素2或其活性片段。人白細胞介素2(Interlukin-2，IL-2)目前主要用於治療腫瘤、AIDS和感染性疾病，是一廣泛應用臨床的細胞因子。天然人白細胞介素2由133個胺基酸組成，第58位和 105位的半胱氨酸(Cys)間形成二硫鍵，第125位半胱氨酸是游離疏基。與天然人白細胞介素2胺基酸結構組成相同的重組人白細胞介素2 (rIL-2)大多在大腸桿菌中以包含體形式表達。產物需經復性後才能進一步純化處理。復性時往往會形成部分的58位和125位之間或105位和125位之間二硫鍵錯配的重組人白細胞介素2異構體，或形成分子間的二聚體， 這為純化帶來了許多困難。因此，為了避免這些異構體的幹擾，在基因構建時將重組人白細胞介素2的125位半胱氨酸取代為絲氨酸(Ser)或丙氨酸(Ala)。結果表明這不僅大大提高了復性後二硫鍵的配對正確率，而且不影響rIL-2的生物活性。目前市場上銷售的重組人白細胞介素2有兩類一類是天然結構的、一類是125位半胱氨酸取代為絲氨酸重組人白細胞介素_2 (125Ser)、或是125位半胱氨酸取代為丙氨酸重組人白細胞介素_2 (125Ale)。抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗和白細胞介素2的序列可以源自人，也可以源自非人的動物。例如，單體的序列可以來自大鼠、小鼠或人。然而，優選的是人的天然序列。如本文所用，術語「連接肽」或「胺基酸連接臂，，可互換使用，指位於抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗的重鏈和輕鏈之間的胺基酸序列和IL2元件的胺基酸序列之間的、起連接作用的任選的短肽。連接肽的長度通常為1-20個胺基酸，較佳地為3-15個胺基酸，更佳地為5-10個胺基酸，最佳地為4-6個胺基酸。技術人員可按照本領域常規方法(如參見 PNAS 1998 ；95 5929-5934 ；Protein Eng, 2000 ； 13 (5) 309-312 ；Protein Eng, 2003 ； 15(11) :871-879等文獻)設計連接肽。通常，連接肽不影響或不嚴重影響抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗的胺基酸序列和IL2元件的胺基酸序列形成正確的摺疊和空間構象。優選的連接肽例子包括(但並不限於)為了有利於蛋白在空間摺疊成相互獨立的有充分生物活性的結構域，用GG、AAAGGGS、SGGGSGGG和GGGGSGGGGSGGGGS等序列作為連接臂是合適的；為了有利於純化，可把Mlis作為連接臂，以用金屬親和層析純化 hCGbeta-scFv-IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 融合蛋白。一種優選的融合蛋白是將單鏈抗體與IL2融合而形成的。例如，從單克隆抗體細胞株或噬菌體抗體庫中，篩選出編碼抗hCG beta抗體可變區的cDNA，構建成單鏈抗體cDNA，再與IL2基因cDNA連接成單鏈嵌合cDNA，進而在宿主細胞(如CHO細胞)中表達，從而重組表達本發明的融合蛋白。抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為互補決定區(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守， 不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，通過其間的FR形成的β摺疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應輕鏈上的⑶R構成了抗體的抗原結合位點。本發明還包括含上述互補決定區(OTR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。本發明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。一旦獲得了有關的序列，就可以用基因工程的方法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物) 的DNA序列。因此，編碼本發明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR 擴增或合成的方法獲得抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗和或白細胞介素2的編碼 DNA序列，然後將其拼接在一起，形成編碼本發明融合蛋白的DNA序列。在獲得了編碼本發明新融合蛋白的DNA序列之後，將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最後，培養轉化後的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的融合蛋白。如本文所用，術語「載體」包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體、噬菌粒等。代表性的狀態包括(但並不限於)能在真核細胞如CHO、COS系列等真核細胞中表達的載體，能在釀酒酵母或畢氏酵母中表達的載體，能在家蠶等昆蟲細胞中表達的載體以及原核表達載體、或噬菌體表達。在本發明中，可選用本領域已知的各種哺乳動物表達載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列， 可以形成蛋白表達載體。如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA ；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是哺乳動物細胞。 在獲得轉化的宿主細胞後，可在適合表達本發明融合蛋白的條件下培養該細胞， 從而表達出融合蛋白。可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。本發明的hCGbeta-scFv_IL2或hCGbeta-scFvFc_IL2融合蛋白既具有單抗針對腫瘤細胞的特異親和力，又具有IL2的增強免疫應答的作用。除了直接使用本發明的融合蛋白之外，本發明的融合蛋白還可與另一個化合物 (比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)偶聯，形成融合蛋白-PEG偶聯物。可以採用本領域中已知的各種形成PEG化蛋白的方法來製備這些融合蛋白-PEG偶聯物。在本發明的另一方面，還提供了一種藥物組合物。本發明的藥物組合物包括有效量的本發明的新型hCGbeta-scFv-IL2或hCGbeta-scFvFc-IL2融合蛋白，以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在製備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、 葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。製劑還可包括溼潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。組合物可製成單元或多元劑型。各劑型包含為了產生所期望的治療效應而計算出預定量的活性物質，以及合適的藥劑學賦形劑。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、靜脈內、皮下、皮內、鞘內(intrathecal)、側腦室(intracerebroventricular)、腹腔 (intraperitoneal)以Hl中內(intraparenchymal)合使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明融合蛋白或其抗體施用於人，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。此外，本發明的融合蛋白還可與其他治療藥物聯用，其中包括(但並不限於)各種細胞因子，如IFN、TNF、IL18等；各種腫瘤化療藥物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影響核酸生物合成的藥物，氮芥、環磷醯胺等烷化劑類，阿黴素、放線菌素D等幹擾轉錄過程阻止RNA合成的藥物，長春新鹼、喜樹鹼類影響蛋白質合成的藥物及某些激素等各類藥物。本發明的主要優點如下(1)將抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗與IL-2融合表達後，IL_2可以特異性地到達腫瘤部位。因此融合蛋白，既具有針對腫瘤細胞的特異親和力，又具有IL2的增強在腫瘤細胞周圍的免疫應答能力，而對機體無毒副作用，是一種治療腫瘤的新型藥物。(2)增強蛋白的穩定性，延長半衰期。重組IL-2在體內的半衰期短，臨床應用病人需要每天注射。本發明的融合蛋白大大延長IL-2的半衰期，使每日注射改為每周或更長時間注射一次，大大方便了病人給藥，減少了病人的痛苦和經濟負擔。(3)本發明融合蛋白採用抗體分子的可變區，它不僅保留了與特異的腫瘤抗原的結合能力，還具有分子小、容易穿透血管到達腫瘤部位的特點(4)本發明融 合蛋白還具有特異抗腫瘤和廣譜抗腫瘤的特點。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1融合蛋白的製備從單克隆抗體細胞株或噬菌體抗體庫中，篩選出編碼抗hCG beta抗體可變區的 cDNA，構建成單鏈抗體cDNA，再與人IL2cDNA連接成單鏈嵌合cDNA，進而在CHO細胞中表達，從而製得的本發明的融合蛋白hCGbeta-scFv_IL2或hCGbeta-scFvFc_IL2(結構示意圖如圖1所示)。實施例2hCGbeta-scFv-IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 融合蛋白的檢測(a) IL2效價測定用常規的IL2生長依賴的細胞株CTLL-2/MTT比色法進行。方法如下(1)製備細胞懸液取足量CTLL-2細胞(ATCC TIB-214)培養物離心收集，用基礎液(RPMI1640+10%小牛血清)洗滌3次，然後重懸於基礎培養液，配製成5xl05/ml的細胞懸液，放37 °C保存。(2)製備標準液取1支標準品(2000IU)按說明書要求溶解後，用基礎培養液稀釋至 200IU/ml。(3)將待檢樣品(原液，按照IX 106IU/mg計算)用基礎培養液稀釋至200IU/ml。(4)在96孔細胞培養板中，將配好的標準液(200IU/ml)和樣品(200IU/ml)溶液繼續以倍比稀釋做梯度稀釋，標準品和樣品同做8個稀釋度，每個梯度做3個復孔。(5)加入細胞懸浮液並培養每孔加入50ul細胞懸液，置37°C，5% C02培養19小時。(6)加入MTT並培養每孔加入20ul MTT溶液，37°C，5% C02培養5小時。(7)加入裂解液並保溫每孔加入150ul裂解液，37°C保溫20小時。(8)在酶標儀上比色，測定波長570nm，記錄測定結果。(9)用電腦程式或直線回歸計算法進行處理。分別計算各待檢樣品的半效稀釋倍數(即從待檢樣本溶液至相當於標準品50%最大效應點的稀釋倍數)，並按下列公式計算結果待檢樣品效價=標準品效價X (待檢樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數)X(待檢樣品半效稀釋倍數/標準品半效稀釋倍數)比活性計算所測的活性效價與其蛋白濃度之比即為比活性，其單位為IU/mg(b) hCGbeta-scFv-IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 的特異結合活性
採用常規的「固定Raji細胞或其他能與相應單抗結合的細胞流式細胞儀檢測」測定。方法如下 (1)固定細胞，如Raji細胞a.將培養的Raji細胞離心IOOOrpm 6分鐘；b.用 PBS 清洗 1 次 IOOOrpm 6 分鐘；c.將配好含有2%多聚甲醛的PBS加入Raji細胞中固定，室溫15分鐘，在此其間要不斷地輕輕地吹打細胞；d. 15分鐘後，離心IOOOrpm 6分鐘；e.去上清，加入含有0. 02%疊氮鈉的PBS中；f.細胞計數，調節細胞濃度至6xl06/ml(2)吸上述固定細胞，實驗細胞所需量為每管2xl06，將細胞放入印pdorf管中，細胞離心IOOOrpm 6分鐘，棄上清；(3)加入一抗(即 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 融合蛋白濃度為 lmg/ml的樣品)，每管5ul，冰箱4°C保存，25分鐘；(4)加入PBS清洗2次，離心IOOOrpm 6分鐘；(5)離心棄上清，加入二抗(抗人或抗小鼠IgG抗體-FITC偶聯物，購自Sigma Co 公司)2ul，避光保存4°C 25分鐘；(6)用PBS清洗2次，準備上機作流式細胞儀檢測。(C)分子量鑑定用常規的5 %、8 % 和 15 % 的 SDS-PAGE 測定 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc-IL2融合蛋白的分子量。(d)半衰期測定取Wistar 大鼠測定 125I 標記 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 的血藥濃度時間_曲線。實驗動物在受試前3天開始餵食碘溶液，以封閉甲狀腺，該處理直至試驗結束。試驗設高、中、低3個劑量組，氯胺酮淺麻醉，給藥體積為0. 5ml。Wistar大鼠給藥劑量如下高劑量組5mg/kg，中劑量組0. 5mg/kg，低劑量組0. 05mg/kg在給藥後30秒到96小時共設置10個時間點取血測定血藥濃度。檢測方法將血樣在5000rpm下離心10分鐘，分離血漿，取10 μ 1，測量沉澱前放射性計數率， 然後以TCA沉澱，棄去上清液，測量沉澱後的放射性計數率，用γ放射免疫計數器測量放射性計數率，計算沉澱後與沉澱前放射性計數率之比為TCA沉澱率，同時以TCA沉澱後的放射性計數率，通過TCA沉澱後的標準曲線，得到受試藥物濃度，繪製血藥_濃度曲線。結果顯示Wistar 大鼠體內的 hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 平均半衰期明顯延長。實施例3藥物組合物按製藥領域中常用的混合法配製以下藥物組合物。單用hCGbeta-scFv_IL2 或 hCGbeta-scFvFc_IL2 的配方
白蛋白lg/100ml甘露醇5% 5g/100ml
土溫 80 0. 02% 20mg/100mlhCGbeta-scFv-IL2 lmg/ml緩衝液PBS適應癥結直腸癌、非小細胞肺癌或膀胱癌。實施例4用IL2蛋白或scFv蛋白或scFv-IL2融合蛋白對荷瘤小鼠進行體內腫瘤抑制試驗，比較三種蛋白對腫瘤的抑制情況。取Balb/C小鼠28隻，在每隻小鼠的左側腹股溝處接種2xl06Cells/0. ImL的 SP2/0-hCGbeta細胞(轉染了 hCGbeta基因的SP2/0細胞株)。當7-11天時，剛可觸及腫塊，然後將小鼠隨機分成四組。一組為對照組，只接種PBS，另外三組小鼠分別接種等克分子的IL2或scFv或scFv-IL2蛋白。約過三周後，此時對照組小鼠因腫瘤過大而開始死亡，殺死所有對照組和實驗組小鼠，取瘤、稱重記錄。相同實驗進行三次，統計所有實驗數據。討論隨著生物工程技術的快速發展，已為生物合成腫瘤細胞特異性抗體與細胞因子的融合蛋白提供了一個極其有效的方法。這些抗體融合蛋白具有一種全新的性質，不僅保留了抗體對腫瘤相關抗原的特異性作用，而且又有細胞因子的生物學功能，是一種雙功能生物分子。它可以通過腫瘤特異性抗體的靶向作用，在腫瘤組織的局部區域集中了大量的細胞因子，誘導免疫反應，抑制腫瘤活性而又能避免產生全身毒性。事實上，在過去二十年中， 國外研究人員已經利用不同腫瘤表面抗原，針對各種腫瘤製備了多種各具特色的抗體-細胞因子融合蛋白[13. Gafner V, et al, 2006. An engineered antibody-interleukin-12 fusion protein with enhanced tumor vascular targeting properties.Int J Cancer.119(9) 2205-12 ；14.Muller D, et al. ,2008. A novel antibody-4-lBBL fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy. J Immunother. 31 (8) 714-722]。臨床前的小鼠試驗結果表明，這種抗體-細胞因子融合蛋白是非常有效的抗癌藥物，抗體-細胞因子融合蛋白不僅可以靶向到腫瘤組織，而且產生了極好的抗腫瘤反應，在某些情況下會導致腫瘤徹底消除[15. Ortiz-ScSnchez E，et al. ,2008. Antibody-cytokine fusion proteins !applications in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther. 8 (7) : 1037 ; 16· Halin C，Miiller D，2003· Synergistic therapeutic effects of a tumor targeting antibody fragment， fused to interleukin 12 and to tumor necrosis factor alpha.Cancer Res. 63 (12) :3202_3210 ；17. Heuser C，et al.，2003. Anti-CD30-IL_12 antibody-cytokine fusion protein that induces IFN-gamma secretion of T cells and NK cell-mediated lysis of Hodgkin/r s 1 ymphoma-derived tumor cells. Int J Cancer. 106(4) :545_52.]。由於它的應用價值正日益顯現，這些年來抗體-細胞因子融合蛋白的數量和多樣性都在不斷增加[18. Carter PJ. 2006. Potent antibody therapeutics by design. Nat Rev Immunol. 6(5) :343.]。事實上，在各種抗腫瘤抗體-細胞因子融合蛋白中，使用最廣的細胞因子就是IL2，其融合蛋白在抗腫瘤動物模型實驗中的結果也是最成功的[23. Helguera G，et al,2005.Antibody-cytokine fusion proteins for the therapy of cancer. Methods Mol Med. 109 347-374 ；24. Heuser C，et al，2004. Anti_CD30-scFv-Fc-IL_2 antibody-cytokine fusion protein that induces resting NK cells to highly efficient cytolysis of Hodgkin 「 s lymphoma derived tumour cells.Int J Cancer. 110(3) 386-394 ；25. Ruehlmann JM，et al，200L MIG(CXCL9)chemokine gene therapy combines with antibody-cytokine fusion protein to suppress growth and dissemination of murine colon carcinoma. Cancer Res. 61 (23) :8498_8503 ； 26. Matsumoto H，et al,2002. Targeting of interleukin—2 to human MK—l—expressing carcinoma by fusion with a single-chain Fv of anti-MK-I antibody. Anticancer Res.22(4) 2001-2007 ；27. Marlind, J. et al.2008. Antibody-mediated delivery of interleukin—2 to the stroma of breast cancer strongly enhances the potency of chemotherapy. Clin Cancer Res. 14(20)6515-6524 ；28.Hirsch, B. et al. 2009. Anti_CD30 human IL-2 fusion proteins display strong and specific cytotoxicity in vivo. Curr Drug Targets. 10(2)110-117 ；29.Ronca, R. et al. 2009. Delivering cytokines at tumor site :The immunocytokine-conjugated anti-EDB-fibronectin antibody case. Immunobiology. 214(9-10) :800_810·]。本發明的研究也表明，抗腫瘤抗體-IL2融合蛋白在靶向治療腫瘤細胞中是有效的。此外，通過與抗人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基單抗的融合，使得融合蛋白不僅具有優異的針對腫瘤細胞的靶向性，而且具有更長的半衰期，從而使得IL2的治療效果大幅提
尚O此外，本發明採用抗體分子的可變區，它不僅保留了與特異的腫瘤抗原的結合能力，還具有分子小、容易穿透血管到達腫瘤部位的特點；將它與細胞因子連接成融合蛋白， 既有靶向作用又具細胞免疫反應功能，因而是一種潛在的雙功能抗體生物治療藥物。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種融合蛋白，其特徵在於，它包括(a)抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)β亞基的單抗元件，該單抗元件的結構如下L-H-Cm(式 I)；式中，L為單鏈形式的抗體輕鏈或其保留結合活性的片段；H為單鏈形式的抗體重鏈或其保留結合活性的片段；C為單鏈形式的抗體恆定區或其片段；m為 或1 ；「_」表示肽鍵或連接肽；(b)白細胞介素2元件，該元件由全長人白細胞介素2、或保留活性的白細胞介素2突變蛋白或其活性片段的胺基酸序列構成；以及(c)任選的、位於抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)β亞基的單抗元件和白細胞介素2元件之間的連接肽序列。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的單抗元件是單鏈抗體。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的接頭肽序列含3-15個胺基酸。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的抗體重鏈和抗體輕鏈為IgGl、 IgG2、IgG3、或IgG4亞類，且連接肽或位於抗體重鏈或輕鏈的羧基端和白細胞介素2元件的胺基酸之間。
5.一種分離的DNA分子，其特徵在於，它編碼權利要求1所述融合蛋白。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求5所述的DNA分子。
7.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體或基因組中整合有權利要求5所述的DNA分子。
8.—種產生權利要求1所述的融合蛋白的方法，其特徵在於，它包括步驟在表達所述融合蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞，從而表達出權利要求1所述的融合蛋白；和分離出所述的融合蛋白。
9.一種藥物組合物，其特徵在於，包括安全有效量的權利要求1所述的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑。
10.權利要求1所述的融合蛋白的用途，其特徵在於，用於製備治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發明涉及抗人絨毛膜促性腺激素抗體-白介素2融合蛋白的製備及其應用。具體地，本發明提供了重組的抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)β亞基單抗或其活性片段與白細胞介素2(IL2)的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程製備該融合蛋白的方法，以及含該融合蛋白的藥物組合物。本發明的融合蛋白具有廣譜抗腫瘤的治療作用，且特異性好、半衰期長。
文檔編號C07K19/00GK102372780SQ201010260240
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者王鍵, 申慶祥, 蔣俶 申請人:上海市計劃生育科學研究所