用於結合血管生成性靶組織以在手術中顯影腫瘤邊緣的抗體－染料結合物的製作方法
2023-06-08 15:56:26 1
專利名稱：用於結合血管生成性靶組織以在手術中顯影腫瘤邊緣的抗體－染料結合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及適合於結合新形成的血管結構的抗體—染料結合物以及在手術中顯影病理血管生成的應用。
在成年人機體中，除非常少的個別情況(如孕齡婦女的周期)外，不發生新的血管形成。但是，在許多疾病中卻可觀察到新的血管形成。發生新血管形成的過程在此稱為血管生成，而且作為對某些信號的應答而發生。
血管生成是一個優選在病灶的邊緣區域發生的過程。由病灶的中心釋放因子，擴散至病灶的邊緣區域。這些因子也稱為血管生成刺激劑。如果這些血管生成刺激劑到達病灶邊緣區域周圍的健康組織，預先沒有與病灶成為一體的血管被刺激形成新的血管芽。由這些血管芽生長的血管在病灶的邊緣區域中形成新的毛細血管網絡。通過該過程，總是可以確保對病灶的合適營養輸送。現已證明特別重要的是，腫瘤及其轉移物的生長取決於誘導血管生成的能力。
在治療局部的病灶時，手術療法目前是標準的措施。其在治療腫瘤時具有非常大的重要意義。但是已經證明，儘管手術技術已有很大的提高，但局部復發的數量仍是相當大的，這是因為在人體中的手術很少能夠大規模地除去病灶。在許多器官(如腦)中，必須避免大規模除去病灶，以得到健康組織。損壞健康器官的風險將隨著手術介入的劇烈程度而增加。
但是，在完成手術除去腫瘤後，對腫瘤邊緣區域的組織學研究表明，相當數量的腫瘤不能被完全除去，而且腫瘤殘餘仍留在體內。其他的腫瘤生長以及腫瘤轉移都有可能源自於這些腫瘤殘餘。在手術治療期間精確表明疾病過程相對於健康組織的範圍能夠使得完全除去病灶，並最大程度地使健康組織不受影響。
用於顯影病灶的染料是眾所周知的(Poon，W.S.等人，J.Neurosurgery(1992)76679-686；Haglund，M.M.等人，Neurosurgery(1996)38308-317)。它們優選從腫瘤細胞直接吸收或者非特異性地累積於腫瘤的細胞外空間。因為即使在健康組織中的濃度也可檢測該機理，所以所用物質的特異性和靈敏度較低。
可用於通過選擇性地顯影病灶的邊緣區域而在手術中顯出病灶輪廓的化合物目前還是未知的。
血管生成優選發生在病灶的邊緣區域中。通過顯影血管生成，也可顯影健康組織的範圍。用於檢測病灶中血管生成的抗體是已知的，而且可用於顯影組織學組織切片中的新形成血管，用於檢測病灶中的各種蛋白或者作為治療物質的載體分子。
然而，可用於通過選擇性地顯影病灶的邊緣區域而在手術中顯出病灶輪廓的與染料結合的抗體，即所謂的抗體—染料結合物仍是未知的。
因此，本發明的目的是製備用於手術中顯影腫瘤邊緣的抗體—染料結合物。根據本發明的抗體—染料結合物中的抗體針對血管生成過程中特異性的物質。根據本發明的抗體—染料結合物包括可通過其濃集而光學顯影的染料。
因為血管生成在病灶的邊緣區域最強，在此產生最大的光學信號。
因此，根據本發明的抗體—染料結合物適合於通過手術中的光學診斷顯影相對於健康組織的病灶範圍，即所謂的邊緣區域。其結果是，可完全除去病灶，而最大程度地不影響健康組織。
針對血管原性組織中強烈表達而且在相鄰組織中僅非常低水平表達的物質的抗體是已知的(WO 96/01653)。
針對血管生長因子的受體、炎症介質所結合的內皮細胞上的受體、基質分子所結合的內皮細胞上的受體、以及在新血管形成中特異性表達的基質蛋白的抗體，對於抗體—染料結合物是特別有用的(Brekken等人，Cancer Res.(1998)581952-9；以及Schold，S.C.Jr.等人，Invest.Radiol.(1993)28488-96)。
抗基質蛋白EDB-纖連蛋白的抗體或者抗體片段是優選的。EDB-纖連蛋白(EDBFN)也稱為胎性癌纖連蛋白，是纖連蛋白的剪接變體，可在血管生成過程中特異性地形成新形成血管。抗EDB-纖連蛋白的抗體的特別優點包括在除去病灶時不會由於手術中的損傷在健康組織中新形成任何EDB-纖連蛋白。在此方面，在手術過程中都保持該特異性。但是，在接近病灶的健康組織中，在手術中仍然新形成抗內皮細胞上的生長因子受體或者炎症介質而且在腫瘤邊緣區域中特異性表達的抗體。
在本發明的抗體—染料結合物中特別優選的是抗EDB-纖連蛋白的抗體L19和E8(Viti，F.等人，Cancer Res.(1999)59347-352)。此等抗體染料結合物也是本發明的主題。
已知的抗體與染料結合，該染料在組織中的濃集可光學檢測，而且可在手術中顯影病灶邊緣區域的輪廓。
根據本發明的抗體—染料結合物的優點是，其可用於選擇性地螢光染色新血管原性階段的組織。螢光染色是腫瘤特異性的，而且產生可以高信噪比檢測的螢光信號。
用於螢光成像的抗體—染料結合物對於經皮非侵入性地顯影腫瘤也是已知的(Neri，D.等人，Nature Biotechnology(1997)151271-1275)。但是，優選累積於病灶邊緣區域中的抗體—染料結合物仍是未知的。
用於手術中腫瘤顯影的蛋白—染料結合物也是已知的。
這些結合物的缺陷是，特別缺氧而且代謝營養不足的腫瘤細胞吸收結合物。但是，因為腫瘤邊緣區域中的組織是可良好血管化的，而且在此方面細胞被供給充足的氧和營養，所以已知的蛋白—染料結合物不可能充分地累積。
然而，根據本發明的抗體—染料結合物很大程度上獨立於病灶的代謝狀態。
雖然可以用不同的方式對病灶的範圍進行光學檢測，但通常優選檢測相應的刺雷射所誘發的染料特異性螢光輻射。根據發射波長，在此情況下螢光可直接用肉眼檢測或者用顯微鏡檢測，並同時任選地用成像檢測系統進行數字記錄，在顯示器上觀看。
400-650nm光譜範圍的螢光輻射是可肉眼檢測的。特別優選的波長是450-600nm。使用可見光的特別優點是，檢測螢光的技術成本低。用合適的雷射或者雷射二極體產生的刺雷射連接至光纖光導器中，並通過後者傳遞到待診斷的區域。用大規模的輻射面積可對手術中的腫瘤邊緣實施檢測。反射的刺雷射被濾光器(例如，研究人員配戴的濾光鏡)阻斷，而僅有染料特異性的螢光被觀察到(肉眼觀察)。或者，可用顯微鏡來檢測螢光(顯微鏡觀察)。通過可見光在組織中的小的穿透深度(幾毫米)，可按此方式檢測位於表面上的新血管形成。
光譜範圍的可見光的另一個優點是，在組織中的穿透深度以及由組織中的發射小。因此，可檢測的信號不會被來自更深部分的組織的信號扭曲，而且可特異性地確定在表面上可見的組織結構。
本發明的主題還包括抗體—染料結合物，其中所述染料誘發可見光範圍的光信號。
但是，使用其中染料吸收近紅外範圍的光(NIR，600-900nm)的抗體—染料結合物可檢測更深層組織(最大達1cm)的新血管形成，這是因為NIR光的組織吸收性更弱，因此具有更大的組織穿透深度。不可能用肉眼觀察螢光，但可通過設置在目標組織區域上的CCD攝像機(電耦裝置攝像機)來進行。肉眼檢測和顯微鏡檢測是可能的。如果必須評估被遮蓋的區域(如血液)，在抗體—染料結合物中使用在NIR光譜範圍中有吸收並發出螢光的染料的優點發生作用。
從光物理的角度看，在400-800nm的光譜範圍具有最大吸收而且在500-900nm的範圍內具有至少一個最大螢光的染料對於抗體—染料結合物是合適的。
本發明的主題還包括抗體—染料結合物，其特徵在於，在僅使用可見光或者近紅外光範圍的確定波長時，染料誘發螢光信號。
抗體—染料結合物中所包括的具有可肉眼檢測的螢光的染料例如選自於以下組中螢光素、螢光素—異硫氰酸酯、羧基螢光素或者鈣黃綠素、四溴螢光素或者曙紅、四碘螢光素或者赤鮮紅、二氟螢光素，如Oregon GreenTM488、Oregon GreenTM500、或者Oregon GreenTM514，羧基對甲氨基酚(Rhodol GreenTM)—染料(US 5,227,487、US 5,442,045)，羧基若丹明染料(如Rhodamine GreenTM染料)(US 5,366,860)；4，4-二氟-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-indacene，如Bodipy FL、Bodipy 493/503、或Bodipy 530/550及其衍生物(US 4,774,339、US5,187,288、US 5,248,782、US5,433,896、以及US 5,451,663)；菁染料，特別是羰花菁染料和部花菁染料；香豆素染料，如7-氨基-4-甲基香豆素，DTPA或者四氮雜大環烯(環烯、pyclene)與鋱或者銪的金屬絡合物或者四吡咯染料，特別是卟啉。
包含近紅外染料的抗體—染料結合物例如選自於以下組中多亞甲基染料，如二羰花菁、三羰花菁、部花菁和氧雜菁染料(WO96/17628)；若丹明染料；苯並惡嗪或者苯並噻嗪染料；四吡咯染料，特別是苯並卟啉、chorine和酞菁。
抗體—染料結合物中優選的近紅外染料是在700-800nm之間具有最大吸收的花菁染料，特別是茚二羰花菁和茚三羰花菁。
在抗體—染料結合物中通常優選的染料是以上組中具有一個或者多個羧基者，該羧基在化學活化後與抗體或者抗體片段的氨基偶聯。那些包含馬來醯亞胺基或者溴代烷基的衍生物也是優選的，使得可以與胺基酸半胱氨酸的巰基共價偶聯。另外，具有異硫氰酸基的染料也是優選的，該基團也可以與氨基反應。
再者，抗體—染料結合物中的染料必須具有高度的光穩定性，而且在光的輻射(光漂白)下不會被漂白，以確保研究期間恆定的信號。
本發明的主題是抗體—染料結合物，該結合物累積於病灶的細胞組織的邊緣區域，並由此使病灶的邊緣區域可光學檢測。
具體而言，本發明的主題是以下通式I表示的抗體—染料結合物B-(F)n(I)其中B代表與ED-BFN具有高度結合性的抗體或者抗體片段；F代表選自於以下組中的染料香豆素、螢光素、羧基螢光素、二氟螢光素、四溴螢光素、四碘螢光素、若丹明、羧基若丹明、羧基對甲氨基酚、4，4-二氟-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-indacene、多亞甲基染料、或者四吡咯染料、或者DTPA或者環烯與鋱或者銪的金屬絡合物及其衍生物；和n代表1-5。
本發明的抗體—染料結合物特別優選的是，染料為花菁染料、部花菁染料、氧雜菁染料、苯乙烯基染料或者squarilium染料。
本發明的抗體—染料結合物特別優選染料部分是花菁染料，特別是羰花菁、二羰花菁或者三羰花菁。
因此，本發明還特別涉及以下抗體—染料結合物，其中通式I中的染料-(F)n是以下通式II的花菁染料 其中D代表以下基團III或IV， 其中星號標記的位置代表與基團B的連接位置，以及B代表以下基團V、VI、VII、VIII或IX， 其中R1和R2代表C1-C4磺烷基，飽和或不飽和、直鏈或支鏈的C1-C50烷基鏈，該烷基鏈任選被最多15個氧原子、和/或最多3個羰基、和/或最多5個羥基取代，R3代表基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、
-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2相互獨立地代表氫原子、C1-C4磺烷基、飽和或不飽和、直鏈或支鏈的C1-C50烷基鏈，該烷基鏈任選被最多15個氧原子、和/或最多3個羰基、和/或最多5個羥基取代，R4代表氫原子或者氟、氯、溴或碘原子，b代表2或3，X代表氧、硫、或者基團＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及L代表直接鍵或者連接基團，該連接基團是具有最多20個碳原子的直鏈或支鏈碳鏈，該碳鏈可被一個或多個-OH、-COOH、或SO3基團取代，和/或插入一個或多個-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH-、-NHCO-、-NHCSNH-、-SO2-、PO4-、或-NH-或者芳基環。
根據本發明的抗體—染料結合物可單獨使用或者配製成製劑使用。
在以製劑形式使用抗體—染料結合物時，除抗體—染料結合物外，該製劑還包含藥物學上可接受的適合於腸道或非胃腸道給藥的無機或有機惰性載體，如水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇等。該藥物製劑可為固體劑型，如片劑、包衣片、栓劑、膠囊，或者是液體劑型，例如溶液劑、混懸劑或乳劑。該製劑還可任選地包含輔劑如防腐劑、穩定劑、溼潤劑或者乳化劑、用於改變滲透壓的鹽或者緩衝劑。
在非胃腸道使用時，注射液或者混懸劑、特別是抗體—染料結合物的水溶液是合適的。
還可使用載體系統，例如表面活性劑，如膽酸鹽或者動物或植物磷脂，以及這些物質的混合物和脂質體或其組分。
在口服使用時，與滑石和/或烴載體或粘結劑如乳糖、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉組合使用的片劑、包衣片或膠囊是特別合適的。也可以液體劑型給藥，如其中添加有甜味劑的糖漿劑。
抗體—染料結合物的劑量可根據以下因素變化給藥方法、患者的年齡和體重、待治療疾病的類型和嚴重程度等。在檢測有限的區域時，抗體—染料結合物的適用劑量為0.5-1000mg，優選50-200mg，其中該劑量可以單劑量一次性給藥或者分為兩個或多個日劑量。
上述製劑和劑型也是本發明的主題。
因此，本發明還涉及藥物，其包括一種或多種用於手術中顯影病灶的邊緣區域的抗體—染料結合物，其中該藥物可單獨使用或者與合適的溶劑、緩衝劑和/或載體混合使用。
根據本發明的抗體—染料結合物可用於手術治療血管生成依賴性疾病，例如惡性腫瘤及其轉移瘤、良性腫瘤、癌前組織變化、子宮內膜異位、血管瘤、和異位懷孕。
本發明的主題還包括抗體—染料結合物和藥物在手術中顯影病灶的應用，特別是在手術中肉眼觀察或者顯微觀察病灶的邊緣區域的應用，以及在製備用於手術治療血管生成依賴性疾病的藥物中的應用，所述疾病是惡性腫瘤及其轉移瘤、良性腫瘤、癌前組織變化、子宮內膜異位、血管瘤、和異位懷孕。染料的製備染料是根據本領域已知的方法來製備的。適合於製備抗體—染料結合物的染料是具有羧基或者異硫氰酸基的染料，以與抗體上的氨基結合。在此情況下，特別優選的是花菁染料(Mujumdar，S.R.等人(1996)7356-362；Flanagan，J.H.等人(1997)8751-756；以及Licha，K.等人(1996)Proc SPIE，第2927卷，192-198)。
具有羧基的染料首先根據本領域已知的方法轉化為反應性酯(如N—羥基琥珀醯亞胺酯)，由此進行活化。具有異硫氰酸基團的染料可直接使用。反應性衍生物然後在緩衝液或者有機溶劑的混合物(如二甲基甲醯胺(DMF)或者二甲基亞碸(DMSO))中與抗體反應。在此情況下，使用3-100倍摩爾過量的染料。在反應完全後，未反應的部分通過超濾和/或色譜法進行分離。
也可用類似的方法製備以下染料。
製備實施例1二-1，1′-(4-磺基丁基)茚羰花菁-5-甲酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯按照類似於文獻中已知的方法，由1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚和1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-5-羧基-3H-假吲哚起始製備二-1，1′-(4-磺基丁基)茚羰花菁-5-甲酸(Cytometry 10，11-19，1989；Talanta 39，505-510，1992)。
為轉化成N-羥基琥珀醯亞胺酯，0.1mmol的染料(67mg在10ml的DMF中)與分別為0.5mmol的N-羥基琥珀醯亞胺和二環己基碳化二亞胺(DCC)混合，然後在室溫下攪拌24小時。添加50ml的乙醚後，過濾出固體沉澱物，再用少量的DDF重新溶解二次，沉澱物用乙醚洗滌，然後真空乾燥(產率89％)。抗體—染料結合物的製備製備二-1，1′-(4-磺基丁基)茚羰花菁與L19抗體的結合物抗體L19(1mg在1ml乙酸鈉緩衝液50mM中，pH8.2)與N-羥基琥珀醯亞胺酯(4mg/ml在DMSO中的溶液75μmol)混合，然後在室溫下攪拌2小時。在PD10柱(Pharmacia)上用凝膠過濾進行純制，然後使用Centricon-10管(Amicon)進行濃縮，同時得到約1mg/ml的抗體溶液。
最大吸收555nm最大螢光582nm以下實施例是用於說明本發明的抗體—染料結合物的生物應用性，但其並不僅限於該應用實施例。應用實施例1體內對攜帶腫瘤的裸鼠進行螢光成像並在活體外顯微檢查腫瘤組織在注射於攜帶腫瘤的裸鼠後，體內檢查根據本發明的化合物的成像性質。為此目的，靜脈給藥0.1-2μmol/kg的物質，然後在0-48小時內觀察腫瘤區域中的濃度。用相應波長的光照射動物，由此誘發物質的螢光，所述光是用雷射單色產生的(二極體雷射、固態雷射)或者是用濾光器由Hg或Xe燈的多色發光中過濾出來的。在使用如製備實施例1中描述的化合物時，使用由NdYAG雷射產生的波長為540nm的光進行激發，以刺激試驗動物，然後用增強型CCD攝像機檢測＞580nm波長處的螢光輻射，同時得到整體螢光圖象。平行地用肉眼及照相檢測螢光。由腫瘤材料製備切片，並用顯微鏡(Zeiss Axiovert顯微鏡，具有Cy3濾光器)進行研究。
在攜帶F9-畸胎樣瘤的裸鼠中注射製備實施例1中提到的抗體—染料結合物1μmol/kg，接著可在4小時後檢測螢光信號的增加，以便根據整體螢光圖象與正常組織進行對比。
在製備腫瘤的表皮以及最上層組織後，螢光可以與腫瘤的邊緣區域結合。顯微鏡評估腫瘤切片產生更高的螢光，該螢光用腫瘤邊緣區域的血管進行校正。
權利要求
1.一種抗體—染料結合物，其特徵在於優先在病灶的細胞組織的邊緣區域中累積，並由此使得可以光學檢測病灶的邊緣區域。
2.如權利要求1所述的抗體—染料結合物，其具有以下通式IB-(F)n(I)其中B代表與EDB-纖連蛋白具有高度結合性的抗體或者抗體片段；F代表選自於以下組中的染料香豆素、螢光素、羧基螢光素、二氟螢光素、四溴螢光素、四碘螢光素、若丹明、羧基若丹明、羧基對甲氨基酚、4，4-二氟-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-indacene、多亞甲基染料、或者四吡咯染料、或者DTPA或者環烯與鋱或者銪的金屬絡合物及其衍生物；和n代表1-5。
3.如權利要求1或2所述的抗體—染料結合物，其中所述染料為花菁染料、部花菁染料、氧雜菁染料、苯乙烯基染料或者squarilium染料。
4.如權利要求1-3之一所述的抗體—染料結合物，其中所述染料是花菁染料，如羰花菁、二羰花菁或者三羰花菁。
5.如權利要求1-4之一所述的抗體—染料結合物，其中通式I中的染料-(F)n是以下通式II的花菁染料 其中D代表以下基團III或IV， 其中星號標記的位置代表與基團B的連接位置，以及B代表以下基團V、VI、VII、VIII或IX， 其中R1和R2代表C1-C4磺烷基，飽和或不飽和、直鏈或支鏈的C1-C50烷基鏈，該烷基鏈任選被最多15個氧原子、和/或最多3個羰基、和/或最多5個羥基取代，R3代表基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2相互獨立地代表氫原子、C1-C4磺烷基、飽和或不飽和、直鏈或支鏈的C1-C50烷基，該烷基任選被最多15個氧原子、和/或最多3個羰基、和/或最多5個羥基取代，R4代表氫原子或者氟、氯、溴或碘原子，b代表2或3，X代表氧、硫、或者基團＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及L代表直接鍵或者連接基團，該連接基團是具有最多20個碳原子的直鏈或支鏈碳鏈，該碳鏈可被一個或多個-OH、-COOH、或SO3基團取代，和/或任選地插入一個或多個-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH-、-NHCO-、-NHCSNH-、-SO2-、PO4-、或-NH-或者芳基環。
6.如權利要求1-5之一所述的抗體—染料結合物，其中所述抗體是抗體L19和E8。
7.如權利要求1-6之一所述的抗體—染料結合物，其中染料在可見光範圍內誘發光信號。
8.如權利要求1-6之一所述的抗體—染料結合物，其中僅在使用確定波長範圍的可見光或者近紅外光時染料誘發光信號。
9.一種用於手術中顯影病灶邊緣區域的藥物，其包含一種或多種如權利要求1-8之一所述的抗體—染料結合物。
10.如權利要求9所述的藥物，其是與合適的溶劑、緩衝劑和/或載體的混合物。
11.如權利要求1-10之一所述的抗體—染料結合物或藥物在手術中顯影病灶的應用。
12.如權利要求1-10之一所述的抗體—染料結合物或藥物在手術中顯影病灶邊緣區域的應用。
13.如權利要求1-10之一所述的抗體—染料結合物或藥物在手術中肉眼觀察或者顯微觀察病灶的邊緣區域的應用。
14.如權利要求1-8之一所述的抗體—染料結合物在製備用於手術治療血管生成依賴性疾病的藥物中的應用，所述疾病是惡性腫瘤及其轉移瘤、良性腫瘤、癌前組織變化、子宮內膜異位、血管瘤、和異位懷孕。
全文摘要
本發明涉及適合於結合新形成的血管的抗體—染料結合物以及在手術中顯影病理血管生成的應用。
文檔編號A61K47/48GK1376074SQ00813295
公開日2002年10月23日 申請日期2000年8月19日 優先權日1999年9月24日
發明者米夏埃爾·席爾納, 凱·利夏, 盧德格爾·丁克爾博格 申請人:舍林股份公司