基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的製備工藝的製作方法

2023-06-08 17:02:11 2

專利名稱：基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程、重組人源銅鋅超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)的製備工藝。
超氧化物歧化酶(SOD)主要有抗衰老、抗炎症、防輻射、抗氧化等功能，可廣泛應用於化妝品、保健品、食品、醫療等領域。
背景技術：
目前，國內生產的SOD，主要從天然生物體中提取，其中，以動物血液提取SOD為主，由於血液製品提取的SOD，存在著外源性感染的危險性和非人源製品用於人體有抗原性，在醫療等領域很難發揮其應有的作用。從血液中提取SOD，原料來源有限，成本高、而且人血製品有外源性感染的危險性(如肝炎病毒、愛滋病毒、支原體、衣原體等)。因此不易推廣，難以形成批量生產。

發明內容
本發明目的是提供一種重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的製備工藝，本工藝原料充足、成本低、無外源性汙染的危險性和免疫抗原性。而且生產的SOD活性半衰期長(水劑常溫10天，水劑冷凍2年，冰乾粉2、5-3年)。這樣，應用領域可更加廣泛。
基因重組人源銅鋅SOD的製備工藝其技術方案特點是挑取工程菌單菌落接種在含氨苄的LB培養基斜面培養，然後接種到含AMAP100μg/mlLB培養基的三角瓶中，30℃，180轉/分振蕩培養10小時，OD值達到1.0時，收集菌液；取菌液以1∶10的比例，接種到含有AMP100μg/ml的改良M9培養基的發酵罐中，30℃培養6小時，OD值達2.5-3.0時，迅速升溫至42℃，熱激誘導表達，然後在培養3-4小時，離心收集菌體，用0.9％的NaCl洗兩次後，再用PH7.8TES緩衝液懸浮菌體，冰浴條件下攪拌30分鐘，加入稀釋6倍的TES溶液冰浴條件下攪拌40分鐘，離心取上清液，離心的菌體加TES溶液冷凍，取出速暖到冰水混合物狀，加入稀釋6倍數的TES溶液，攪拌40分鐘，離心取上清液，將上述上清液經超濾濃縮，得粗酶液，粗酶液經透析，DEAE-Sephadex-A50離子交換柱層析，使其全部進入膠面，再用Sephadex-200分子篩柱層析，收集Cu、Zn-SOD活力部分。自動餾分收集器收集、冷凍、乾燥。
目的蛋白以分泌性表達到細菌內膜、外膜之間的周質腔中，並且目的蛋白本身具有生物學活性，不需要進行體外變性，復性處理。因為滲透壓法破壞了細胞外膜，所以，目的蛋白經緩衝液抽提，再經離子交換，分子篩柱層析就進一步得到純化。
本發明與現有技術相比，由於基因重組人源銅鋅SOD，半衰期長，因此，產品質量穩定，還有產量高，成本低、工藝簡單等優點。
具體實施例方式1、搖床培養挑取工程菌(Cu、Zn-SOD/DH5α)的單菌落接種在含LB培養基(每升含蛋白腖10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，氨基苄100μg/ml，瓊脂粉15g)進行斜面培養。然後轉入填加AMP100μg/mlLB加培養基的三角瓶中，在30℃振蕩培養10小時，OD值達到1、0時，收集菌液。
2、發酵缶培養將上述培養的菌液以1∶10的比例，接種於含有改良M9培養基(配方每升含K2HPO46g、KH2PO43g、(NH4)2SO41.5g、NaCl0.5g蛋白腖6g，酵母粉3g、1M MgSO4，葡萄糖10-20g，AMP100μg/ml、Cu2+0.5mM、Zn2+0.01mM)20L發酵缶中，在30℃進行發酵培養5-6小時，OD值達2.5-3.0，迅速升溫42℃，熱激誘導表達，通過升溫，使阻遏蛋白失活，啟動子開始啟動，SOD蛋白基因開始表達SOD蛋白，再培養3-4小時，細菌生長到平衡期開始放罐，離心，得菌體500g。
3、目的蛋白粗提取溼菌體500g，用0.9％的NaCl洗兩次，然後用1000ml，PH7.8的TES緩衝液懸浮菌體(TES溶液配方0.2M Tris.HCl，0.5mMEDTA，5M蔗糖)冰浴下攪拌30分鐘後，加入稀釋6倍的TES溶液化1500ml再懸浮菌體，12000轉/分離心，取上清液，把菌體用於500mlTES溶液懸浮冷凍，取出速暖至冰水混合物狀，再加入750ml稀釋6倍的TES溶液，攪拌40分鐘後，12000轉/分離心，取上清液備用，再用稀釋6倍TES溶液500ML懸浮，12000轉/分離心取上清液，合併上清液共4250ml溶液。超濾濃縮至500ml溶液，此即為粗酶液4、目的蛋白的精提DEAE-Sephadex-A50離子交換柱層析。
(1)、粗蛋白在PH7.8層析用緩衝溶液10mMPBS(PBS緩衝液配方每升NaH2PO4，NaHPO4)以0.1mM EDTA置於10mMPBS溶液中，粗蛋白在溶液透析過液後，加到PBS平衡過的DEAE-Sephadex-A50柱上，樣品全部進入膠面後，再用10mMPBS溶液進行梯度洗脫。收集目的蛋白峰溶液。
(2)、Sephadex-G200分子篩柱層析收集DEAE-Sephadex-A50洗脫峰中含有Cu、Zn-SOD的酶液活力部分，用超濾器濃縮，在10mMPBS緩衝液中透析過也夜，樣品上柱後用10mMPBS，PH7.8溶液洗脫，自動餾分收集器收集。經離子交換和分子篩柱層析分離後，Cu·Zn-SOD酶純度可達95％以上，15％PAGE電泳可得單一條帶。加入甘露醇即可冷凍乾燥得凍乾粉。目的蛋白獲得率為6.4mg/g菌體，其比活性為1.025萬μ/mg(鄰苯三酚比色法測活)
權利要求
1.一種生物工程基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的製備工藝，其特徵是(1)、挑取工程菌單菌落接種在含氨苄的LB培養基斜面培養，然後接種到含AMP100μg/ml的LB培養基的三角瓶中，30℃、180轉/分，振蕩培養10小時，OD值達到1.0時，收集菌液；(2)、取上述菌液，以1∶10的比例，接種到含有AMP100μg/ml的改良M9培養基的發酵罐中，30℃培養6小時，OD值達2.5-3.0時，迅速升溫至42℃，熱激誘導表達，然後再培養3-4小時，離心收集菌體；(3)、取菌體，用0.9％的NaCl洗兩次，然後用PH7.8TES緩衝液懸浮菌體，冰浴條件下攪拌30分鐘，加入稀釋6倍的TES溶液，冰浴條件下攪拌40分鐘，離心取上清液，離心的菌體加TES溶液冷凍，取出速暖至冰水混合物狀，加入稀釋6倍的TES溶液，攪拌40分鐘，離心取上清液，將上述，上清液經超濾濃縮，得粗酶液；(4)、粗酶液經透析DEAE-Sephadex-A50離子交換柱層析，其全部進入膠面後，再用PBS緩衝液進行梯度洗脫，收集目的蛋白峰溶液，再用Sephadex-200分子篩柱層析，收集含Cu·Zn-SOD酶的活力部分，用PH7.8PBS溶液洗脫，自動餾分收集器收集，冷凍、乾燥。
2.根據權利要求書1所述的基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶製備工藝，其特徵是目的蛋白獲得率為6.4mg/克菌體，目的蛋白比活性為1.025萬μ/mg。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程，基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的製備工藝，其特徵是首先進行工程菌發酵擴增，熱激誘導，收集菌體。經緩衝液抽提、再經離子交換、分子篩柱層析分離純化。本發明具有工藝流程簡單、SOD半衰期長、產量高、單位成本低等優點，本產品可廣泛應用在化妝品、保健食品、醫療等領域。
文檔編號C07K1/00GK1448507SQ02108299
公開日2003年10月15日 申請日期2002年3月29日 優先權日2002年3月29日
發明者董偉東, 劉兆柯, 路海源 申請人:四平市科學技術研究院