一種超級工程菌及其表達的解毒酶和其構建方法及應用的製作方法

2023-06-09 03:39:06

專利名稱：一種超級工程菌及其表達的解毒酶和其構建方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種超級工程菌及其構建和應用，以及該超級工程菌表達的解毒酶及其應用，具體地說是涉及一種可以降解農藥殘留的超級工程菌和其表達的解毒酶，以及它們的構建方法和應用。
背景技術：
現代農業生產為滿足人們糧食高產的願望，發揮了巨大的作用，一度被奉為第三世界國家擺脫貧困和飢餓的靈丹妙藥。然而面對現代農業中農副產品品質的下降、生物多樣性的減少，面對農作物病蟲害的日益猖獗、農業資源的浪費、農業環境的退化，面對非洲糧食危機的有增無減，人們在欣喜之餘，逐漸產生了一種困惑、一種疑慮，開始重新審視現代農業的利弊，重新認識農業資源環境的內涵，重新思考農業科研與決策的方向。
殺蟲劑(即農藥)是一把雙刃劍，一方面，害蟲大量的侵食農作物，例如在印度，幾乎30％的農作物被害蟲侵食，而全球性的食物短缺危機又要求農作物豐產以滿足人類的生存需求，因而作為保護農作物所使用的殺蟲劑在農業上的應用越來越廣泛，佔到了世界消耗量的3％(Bharati J.Bhadnhade et al.，2002)。另一方面，殺蟲劑的過度使用導致環境的極度農藥汙染，同時造成全球範圍的昆蟲殺蟲劑抗藥性和動物及農作物體內的農藥殘餘(Ch.L Qiao，2003)。這個矛盾將是未來亟待解決的尖銳問題。
常用的殺蟲劑主要有有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類三大類，這三類都會對哺乳動物造成神經毒性。普遍存在於昆蟲體內各種組織中的酯酶(Esterase，簡稱EST)是可以對殺蟲劑解毒的重要水解酶之一，其參與酯類殺蟲劑的解毒作用。不同的水解酶都有著其特定的作用部位，並與之相互作用，將大分子化合物間的鍵水解掉，使之成為小分子化合物或無毒的離子。現已從微生物細胞內分離得到的磷酸三酯酶是一種細菌的有機磷水解酶(OPH)，可以有效水解有機磷類化合物，顯著降低其毒性，但是這種酶不能水解羧酸酯鍵，因而對於氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類的殺蟲劑起不到降毒作用。
我國作為一個農業生產大國，更是生產和使用農藥的大國。大量使用農藥以減輕農產品遭受病蟲害損失的同時，也帶來了日益嚴重的農藥殘留問題。而且由於我國農藥使用缺乏規範管理，農產品農藥殘留普遍超標，導致我國農產品外貿出口遭受重大損失，傳統的出口產品，如水果、茶葉和中草藥等屢屢發生大批量退貨，出口規模嚴重受制。此外，高農殘的蔬菜和水果也會給人的身體健康帶來極大的危害，據衛生部門統計，1999年1～10月，共收到食物中毒報告78起，中毒人數4394人，79人死亡，其中由農藥引起中毒1108人，死亡59人，超過死亡人數的70％。統計還顯示，近年來在食物中毒中，由農藥殘留引起所佔的比例越來越高。同時，長期食用高農殘的食品，會形成慢性神經性中毒，嚴重的會引發老年痴呆等病症。

發明內容
本發明的目的在於為了解決我國作為一個農業生產大國而不得不大量使用農藥，在環境中存在著嚴重的農藥殘留的汙染問題，為了消除農藥殘留汙染對國民經濟造成的損失和對人民健康的危害，從而提供一種能同時有效降解有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類農藥的超級工程菌。
本發明的另一目的在於提供上述超級工程菌表達的解毒酶。
本發明的再一目的在於提供上述超級工程菌和解毒酶的構建方法。
本發明的還一目的在於提供上述超級工程菌和解毒酶的應用。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種降解農藥殘留的超級工程菌，該超級工程菌含有編碼解毒酯酶和水解酶的基因，能表達解毒酯酶和水解酶。
所述的解毒酯酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(i)具有圖1所述的胺基酸序列；或(ii)將圖1所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(i)相同的解毒酯酶功能的衍生的蛋白質。
所述的水解酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(iii)具有圖2所述的胺基酸序列；或(iv)將圖2所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(iii)相同的水解酶功能的衍生的蛋白質。
本發明提供一種上述降解農藥殘留的超級工程菌的構建方法，包括如下步驟1)按常規方法分別克隆解毒酯酶和水解酶的基因所述的解毒酯酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(i)具有圖1所述的胺基酸序列；或(ii)將圖1所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(i)相同的解毒酯酶功能的衍生的蛋白質；所述的水解酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(iii)具有圖2所述的胺基酸序列；或(iv)將圖2所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(iii)相同的水解酶功能的衍生的蛋白質；2)將步驟1)得到的解毒酯酶和水解酶的基因分別克隆到表達載體pETDuet-1上，構建融合表達載體pETDuet-b1-opd根據pET28a-b1載體上的解毒酯酶基因序列和pPNCO33載體上的水解酶基因序列分別設計引物，並以此質粒為模板作PCR擴增；解毒酯酶基因的引物上遊引物5′-GCAGATCTCATGAGTTTGGAAAGCTTAACCGTTC-3′下遊引物5′-CGCTCGAGAAACAGCTCATCAT TCACGTACATTG-3′水解酶基因的引物上遊引物5′ACGGATCCCATGCAAACGAGAAGGG-3′下遊引物5′-GTAAGCTTCATG ACGCCCGCAAGG-3′用PCR方法在解毒酯酶基因b1和水解酶基因opd的前面加上NC的接頭，所述的NC接頭分別為5』-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3』和5』-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3』；將帶有NC接頭的水解酶基因opd的上遊引物引入雙表達載體pETDuet的BamHI位點，下遊引物引入雙表達載體pETDuet的HindIII位點，5』端各引入兩個酶切位點保護鹼基；將帶有NC接頭的解毒酶基因b1的上遊引物引入雙表達載體pETDuet的BglII位點，下遊引物引入雙表達載體pETDuet的XhoI位點，5』端各引入兩個酶切位點保護鹼基；經PCR擴增得到的解毒酯酶和水解酶的基因分別插入雙表達載體pETDuet的多克隆位點，構建得到融合表達載體pETDuet-b1-opd；
3)轉化重組菌株並進行誘導培養將步驟2)構建得到的表達載體pETDuet-b1-opd轉化到大腸桿菌，篩選得到重組菌株；將此重組菌株用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，在14～25℃誘導16～22小時，得到本發明的超級工程菌。
所述步驟1)為分別從抗雙硫磷致倦庫蚊的蚊蟲中克隆得到全長解毒酯酶b1基因，和從細菌中克隆得到全長水解酶opd基因；所述的解毒酯酶b1為具有圖1所述的胺基酸序列的蛋白質；所述的水解酶opd為具有圖2所述的胺基酸序列的蛋白質。
本發明提供一種由上述超級工程菌表達的解毒酶，其為由如下的方法得到的將上述超級工程菌的培養液，在5000xg離心5分鐘，收集經誘導的超級工程菌，重新用PBS調節細菌的濃度為OD600＝1,5000xg離心，5分鐘重新收集細胞，再次加入培養液的1/10的體積(OD600＝1)的PBS，10倍濃縮菌液，細菌菌液中加入溶菌酶使其終濃度為100μg/ml，加入1/10體積的1％Triton X-100，30℃溫浴15分鐘，在冰浴條件下超聲波裂解處理，再離心去除沉澱，得到的上清液即為本發明的超級工程菌表達的解毒酶(B1-OPH)粗酶液。
本發明提供一種上述降解農藥殘留的超級工程菌和解毒酶的用途，該超級工程菌和解毒酶可以同時降解馬拉硫磷、對硫磷、高效氯氰菊酯、三氯殺蟲酯等有機酸酯和有機磷類農藥；可以用於有機磷中毒溫血動物的解毒。
本發明提供的降解農藥殘留的超級工程菌的解毒酶的優益之處在於，其為用分子生物學方法構建的超級工程菌，該超級工程菌利用了可以共表達兩個目的基因的表達載體pETDuet，在載體的多克隆位點上同時引入了表達編碼昆蟲的解毒酯酶基因和細菌的有機磷水解酶的基因，其中酯酶基因在微生物細胞內的融合表達量佔總蛋白量的56％。因而，該超級工程菌和解毒酶同時具有解毒酯酶和水解酶的功能，對農藥殘留的降解譜加寬，對有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等都能有效降解。該超級工程菌和解毒酶具有較高的降解有機酸酯類農藥的能力，在30min即可降解馬拉硫磷67.0％、對硫磷66.7％。此外，該超級工程菌對敵敵畏急慢性中毒的雞有一定的解毒作用。本發明提供的降解殘留農藥的超級工程菌和解毒酶為利用真核和原核生物的自然資源對殘留在水源、土壤中農藥等有毒有害化合物汙染的生物治理提供了一條新途徑，其可以降解汙染水中的有機磷類農藥殘留、有機磷神經毒劑和一些內分泌幹擾化合物，氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類以及部分有機氯農藥等。


圖1為解毒酯酶的胺基酸序列；圖2為水解酶的胺基酸序列；圖3為重組質粒pETDuet-b1-opd的構建示意圖；圖4為解毒酶在E.Coli BL21(DE3)中表達的SDS-PAGE分析圖；其中，1為蛋白分子量標準；2為純化的OPH；3為純化的B1；4為本發明的超級工程菌；5、7、9為對照；6為含pETDuet-opd的菌株表達的OPH；8為含pETDuet-b1的菌株表達的B1。
具體實施例方式
實施例1、構建本發明的重組質粒pETDuet-b1-opd表達的超級工程菌和解毒酶本發明提供的解毒酶和水解酶基因超級工程菌的克隆如下1.1質粒和受體菌Escherichia coli strain BL-21(DE3)用作表達菌，質粒pETDuet購自Novagen公司用作表達opd基因和b1基因的載體，該質粒在大腸桿菌E.coli.DH5α增殖，所有宿主菌株BL-21(DE3)，E.coli.DH5α由本室保存，攜帶水解酶opd基因的質粒pPNCO33由Wilfred Chen(University of California，Riverside，California.)惠贈，用作opd基因的模板；攜帶解毒酯酶b1基因的質粒pET28a-b1作為b1基因來源，由中國科學院動物所抗性分子遺傳學組提供。
所述的解毒酯酶為具有圖1所述的胺基酸序列的蛋白質；所述的水解酶為具有圖2所述的胺基酸序列的蛋白質。
解毒酯酶b1基因也可從抗雙硫磷致倦庫蚊的蚊蟲中克隆得到，水解酶opd基因也可從細菌中克隆得到。
1.2工具酶及試劑Ex.Taq DNA聚合酶、各種限制性內切酶BamHI，BglII，XhoI and HindIII、T4DNA連接酶均為TaKaRa產品，其餘試劑為分析純。
1.3培養基和培養條件細菌增殖培養所使用培養基為LB培養基，含質粒菌體的培養基中加氨苄青黴素終濃度為50μg/ml，經轉化重組質粒的細菌培養至菌體密度為OD600＝0.6時加入終濃度為1mM IPTG，誘導1小時後加入CoCl2，使其終濃度為1mM，為研究菌體細胞內活性蛋白的形成規律，在不同溫度下繼續誘導培養。
1.4表達載體的構建用PCR方法在水解酶基因opd的前面加上NC的接頭，所述的NC接頭為5』-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3』和5』-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3』；根據Wilfred Chen提供的pPNCO33載體上的opd序列設計引物，以此質粒為模板作PCR擴增opd基因。引物由上海博雅生物工程公司合成，序列為opd-up(5′-ACGGATCCCATGCAAACGAGAAGGG-3′)，opd-down(5′-GTAAGCTTCATG ACGCCCGCAAGG-3′)，上遊引物引入BamHI位點，下遊引物引入HindIII位點，5』端各引入兩個酶切位點保護鹼基。
用PCR方法在解毒酯酶基因b1的前面加上NC的接頭，所述的NC接頭為5』-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3』和5』-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3』；根據本研究室保存的pET28a-b1載體上的b1序列設計引物，以此質粒為模板作PCR擴增b1基因。引物由上海博雅生物工程公司合成，序列為b1-up(5′GCAGATCTCATGAGTTTGGAAAGCTTAACCGTTC-3′)，b1-down(5′CGCTCGAGAAACAGCTCATCAT TCACGTACATTG-3′)，上遊引物引入BglII位點，下遊引物引入XhoI位點，5』端各引入兩個酶切位點保護鹼基。經PCR擴增得到的opd基因和b1基因分別插入雙表達載體pETDuet的多克隆位點，並且保證兩個基因閱讀框正確。opd基因自身具有完整的開放閱讀框，並且與載體上的His-Tag融合表達。b1基因自帶起始密碼子，它的終止密碼子克隆時被缺失，在載體上與S-Tag序列正確通讀，使用載體上自帶的終止密碼子，使表達的B1蛋白攜帶有S-Tag標籤。兩個基因均帶有融合標籤，以利於表達產物的檢測和純化。
構建程序如圖3所示，經過克隆程序，得到融合表達載體pETDuet-b1-opd。
1.5轉化大腸桿菌BL-21(DE3)和誘導表達將構建得到的表達載體pETDuet-b1-opd參照pET System Manual的轉化程序轉化到大腸桿菌BL-21(DE3)，得到重組菌株。從新鮮轉化的平板分別挑取此重組菌株的單克隆菌落，加入含50μg/ml氨苄青黴素的2ml LB培養基37℃震蕩培養8-10小時，然後將2ml培養液注入50ml含氨苄青黴素的培養液繼續培養。當細胞的濃度OD600＝0.6時加入500μl IPTG(濃度為100mM)使IPTG終濃度為1mM，在14～25℃誘導16～22小時，得到本發明的超級工程菌。
由超級工程菌製得解毒酶的方法將經過IPTG(濃度為100mM)在14～25℃誘導16～22小時而得到的上述超級工程菌培養液，在5000xg離心5分鐘收集經誘導的超級工程菌，重新用PBS調節細菌的濃度為OD600＝1,5000xg離心5分鐘重新收集細胞，再次加入1/10體積(OD600＝1)的PBS，使菌液濃縮倍數為10x，細菌菌液中加入溶菌酶使其終濃度為100μg/ml，加入1/10體積的1％Triton X-100，30℃溫浴15分鐘，在冰浴條件下超聲波裂解處理，再離心去除沉澱，其上清液即為本發明的超級工程菌表達的解毒酶(B1-OPH)粗酶液。
以同樣的方法分別構建融合表達載體pETDuet-b1和pETDuet-opd，並轉化到大腸桿菌，，分別得到解毒酯酶基因工程菌(b1)和水解酶基因工程菌(opd)，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，分別表達得到解毒酯酶B1和水解酶OPH。
如圖4所示的各種菌在E.Coli BL21(DE3)中表達的SDS-PAGE分析圖可知超級工程菌誘導表達產生的解毒酶的效率與解毒酯酶基因工程菌(b1)和水解酶基因工程菌(opd)單獨表達的效率是一致的，既超級工程菌有效地達到了解毒酯酶基因工程菌(b1)和水解酶基因工程菌(opd)兩者共有的作用。這樣就可以用一次誘導表達發酵培養的時間同時得到2種解毒酶，從而大大減少了誘導表達發酵培養生產工程菌所需要的各種原材料，縮短時間，節約能源，降低成本。
實施例2、本發明的超級工程菌對馬拉硫磷的降解作用在100ml三角瓶中加入20ml水，1ml 2％TritonX-100，5μl(165μg)馬拉硫磷，將其充分混勻後，加入固定化的超級工程菌基因的細胞小球後，置30℃搖床搖動。每隔一段時間取出1ml處理液置於5ml試管中，加入1ml重蒸正己烷，在混旋器上振蕩3min充分混勻、提取，然後於6500rpm離心15min，取上清液，重複提取一次，將取出的上清液合併後使用氣相色譜儀和氮磷檢測器測定不同時間正己烷提取液中馬拉硫磷的殘留量的含量，以檢測超級工程菌對馬拉硫磷的降解速率，具體測試條件如下使用惠普5890 II型氣相色譜儀，色譜柱30m×0.53mm×0.5μm(膜厚)的BPX-50毛細管柱；柱溫230℃；進樣口溫度250℃；監測器溫度300℃；載氣(N2)30.1ml/min，空氣81.94ml/min，氫氣3.2ml/min；進樣量1μl。其實驗結果列於表1。
以同樣的方法測試轉水解酶基因的工程菌、轉解毒酯酶基因的工程菌以及轉空質粒的菌(作為對照)對馬拉硫磷的降解速率，實驗結果列於表1。
表1、各種菌對馬拉硫磷的降解後的殘留量時間 超級工程菌轉水解酶基因 轉解毒酯酶基 轉空質粒的菌(min) (mg/kg) 的工程菌 因的工程菌 (mg/kg)(mg/kg)(mg/kg)0 9.6898 9.44569.4691 9.4022156.5872 8.35727.3742 8.8906303.2341 7.56234.8896 8.5337451.8923 6.93453.7766 8.0747600.8234 5.46982.8121 7.7071750.3563 4.69881.6859 7.3523900.1268 4.24561.3208 7.0607表2、各種菌對馬拉硫磷的降解效率時間超級工程菌轉水解酶基因的轉解毒酯酶基因的(min) (％)工程菌(％) 工程菌(％)15 31.210.6 21.330 67.019.1 48.345 80.526.6 60.160 91.541.8 70.490 98.854.8 86.1
由表1和表2的數據可見，本發明提供的超級工程菌降解馬拉硫磷的效率比轉水解酶基因的工程菌和轉解毒酯酶基因的工程菌的降解效率都高，在15min時超級工程菌比轉水解酶基因的工程菌和轉解毒酯酶基因的工程菌分別高20.6％和9.9％；在90min時超級工程菌比轉水解酶基因的工程菌和轉解毒酯酶基因的工程菌分別高44％％和12.7％.從而可以得出結論超級工程菌用一次誘導表達發酵培養的時間同時得到2種解毒酶，b1+opd共表達後有一定的增效地作用，在大大減少了誘導表達發酵培養生產工程菌所需要的各種原材料，縮短時間，節約能源，降低成本的同時，其誘導產生的解毒酶的活性均高於轉單基因的工程菌，這樣便可以提高在單位時間內大大降解毒物的速率，在處理水汙染時將可以有效降低運行的成本，減少開支。
實施例3、實驗雞的敵敵畏中毒的解毒實驗成年來航母雞(Gallus gallus)(12月齡，雞重約1.5kg左右)購自北京農業大學實驗雞場，雞購回後單獨餵養，至少適應環境一周後才開始試驗。自由取食和飲水，實驗期間，雞舍溫度控制在20℃左右，每天光照約10h。實驗雞分成4組實驗一組同時給予敵敵畏(裝入空膠囊中，劑量為170mg/kg，口服)和表達解毒酯酶基因工程菌(0.5g溼菌體裝入空膠囊中，口服)；實驗二組，先給予敵敵畏(裝入空膠囊中，劑量為170mg/kg，口服)，40min後給予表達解毒酯酶基因工程菌(0.5g溼菌體裝入空膠囊中，口服)；實驗三組同時給予敵敵畏(裝入空膠囊中，劑量為170mg/kg，口服)和表達解毒酯酶基因和水解酶基因的超級工程菌(0.5g溼菌體裝入空膠囊中，口服)；實驗四組先給予敵敵畏(裝入空膠囊中，劑量為170mg/kg，口服)，40min後給予表達解毒酯酶基因和水解酶基因超級工程菌(0.5g溼菌體裝入空膠囊中，口服)；對照一組只給予敵敵畏(裝入空膠囊中，劑量為170mg/kg，口服)；對照二組同時給予敵敵畏(裝入空膠囊中，劑量為170mg/kg，口服)和轉空質粒的超級工程菌(0.5g溼菌體裝入空膠囊中，口服)。
給藥後密切觀察被試雞的急性中毒情況，在給藥後10天稱重，處死被試雞。
實驗雞按170mg/kg體重給予敵敵畏後，實驗二組、四組和對照組約在40min內出現了急性中毒症狀。實驗一組、三組症狀較輕，沒有明顯急性中毒和遲發性神經毒性症狀，在給轉解毒酯酶基因和水解酶基因超級工程菌3h後逐漸恢復正常；實驗二組、四組出現的急性中毒症狀為衰弱無力，口吐粘液，給予轉解毒酯酶基因和水解酶基因超級工程菌後症狀開始減輕，直至恢復正常，沒有明顯遲發性神經毒性症狀。實驗結束時，實驗組雞的體重沒有明顯下降。
對照一組和對照二組都出現了嚴重的急性中毒症狀和遲發性神經毒性症狀，部分實驗雞死亡，存活的實驗雞出現了不同程度的遲發性神經毒性症狀，體重顯著下降。
其實驗結果表明雞敵敵畏的中毒非常快，如果及時給予轉解毒酯酶基因工程菌或給予轉解毒酯酶基因和水解酶基因超級工程菌解毒的話，實驗用雞則沒有明顯急性中毒和遲發性神經毒性症狀；如果給敵敵畏40分鐘後再給轉解毒酯酶基因工程菌或給轉解毒酯酶和水解酶基因超級工程菌，那麼，雞將會出現一定程度的急性中毒症狀；但是如果繼續給予轉解毒酯酶基因工程菌或給轉解毒酯酶和水解酶基因超級工程菌，中毒的雞還可以恢復正常。並由此得出轉解毒酯酶基因工程菌或給轉解毒酯酶和水解酶基因超級工程菌可以降解雞體內的敵敵畏，從而使雞不中毒結論。
實施例4、用4齡蚊幼蟲測定本發明的解毒酶對對硫磷的降解作用在一次性使用的塑料杯中加50ml水，加入足量的可以殺死4齡蚊幼蟲的對硫磷化合物，在實驗杯子中加入20ul實施例1製得的解毒酶，對照杯子中只加入待測對硫磷化合物，每個實驗設3個重複，30min後分別加入20頭4齡蚊幼蟲，24小時後檢測結果。由於解毒酶可以將對硫磷降解，所以加入解毒酶杯子的蚊幼蟲不能被對硫磷殺死，沒有加解毒酶的杯子的蚊幼蟲冊全部被殺死。
由此實驗結果說明，該解毒酶可以有效降解對硫磷，從而使對硫磷失去對蚊幼蟲的毒殺作用。從試驗得知，用同等劑量的b1或opd基因表達的解毒酶不能夠如此快速高效地降解對硫磷，而轉b1+opd基因的超級工程菌研製的解毒酶可以迅速高效地降解對硫磷，從而使蚊幼蟲不能被對硫磷殺死。
從以上結果可知只有轉b1+opd基因的超級工程菌研製的解毒酶可以快速降解對硫磷，b1+opd共表達後有一定的增效地作用，通過本實驗能讓我們更直觀地了解雙轉基因的效率、效果。
SEQUENCE LISTING110中國科學院動物研究所120一種超級工程菌及其表達的解毒酶和其構建方法及應用130PI041361604170PatentIn version 3.121012111110212DNA213Flavobacterium sp.
220
221CDS222(8)..(1102)223
4001ggatccc atg caa acg aga agg gtt gtg ctc aag tct gcg gcc gcc gca49Met Gln Thr Arg Arg Val Val Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala1 5 10gga act ctg ctc ggc ggc ctg gct ggg tgc gcg agc gtg gct gga tcg97Gly Thr Leu Leu Gly Gly Leu Ala Gly Cys Ala Ser Val Ala Gly Ser15 20 25 30atc ggc aca ggc gat cgg atc aat acc gtg cgc ggt cct atc aca atc 145Ile Gly Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr Ile35 40 45tct gaa gcg ggt ttc aca ctg act cac gag cac atc tac ggc agc tcg 193Ser Glu Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Tyr Gly Ser Ser50 55 60gca gga ttc ttg cgt gct tgg cca gag ttc ttc ggt agc cgc aaa gct 241Ala Gly Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys Ala65 70 75cta gcg gaa aag gct gtg aga gga ttg cgc cgc gcc aga gcg gct ggc 289Leu Ala Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Gly80 85 90gtg cga acg att gtc gat gtg tcg act ttc gat atc ggt cgc gac gtc 337Val Arg Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp Val95 100 105 110agt tta ttg gcc gag gtt tcg cgg gct gcc gac gtt cat atc gtg gcg 385Ser Leu Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val Ala115 120 125gcg acc ggc ttg tgg ttc gac ccg cca ctt tcg atg cga ttg agg agt 433Ala Thr Gly Leu Trp Phe Asp Pro Pro Leu Ser Met Arg Leu Arg Ser130 135 140gta gag gaa ctc aca cag ttc ttc ctg cgt gag att caa tat ggc atc 481Val Glu Glu Leu Thr Gln Phe Phe Leu Arg Glu Ile Gln Tyr Gly Ile145 150 155gaa gac acc gga att agg gcg ggc att atc aag gtc gcg acc aca ggc 529Glu Asp Thr Gly Ile Arg Ala Gly Ile Ile Lys Val Ala Thr Thr Gly160 165 170aag gcg acc ccc ttt cag gag tta gtg tta aag gcg gcc gcc cgg gcc 577Lys Ala Thr Pro Phe Gln Glu Leu Val Leu Lys Ala Ala Ala Arg Ala175 180 185 190agc ttg gcc acc ggt gtt ccg gta acc act cac acg gca gca agt cag 625Ser Leu Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Thr His Thr Ala Ala Ser Gln195 200 205cgc gat ggt gag cag cag gcc gcc att ttt gag tcc gaa ggc ttg agc 673Arg Asp Gly Glu Gln Gln Ala Ala Ile Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ser
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400 2Met Gln Thr Arg Arg Val Val Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala Gly Thr1 5 10 15Leu Leu Gly Gly Leu Ala Gly Cys Ala Ser Val Ala Gly Ser Ile Gly20 25 30Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr Ile Ser Glu35 40 45Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Tyr Gly Ser Ser Ala Gly50 55 60Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys Ala Leu Ala65 70 75 80Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Gly Val Arg85 90 95Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp Val Ser Leu100 105 110Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val Ala Ala Thr
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221 CDS222 (8)..(1633)223
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權利要求
1.一種降解農藥殘留的超級工程菌，該超級工程菌含有編碼解毒酯酶和水解酶的基因，能表達解毒酯酶和水解酶。
2.如權利要求1所述的降解農藥殘留的超級工程菌，其特徵在於，所述的解毒酯酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(i)具有圖1所述的胺基酸序列；或(ii)將圖1所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(i)相同的解毒酯酶功能的衍生的蛋白質。
3.如權利要求1所述的降解農藥殘留的超級工程菌，其特徵在於，所述的水解酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(iii)具有圖2所述的胺基酸序列；或(iv)將圖2所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(iii)相同的水解酶功能的衍生的蛋白質。
4.一種權利要求1所述的超級工程菌的構建方法，包括如下步驟1)按常規方法分別克隆解毒酯酶和水解酶的基因所述的解毒酯酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(i)具有圖1所述的胺基酸序列；或(ii)將圖1所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(i)相同的解毒酯酶功能的衍生的蛋白質；所述的水解酶為具有如下胺基酸序列的蛋白質(iii)具有圖2所述的胺基酸序列；或(iv)將圖2所述的胺基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個胺基酸殘基且具有與(iii)相同的水解酶功能的衍生的蛋白質；2)將步驟1)得到的解毒酯酶和水解酶的基因分別克隆到表達載體pETDuet-1上，構建融合表達載體pETDuet-b1-opd根據pET28a-b1載體上的解毒酯酶基因序列和pPNCO33載體上的水解酶基因序列分別設計引物，並以此質粒為模板作PCR擴增；解毒酯酶基因的引物上遊引物5′-GCAGATCTCATGAGTTTGGAAAGCTTAACCGTTC-3′下遊引物5′-CGCTCGAGAAACAGCTCATCAT TCACGTACATTG-3′水解酶基因的引物上遊引物5′-ACGGATCCCATGCAAACGAGAAGGG-3′下遊引物5′-GTAAGCTTCATG ACGCCCGCAAGG-3′用PCR方法在解毒酯酶基因b1和水解酶基因opd的前面加上NC的接頭，所述的NC接頭分別為5』-GGGAATTCAGGAAACAATGAATATCGACAAAGCGTTGGTA-3』和5』-CCCTGCAGTTCTCGACCTCTATCCAGTC-3』；將帶有NC接頭的水解酶基因opd的上遊引物引入雙表達載體pETDuet的BamHI位點，下遊引物引入雙表達載體pETDuet的HindIII位點，5』端各引入兩個酶切位點保護鹼基；將帶有NC接頭的解毒酶基因b1的上遊引物引入雙表達載體pETDuet的BglII位點，下遊引物引入雙表達載體pETDuet的XhoI位點，5』端各引入兩個酶切位點保護鹼基；經PCR擴增得到的解毒酯酶和水解酶的基因分別插入雙表達載體pETDuet的第一和第二多克隆位點，構建得到融合表達載體pETDuet-b1-opd；3)轉化重組菌株並進行誘導培養將步驟2)構建得到的表達載體pETDuet-b1-opd轉化到大腸桿菌，得到重組菌株；將此重組菌株用異丙基硫代半乳糖苷誘導表達，在14～25℃誘導16～22小時，得到本發明的超級工程菌。
5.如權利要求4所述的超級工程菌的構建方法，其特徵在於，所述步驟1)為分別從抗雙硫磷致倦庫蚊的蚊蟲中克隆得到全長解毒酯酶b1基因，和從細菌中克隆得到全長水解酶opd基因；所述的解毒酯酶b1為具有圖1所述的胺基酸序列的蛋白質；所述的水解酶opd為具有圖2所述的胺基酸序列的蛋白質。
6.一種由權利要求1所述的超級工程菌表達的解毒酶，其為由如下的方法得到的將上述超級工程菌的培養液，在5000xg離心5分鐘，收集經誘導的超級工程菌，重新用PBS調節細菌的濃度為OD600＝1,5000xg離心，5分鐘重新收集細胞，再次加入培養液的1/10的體積的PBS，10倍濃縮菌液，細菌菌液中加入溶菌酶使其終濃度為100μg/ml，加入1/10體積的1％Triton X-100，30℃溫浴15分鐘，在冰浴條件下超聲波裂解處理，再離心去除沉澱，得到的上清液即為本發明的超級工程菌表達的解毒酶。
7.一種權利要求1所述的降解農藥殘留的超級工程菌的用途，該超級工程菌可以同時降解馬拉硫磷、對硫磷、高效氯氰菊酯、三氯殺蟲酯等有機酸酯和有機磷類農藥；可以用於有機磷中毒溫血動物的解毒。
8.一種權利要求6所述的解毒酶的用途，該解毒酶可以同時降解馬拉硫磷、對硫磷、高效氯氰菊酯、三氯殺蟲酯等有機酸酯和有機磷類農藥；可以用於有機磷中毒溫血動物的解毒。
全文摘要
本發明涉及一種可以降解農藥殘留的超級工程菌和其表達的解毒酶。該超級工程菌含有編碼解毒酯酶和水解酶的基因，能誘導表達解毒酯酶和水解酶。其構建方法包括分別克隆解毒酯酶和水解酶的基因；將此基因分別克隆到表達載體pETDuet－1上，構建融合表達載體pETDuet－b1－opd最後轉化得到重組菌株並進行誘導培養。本發明的解毒酶是由上述超級工程菌經誘導表達後而製備的。該超級工程菌和解毒酶可以同時降解馬拉硫磷、對硫磷、高效氯氰菊酯、三氯殺蟲酯等有機酸酯和有機磷類農藥；可以用於有機磷中毒溫血動物的解毒。該超級工程菌和解毒酶為利用真核和原核生物的自然資源對殘留在水源、土壤等中農藥等有毒有害化合物汙染的生物治理提供了一條新途徑，消除農藥殘留汙染。
文檔編號C12N15/70GK1651571SQ20041004271
公開日2005年8月10日 申請日期2004年5月21日 優先權日2004年5月21日
發明者喬傳令, 蘭文生, 黃菁 申請人:中國科學院動物研究所