一種植酸酶及其應用的製作方法

2023-06-09 03:59:21

一種植酸酶及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種新型植酸酶及其應用，其胺基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發明的重組植酸酶作為飼料添加劑，能顯著提高肉雞的日採食、日增重，降低料肉比，增加養殖戶的經濟效益。此外，在日糧中添加本發明的重組植酸酶可使肉雞的磷排洩量比對照組降低13.8%，說明本發明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率，減少含磷廢物的排洩，有利於保護生態環境。
【專利說明】一種植酸酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於功能基因篩選【技術領域】，具體涉及一種植酸酶及其應用。
【背景技術】
[0002]植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶(EC3.1.3.8)，是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。
[0003]植酸酶作為一種優良的飼料添加劑目前被廣泛地應用於畜牧業生產中，它能夠提高動物對磷元素的利用率，以及蛋白質、胺基酸、各種礦物元素的利用率，解除動物植物性飼料中植酸的抗營養作用，提高植物性飼料的營養價值，同時降低動物排洩物對環境的汙染，在動物生產以及在環境保護中，是極為有效的一種添加劑，具有重要的應用價值。另外，農業部、環保部聯合印發的《全國畜禽養殖汙染防治「十二五」規劃》中指出，將重點治理畜禽養殖汙染，這也給植酸酶應用提供了更有利的機遇。
[0004]目前研究的植酸酶主要來源於Saccharomyces cerevisiae (Bajwa etal.,1984;Meyhack et al., 1982) > Aspergillus niger(MacRae, 1998) > A.terreus 和Myceliophthora thermophila(Van Loon, 1995)>A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt etal., 1993;Ehlich et al., 1993;Bin Y et al.，1998)等。不同來源的植酸酶具有不同的酶學性質，但目前的植酸酶普遍存在耐熱性不高，表達量低的問題，制約了植酸酶在飼料領域更為廣泛的應用。

【發明內容】

[0005]本發 明的目的是提供一種新型植酸酶及其應用，本發明從黑葡萄穗黴(Stachybotrys chartarum)中得到一個編碼植酸酶的基因，並將該基因進行克隆,在黑麴黴(Aspergillus niger)中表達，篩選得到高效表達植酸酶的基因工程菌株，從而為高密度發酵和工業化生產奠定基礎。
[0006]本發明一方面提供了一種來源於黑葡萄穗黴的植酸酶，其特徵在於:
[0007]I)其胺基酸序列為SEQ ID NO:1的植酸酶；
[0008]2)在I)中的胺基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個胺基酸得到的，具有I)中植酸酶活性的酶。
[0009]本發明另一方面提供了編碼上述植酸酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ IDN0:2。
[0010]本發明還提供了一種表達載體，其包含上述編碼植酸酶基因的核苷酸序列。
[0011]本發明另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述植酸酶基因的表達載體。
[0012]上述表達宿主細胞為黑麴黴(Aspergillus niger)。
[0013]本發明的植酸酶用於製備飼料添加劑。
[0014]本發明構建的黑麴黴工程菌能高效表達植酸酶，搖瓶發酵結果顯示其酶活為434U/mL。本發明的植酸酶作為飼料添加劑，能顯著提高肉雞的日採食、日增重，降低料肉t匕，增加養殖戶的經濟效益。此外，在日糧中添加本發明的重組植酸酶可使肉雞的磷排洩量比對照組降低13.8%，說明本發明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率，減少含磷廢物的排洩，有利於保護生態環境。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:本發明構建的pGm-Scphy重組表達載體質粒圖譜。
[0016]圖2:黑麴黴WLScphy發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指59kD處為
重組表達的植酸酶。
[0017]圖3:重組表達的植酸酶相對酶活-溫度曲線圖。
[0018]圖4:重組表達的植酸酶相對酶活-pH曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以藉助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求範圍不僅限於所提供的具體案例，而應包括本領域技術人員 在本說明書基礎上，不需經過創造性勞動就能擴展的保護範圍。
[0020]實施例1:植酸酶基因的克隆
[0021]使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗黴過夜培養物中提取基因組DNA。
[0022]以黑葡萄穗黴基因組DNA為擴增模板擴增黑葡萄穗黴中的植酸酶基因，其中所用到的正向引物P-F序列為(下劃線所示序列為AflII酶切位點)；
[0023]5' -AAACTTAAGATCATGGCCTGCGTCGCCTTCCTGCTCG-3'
[0024]反向引物P-R序列為(下劃線所示序列為XbaI酶切位點):
[0025]5' ~TCGTCTAGATCAAGCGGGTGCGCCGTCCGTCACAGTG_3'
[0026]將該基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從黑葡萄穗黴基因組DNA中擴增出來。
[0027]使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產物純化。用限制性內切酶AflII和XbaI (Fermentas)對純化後的PCR產物進行酶切；同時，用限制性內切酶Af III和XbaI對質粒pGm進行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化,並用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產物連接。將連接產物轉化進Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節青黴素進行選擇。為確保準確，對若干克隆進行測序(InvitiOgen)。測序結果顯示，黑葡萄穗黴植酸酶的基因序列為SEQ ID NO: 2，其編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO:1;多個克隆的測序結果都一致。
[0028]通過NCBI中的BLAST進行蛋白質序列比對發現，本發明的植酸酶為一新的等位基因，與現有的植酸酶序列有明顯的區別。
[0029]使用質粒中量製備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質粒。所得I個重組質粒為pGm-Scphy (見圖1),
[0030]實施例2:黑麴黴工程菌株構建及驗證
[0031]吸取黑麴黴Gl孢子懸浮液於CMA平板中心(9cm培養皿)，待菌落長滿整個培養皿，切1/4大小的培養基於200mL CMA液體培養基中，在30°C、200rpm的條件培養14~16h。
[0032]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,並用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉移到40mL原生質體化溶液，在30°C、200rpm的條件下溫浴I~2h，用顯微鏡觀察檢測原生質體轉化進展。
[0033]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質體溶液。將原生質體溶液分裝於兩個50mL無菌的一次性離心管中，並將每管的體積用溶液B定容至45mL,在4000rpm條件下離心8min以獲得沉澱並棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉澱兩次。將沉澱重懸浮於IOmL溶液B中，並用血球計數板對原生質體計數。將原生質體再次離心並棄去上清液，根據血球計數板計數結果，加入適量溶液B重懸沉澱，使得原生質體數目在I X IO7個/mL左右。
[0034]在冰上，將100 μ L上述原生質體溶液加入預冷的無菌15mL離心管中，每個轉化反應用I管，加入10 μ g重組質粒pGm-Scphy,加入12.5 μ L溶液C,溫和混勻後再冰上放置20mino
[0035]將麗SA頂層瓊脂試管熔化並保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，並向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質體混合物。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入ImL上述原生質體混合物，並立即傾倒與MMSA平板上，並將平板在30°C下培養7~IOd至有轉化子長出。
[0036]按照實施例1中的方法提取轉化子基因組DNA，以此為模板，利用實施例1中引物進行PCR擴增目的基因。PCR擴增條件為98°C 30S ；98°C 10S,60°C 30S，72°C 120S，30個循環；72°C IOmin0利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物並進行測序分析，經過PCR反應選育和測序驗證陽性轉化子。將所獲得的陽性工程菌命名為黑麴黴WLScphy (Aspergillusniger WLScphyX
[0037]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0038]溶液B:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0039]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0040]原生質體化溶液:將0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum,Sigma)溶解於40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0041]MMSA 平板:0.59g 乙醯胺(Sigma) ,3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌後加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0042]MMSA 頂層瓊脂試管:0.59g 乙醯胺(Sigma), 3.4g CsCl (Sigma), 0.52g KCl,
1.52g KH2PO4, 218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，IOg低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌後，在培養基未凝固時，加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之後立即分裝於無菌試管中，每管10mL。
[0043]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解後用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0044]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白腖，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0045]CMA液體培養基:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白腖，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0046]實施例3:黑麴黴工程菌的發酵和植酸酶的表達
[0047]挑取實施例2獲得的陽性轉化子黑麴黴WLScphy，接種於30mL TSB發酵培養基中，在30°C，200rpm的條件下培養5d ;所得發酵液用8層紗布過濾，濾液在14000g條件下離心IOmin,收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳。結果如圖2所示，泳道2所示為黑麴黴宿主蛋白表達情況；泳道I所示為本發明黑麴黴WLScphy蛋白表達情況，其中箭頭所指59kDa處有目的蛋白條帶，與預期相符，說明本發明的植酸酶在黑麴黴中得到成功表達。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio)測定顯示其表達量約為1.Sg/L0
[0048]實施例4:植酸酶酶活測定
[0049]1.檢測方法
[0050]取甲、乙兩支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸緩衝液(PH5.0),0.2mL樣品反應液，混勻，37°C預熱5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL終止液，混勻，37°C反應30min，反應結束後甲管中加入4mL終止液，乙管中加入4mL底物溶液，混勻。靜置lOmin，分別在415nm波長處測定吸光值，通過`標準曲線用回歸直線方程計算植酸酶活性。
[0051]酶活X = FXC/(mX 30)
[0052]其中:X——酶活力單位，U/g (mL);
[0053]F—試樣溶液反應前的總稀釋倍數；
[0054]C—根據實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的酶活性，U;
[0055]m-試樣質量或體積，g/mL;
[0056]30——反應時間；
[0057]2.酶活檢測
[0058]按照上述測定方法，取Iml上述發酵上清液進行酶活測定。結果顯示其酶活為434U/mL，說明植酸酶基因在黑麴黴中得到高效表達。
[0059]實施例5:植酸酶酶學性質分析
[0060]在ΡΗ5.0條件下，分別在30°C、40°C、50°C、55°C、6(rC條件下測定上述發酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖3所示，本發明的植酸酶的最適作用溫度為55°C。
[0061]在37°C條件下，分別用 pH為 2.0,2.5,3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5、7.0 的緩衝
液稀釋上述發酵上清液，測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖4所示，本發明的植酸酶的最適作用pH為5.5。
[0062]實施例6:重組植酸酶在飼料中的應用[0063]1、材料
[0064]植酸酶:本發明重組表達的植酸酶，3000U/g。
[0065]試驗動物:山東六和集團種雞場羅斯肉雞。
[0066]2、試驗方法
[0067]試驗選擇健康、體重均勻的AA肉雛雞300隻，共分3個處理組，每個處理組100隻肉雞，每個處理組5個重複，每個重複20隻雞。試驗分O~18d、18~35d兩個飼養階段，分別飼餵處理A (正對照組)、處理B (負對照組)、處理C (添加本發明重組表達的植酸酶)。各處理組日糧配方及營養成分見表1、表2。
[0068]表1;基礎飼糧配方及營養水平
[0069]
【權利要求】
1.一種植酸酶，包含有: 1)胺基酸序列為SEQID NO:1的植酸酶； 2)在I)中的胺基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個胺基酸得到的，且具有I)中植酸酶活性的酶。
2.一種核苷酸，所述的核苷酸編碼權利要求1所述的植酸酶。
3.如權利要求2所述核苷酸，其特徵在於所述核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.一種表達載體，所述的表達載體攜帶有權利要求2所述的核苷酸。
5.—種表達宿主細胞，所述的表達宿主細胞為攜帶有權利要求4所述的表達載體的宿主細胞。
6.如權利要求5所述的表達宿主細胞，其特徵在於所述的宿主細胞為裡氏木黴。
7.權利要求1所述的植酸酶在製備飼料添加劑中的應用。
8.—種飼料添加劑，所述的`飼料添加劑包含有權利要求1所述的植酸酶。
【文檔編號】C12N15/80GK103589700SQ201310567641
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】王華明, 徐娟, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司