與水稻粒形和株高相關的蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-06-09 06:45:26

專利名稱：與水稻粒形和株高相關的蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域中的蛋白質及其編碼基因與應用，特別涉及與水稻 粒形和株高相關的蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
水稻作為一種重要的糧食作物，其產量的重要性不言而喻。籽粒的重量(一般用 千粒重表示)是水稻產量的三大構成因素之一；籽粒形狀和大小直接影響了籽粒的重量， 是水稻產量的決定因素之一。同時，籽粒的形狀和大小還直接決定碾淨去糠大米的外觀和 大小，因而又是稻米品質的決定因素之一。植株高度是水稻株型建成的重要農藝性狀之一， 直接影響水稻品種的抗倒性能和豐產潛力。由此可見，分離和鑑定與水稻粒形和株高相關 的功能基因，對於利用基因工程技術改良水稻性狀，從而提高和穩定水稻產量、提升稻米外 觀品質具有重要的意義。目前在水稻中已清楚鑑定的能同時影響籽粒形狀和株高的基因並不多，研究得 比較深入的有DWARF1、DWARF4和DWARF11等，這些基因通過各種各樣的分子途徑參與調 控籽粒形狀和株高。DWARFl基因編碼GTP結合蛋白α亞基，參與赤黴素信號轉導途徑， 從而在植物生長和發育中起作用，影響水稻植株的株高和籽粒的大小(Ueguchi-Tanaka 等.2000.Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 :11638_11643)。 DWARF4和DWARFl 1編碼細胞色素P450，通過參與油菜素內酯的合成過程，影響水稻植株的 株高和籽粒的形狀大小(Tanabe 等.2005. Plant Cell. 17 776-790 ；Sakamoto 等.2006. Nature Biotechnology. 24 105-109)。TUDl基因編碼含有U_box結構域的蛋白，也是 一個控制水稻株高和籽粒大小的基因，其具體功能和調控途經還不清楚(專利申請號 200810102797. 0)。

發明內容
本發明的一個目的是提供與水稻粒形和株高相關的蛋白及其編碼基因。本發明所提供的與水稻粒形和株高相關的蛋白，名稱為0sKineSin-13A，來源於水 稻(Oryza sativa L.)，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與水稻粒形和株高相關的由(a)衍生的蛋白質。序列表中的序列1由819個胺基酸殘基組成。上述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基 酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述(a)中的0SKineSin-13A蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生 物表達得到。上述(b)中的0sKinesin-13A衍生蛋白可人工合成，也可通過將序列表中序 列2所示的DNA序列中缺失和/或增加一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變得到編碼基因，再進行生物表達得到。與水稻粒形和株高相關蛋白的編碼基因具體可為如下1)_3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2 ；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因。3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。序列表中的序列2由2460個核苷酸組成，其編碼序列為自5』末端第1-2460位鹼 基，編碼具有序列表中序列1的胺基酸序列的0sKinesin-13A蛋白。上述嚴格條件可為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，65°C下進 行DNA或RNA雜交實驗並洗膜。含有上述與水稻粒形和株高相關蛋白的編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉基 因細胞系和重組菌也屬於本發明的保護範圍。所述重組表達載體具體可為在pUN1301載體的多克隆位點間插入上述與水稻粒 形和株高相關蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。本發明的又一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發明所提供的培育轉基因植物的方法，是通過抑制所述編碼基因的表達水平， 得到轉基因植物。所述轉基因植物為下述1)、2)或3)的植物1)與目的植物相比，籽粒變為圓形且植株矮化；2)與目的植物相比，籽粒變為圓形；3)與目的植物相比，植株矮化。所述目的植物為轉基因受體植物。上述抑制所述編碼基因的表達水平具體可通過RNA幹擾實現。所述RNA幹擾是通過將雙鏈RNA的編碼DNA導入目的植物中實現的；其中，所述雙 鏈RNA的一條鏈的核苷酸序列是將序列2的第1587-2195位鹼基序列中的T替換為U得到 的核糖核苷酸序列，另一條鏈與其反向互補。所述雙鏈RNA的編碼DNA的是如下雙鏈DNA片段SEQ正向-X-SEQ頗；其中，SEQ正 向的核苷酸序列是序列2的第1587-2195位鹼基序列；與所述向互補；X是 3￡0_與SEQ_之間的間隔序列，X與所述SEQf^P SEQ均不互補。所述RNA幹擾是將RNA幹擾載體導入目的植物中，得到轉基因植物。所述RNA幹擾載體是通過如下方法構建的將序列表中序列2第1587-2195位鹼基序列所示的DNA片段插入pTCK303質粒的 Spe I和Sac I酶切位點之間得到重組質粒pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列；將序列表 中序列2所示的第1587-2195位鹼基序列反向插入pTCK303-0sKinesin_13A-正向序列質 粒的Kpnl和BamH I酶切位點之間，構成所述幹擾重組表達載體。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發明中與水稻粒形和株高相關的蛋白主要控制水稻粒形和株高，通過RNA幹擾 降低所述蛋白編碼基因的表達水平，可得到籽粒變為圓形、植株矮化的水稻。因此利用該基 因可以培育籽粒為圓形、植株矮化的新型水稻品種，對提高和穩定水稻產量、提升稻米外觀 品質具有重要的意義。


圖1為水稻突變體sar、野生型、0sKinesin_13A基因的過量表達轉基因sar突變 體植株以及RNA幹擾抑制表達轉基因植株在成熟期植株高度的比較。其中A為野生型，B為sar突變體，C為0SKineSin-13A基因過量表達的轉基因sar 突變體植株；D為轉化空載體對照的轉基因sar突變體植株；E為0sKinesin-13A基因RNA 幹擾抑制表達的轉基因野生型植株；F為RNA幹擾對照植株，比例尺為10cm。圖2為水稻突變體sar、野生型、0sKinesin_13A基因的過量表達轉基因sar突變 體植株以及RNA幹擾抑制表達轉基因植株的成熟籽粒的比較。其中A為野生型的成熟籽粒；B為sar突變體的成熟籽粒；C為0SKineSin-13A基 因過量表達的轉基因sar突變體植株的成熟籽粒；D為轉化空載體對照的轉基因sar突變 體植株的成熟籽粒；E為RNA幹擾對照植株的成熟籽粒；F為0sKinesin-13A基因RNA幹擾 抑制表達的轉基因野生型植株的成熟籽粒。圖3為過量表達載體pUN1301-0sKinesin_13A的圖譜。圖 4 為 RNA 幹擾載體 p0sKinesin_13A-RNAi 的圖譜。其中 RNAi-sense 表示 0sKinesin_13A-正向序列片段，RNAi-antisense 表示 0sKinesin-13A-反向序列片段。圖5為0sKineSin-13A基因在水稻中的表達模式分析。其中A為RT-PCR結果；B為實時螢光定量PCR結果。R(Root)為7天齡水稻幼苗 的根；B (Bud)，4mm長的幼芽；L (Leaf)為成熟葉；St (Stem)為拔節後的莖；F (Flower)為成 熟穎花；Sd(Seed)為授粉6天後的籽粒；C(Calli)為愈傷組織。圖6為0sKinesin_13A抗體製備和特異性檢測。其中A為0sKineSin-13A多克隆抗體與野生型水稻及sar突變體的幼苗及幼根總 蛋白進行蛋白免疫印跡雜交的結果；seedling，幼苗；root，根。B為微管蛋白Tubulin單克 隆抗體與野生型水稻及sar突變體的幼苗及幼根總蛋白進行蛋白免疫印跡雜交的結果。圖7為0sKinesin-13A基因RNA幹擾抑制表達轉基因株系中內源0sKinesin_13A 基因表達量的半定量RT-PCR檢測。其中，WT為野生型水稻，Ll至L7為7個獨立的、0sKinesin_13A基因RNA幹擾抑 制表達的轉基因野生型水稻植株株系。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、與水稻粒形和株高相關的0sKineSin-13A基因的獲得本發明首先通過6tlCo γ射線照射野生型水稻品種中花11 (李梅芳、周開達.2001. 水稻生物技術育種.北京中國農業科技出版社.27-29)的種子，種植經過照射的種子，從 其生長得到的植株中篩選獲得到一個植株矮化(圖1)且籽粒長度變短、形狀變圓(圖2中 A和B)的水稻突變體sar。然後利用微衛星標記和圖位克隆技術，將sar突變體的突變位點 定位到水稻第5號染色體短臂的一段210kb的區段上，即兩個微衛星標記RM405和RM7444之間。進而通過序列標記位點將突變位點精細定位到兩個微衛星標記間的18kb區域內。 卞艮m禾(The Rice Genome Annotation Project Database,http://rice, plantbiology. msu. edu)，這一區域內只有一個編碼基因；該基因序列對應於序列表中序列 2所示的核苷酸序列，編碼具有819個胺基酸殘基的蛋白質，對應於序列表中序列1所示的 胺基酸序列。6tlCo Y射線誘變導致的突變位點在該基因序列的第1306位，該位點的鹼基A 發生了缺失，從而造成蛋白序列翻譯從436位胺基酸殘基之後開始移碼，並在464位胺基酸 殘基處提前終止。將該基因命名為0sKinesin-13A。
同時本發明製備了針對0sKineSin-13A蛋白的特異性多克隆抗體，通過Western blot對抗體的特異性進行驗證。具體實施辦法描述如下利用DNAstar軟體對0SKineSin-13A蛋白序列進行綜合分析，最終選取該蛋白序 列第662 676位共15個胺基酸殘基的多肽作為抗原肽段。該段多肽具有良好的柔韌性、 高抗原指數、高表面可及性、高親水性且無明顯二級結構，適合作為抗原。將該肽段序列在 NCBI及TIGR水稻蛋白資料庫中進行比對搜索，沒有搜索到與該序列同源性高的其他蛋白， 說明該肽段是0sKinesin-13A蛋白特異性的。化學合成該肽段後偶聯KLH載體，免疫新西 蘭大白兔，獲得0sKinesin-13A特異性的多克隆抗血清(抗體)。為驗證製備的0sKineSin-13A多克隆抗體的特異性，用所述抗體對野生型水稻中 花11及sar突變體15天齡幼苗和幼根的總蛋白進行了 Western雜交驗證。Western檢測 結果顯示(圖6中A)，製備的0sKinesin-13A多克隆抗體與野生型幼苗及幼根的總蛋白進 行雜交時，可得到約90kDa的單一目標蛋白條帶，而與sar突變體的幼苗及幼根總蛋白進行 雜交時，不能得到任何條帶。由於選取0sKinesin-13A蛋白序列上第662 676位多肽片 段製備多克隆抗體，該抗體只特異性識別這15個胺基酸；野生型水稻的0sKinesin-13A蛋 白完整表達，包含了這一肽段，因而可被製備的抗體結合而顯示出約90kDa的雜交條帶；而 sar突變體表達的變異0sKinesin-13A蛋白是不完整，其翻譯從436位胺基酸殘基之後開始 移碼並在464位胺基酸殘基處提前終止，因而不包含上述的15個胺基酸殘基的多肽，無法 與製備抗體結合，Western檢測將無法顯示出雜交條帶。用Tubulin單克隆抗體同步進行 的雜交顯示(圖6中B)，上述四個總蛋白樣品的Tubulin內標蛋白雜交帶的亮度相似，說明 四個樣品的總蛋白都沒有降解且上樣量相近。以上結果說明本發明製備的0sKinesin-13A 多克隆抗體能特異的與0sKinesin-13A蛋白結合，同時確定該抗體的效價為1 20，000。實施例2、0sKinesin-13A基因的功能互補驗證本發明首先根據獲得的0sKineSin-13A基因的序列信息(序列2)，設計了該核苷 酸序列的引物對，引物 1 :5，-ATAAGGATCCATGGGGGACTCCGGGGAC-3，禾口引物 2 5，-ACCGGAGCTCTTATCTGGAAGATTTCTT-3，，進行RT-PCR擴增合成0sKineSin-13A基因全序列。具體步驟為從野生型水稻中 花11的成熟花序中提取總RNA作為模板，在反轉錄酶的催化下合成第一鏈CDNA ；再以合成 的第一鏈cDNA為模板，上述引物1、引物2為引物對，在高保真的T4DNA聚合酶催化下完成 聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增獲得2. 47kb的0sKinesin-13A基因的全長雙鏈cDNA產物，在 該基因序列兩端各添加BamH I和Sac I酶切位點。合成的0sKineSin-13A基因全長產物經BamH I和SacI雙酶切後，連接到雙元載體 pUN1301(Zhen Wang 等，2004，Plant Molecular Biology R印orter，22 :409_417 ；陳惠、趙原和種康，2008，植物學通報，25 :322-331)的BamH I和Sac I位點之間，得到的連接產物 為0sKinesin-13A基因的過量表達載體pUN1301-0sKinesin_13A (圖3)。連接產物經CaCl2 法轉化到大腸桿菌DH5ci菌株中，塗布到含有卡那黴素(50yg/mL)的LB固體培養基上。 由於雙元載體PUN1301上具有卡那黴素抗性基因(圖3的Kanamycin R)，因此質粒成功轉 化進入的大腸桿菌菌株將表達卡那黴素抗性基因而獲得抗性，從而能在含有卡那黴素的LB 固體培養基上生長。生長出來的大腸桿菌單菌落(克隆)用上述的引物1、引物2進行PCR 驗證，挑選出能擴增得到2. 47kbDNA片段的克隆；PCR驗證的克隆再接種培養，用SDS鹼裂 解法提取菌株中的質粒，提取的質粒用BamHI和SacI雙酶切，能切出約2. 46kb片段的克隆 確定為陽性克隆。經PCR和酶切驗證的大腸桿菌陽性克隆最終還進行了測序驗證，證實菌 株中的質粒確實是pUN1301-0sKinesin-13A過量表達載體，且該載體上0sKinesin_13A基 因全長序列與序列2所示的核苷酸序列完全一致。構建好且測序驗證正確的過量表達載體pUN1301-0SKineSin-13A(圖3)通過凍融 法轉化到農桿菌菌株EHA105中，塗布到含有利福平(25μ g/mL)和卡那黴素(50 μ g/mL)的 LB固體培養基上篩選陽性轉化克隆，生長出來的農桿菌單克隆用上述大腸桿菌PCR鑑定法 進行檢測和驗證，能擴增得到2. 47kb的DNA片段的克隆確定為最終陽性轉化克隆。帶有 pUN1301-0sKinesin-13A過量表達載體的陽性農桿菌EHA105通過遺傳轉化法轉化sar突變 體水稻，獲得獨立的、0sKinesin-13A基因過量表達的轉基因sar突變體植株(TO代)；同時 用帶有pUN1301空載體的農桿菌EHA105菌株轉化sar突變體水稻，獲得轉化空載體對照的 轉基因sar突變體植株(T0代)。分別從轉基因sar突變體TO代植株及轉空載體對照TO代植株上收穫的種子， 然後將種子置於添加了潮黴素(25mg/L)的MS培養基上進行篩選培養，獲得具有潮黴 素抗性的陽性轉化的Tl代小苗，將Tl代小苗移植到大田中生長發育至成熟。對Tl代 0sKinesin-13A過量表達的轉基因sar突變體植株和轉化空載體對照植株進行表型觀察， 結果顯示，所有的0sKinesin-13A過量表達的轉基因sar突變體植株的籽粒和株高均恢復 到野生型表型，結果如圖2中C和圖1中C所示；而所有轉化空載體對照植株的籽粒和株高 與突變體一致，結果如圖2中D和圖1中D所示。這些結果說明在sar突變體中過量表達 0sKinesin-13A基因，能將sar突變體的籽粒形狀和植株高度恢復成野生型的正常表型，證 實在sar突變體中，確實是0sKinesin-13A基因的突變導致了籽粒形狀改變和植株矮化的 表型。上述所用的雙元載體pUN1301由pCAMBIA1301雙元載體改造而成(Zhen Wang等， 2004，Plant Molecular Biology R印orter，22 :409_417 ；陳惠、趙原和種康，2008，植物學 通報，25 322-331)。pCAMBIA1301雙元載體具有菸草花葉病毒35S啟動子驅動的潮黴素磷 酸轉移酶基因(圖3的Hygromycin R)、卡那黴素抗性基因(圖3的Kanamycin R)、限制 性內切酶克隆位點等功能序列；卡那黴素抗性基因在細菌中表達，用於細菌轉化後篩選質 粒成功轉化的陽性克隆；潮黴素磷酸轉移酶基因在植物中表達，用於植物轉化後篩選成功 完成外源基因插入的抗性植株。PUN1301雙元載體是在pCAMBIA1301載體的限制性內切酶 克隆位點內的Hind III和BamH I酶切位點之間插入了玉米泛素蛋白基因Ubi-I啟動子 (圖3的Ubiquitin Promoter) ；Sac I和EcoR I酶切位點之間插入了胭脂氨酸合酶基因的終止信號序列(圖3左下側的Nos)；並且在二者之間引入BamH I, Sma I、Kpn I和Sac I四個酶切位點用於外源基因的插入；這樣外源基因插入植物基因組後，就可以在玉米泛 素蛋白基因啟動子的驅動下表達。玉米泛素蛋白基因啟動子來源於玉米，在單子葉植物各 個器官組織中組成性表達，基因表達水平遠高於菸草花葉病毒35S啟動子，非常適合於外 源基因在單子葉植物中的過量表達(Christensen等，1992，Plant Molecular Biology, 18 675-689)。上述水稻遺傳轉化方法具體實施步驟如下所述 (1)水稻種子成熟胚愈傷組織的誘導和繼代飽滿的水稻成熟種子剝去穎殼；先用70%乙醇表面消毒lmin，再用0. 1 % HgCl2消 毒30min;用無菌水漂洗5次後，接種平鋪到誘導培養基(表1)上；22 28°C的培養箱內， 24小時黑暗條件下培養2 3周後即有愈傷組織誘導形成；誘導出來的愈傷組織可從母體 上切離，轉移到繼代培養基(表1)上培養，2 3周後，愈傷組織長大，挑選淺黃色、質地較 緻密的胚性愈傷組織用於轉化，或者轉移至新的繼代培養基上繼續培養。(2)農桿菌浸染液的製備挑取已PCR鑑定的、帶有目標載體的農桿菌EHA105單菌落接種到含有利福平 (25yg/mL)和卡那黴素(50 μ g/mL)的LB液體培養基中，28°C振蕩培養至飽和期。然後將 培養至飽和期的農桿菌菌液稀釋100倍接種到含卡那黴素和利福平的新鮮LB培養基中， 28°C振蕩培養至對數期。在常溫下6000rpm離心5min沉澱農桿菌，重懸沉澱於等體積的愈 傷轉化AAM培養基(表1)中，在三角瓶中振蕩培養20min得到農桿菌浸染液。(3)浸染及共培養選擇生長狀態良好的、1 3mm的黃白色緻密愈傷組織轉移到預培養基(表1)上 培養，置於22 28°C的培養箱內暗培養3 4天。轉移預培養基上的愈傷組織到乾淨的滅 菌三角瓶中，倒入製備好的農桿菌浸染液，使愈傷組織完全浸泡在浸染液中，50 IOOrpm 搖動培養30min。取出愈傷組織，用無菌的濾紙吸去愈傷組織表面的浸染液。將浸染後的愈 傷組織轉移至共培養培養基(表1)上，19 25°C暗培養三天。(4)選擇培養及繼代選擇培養共培養後的愈傷組織先用無菌水漂洗5次以除去表面吸附的農桿菌；接著用洗菌 液(含35g/L蔗糖，10g/L甘露醇，300mg/L頭孢黴素的無菌水，pH 5.8)浸泡30min ；然後再 用無菌水洗滌3次。愈傷組織用無菌濾紙吸乾表面水份後轉移到Sl篩選培養基(表1)， 放置到28°C的培養箱內暗培養；2 3周後，將愈傷組織直接轉移到S2篩選培養基(表1) 上，扔棄那些完全發黑的愈傷組織；3 4周後，用鑷子從褐色的老愈傷組織塊上夾下新長 出的白色愈傷組織小塊，放置到S3篩選培養基(表1)上培養。(5)轉基因水稻的再生當S3篩選培養基上的抗性愈傷組織長至直徑為5 12mm時轉移到分化培養基 (附表1)上。先暗培養7 10天，再置光下培養1 2周。對於分化出來的較為弱小的 綠苗可在壯苗培養基(表1)上培養一段時間使之生長更為強壯，23°C 28°C，12 14小 時光照培養。當再生的小苗長至2 3cm高時，轉移至生根培養基(表1)。待根系生長良 好，小苗長至8 IOcm時，打開蓋煉苗6 15天。取出組織培養苗轉移到土壤中，放到無 陽光直射的溫室中適應培養，成活後可以移栽到大田種植，獲得轉基因水稻植株。
表1水稻組織培養和轉化主要培養基及成分 表2AA鹽和胺基酸的成分
9 表3MS維生素的組成 實施例3、通過RNA幹擾技術降低0sKineSin-13A基因表達水平，培育籽粒為圓形、 植株矮化的水稻品種RNA幹擾(RNAi)是真核生物體內由雙鏈RNA介導的降解同源RNA的現象。RNAi 技術是將特異性的雙鏈RNA導入生物體內，誘導RNA幹擾機制的啟動，從而達到降低甚至完 全抑制目標基因表達水平的目的。由於RNAi技術操作簡易、基因表達抑制的效果明顯且特 異性高，因此，RNAi技術被廣泛應用於基因功能的理論研究和農作物的基因工程改良。本實施例中，為確保RNA幹擾的特異性，選擇了 0sKineSin-13A基因序列上一段 609bp (第1587-2195位鹼基)的特異性DNA片段用於RNAi載體的構建，該序列與目前水稻基因組資料庫(NCBI和TIGR)中其他序列沒有相似性。根據這段特異性序列設計引物對，引物 3 :5，-GGGGTACCACTAGTTGACAGGGTTAAAAGTCTC-3，禾口引物 4 5 』 -GGGGATCCGAGCTCATTTCCACATCATCACAAG-3 』，進行RT-PCR擴增合成0sKinesin_13A基因的RNAi片段(637bp)，擴增步驟與實施 例2中0sKinesin-13A基因全長cDNA產物的擴增步驟一致。擴增產物先後以正、反兩個方向插入到RNAi雙元載體pTCK303(Wang等，2004， Plant Molecular Biology Reporter, 22 409-417)中，構建 p0sKinesin_13A-RNAi 載體。 具體步驟如下擴增產物首先經Spe I和Sac I雙酶切，連接到RNAi雙元工具載體pTCK303 中，構建「pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列」連接產物。連接產物轉化大腸桿菌DH5 a 菌株，生長出來的大腸桿菌單菌落用上述引物3和引物4進行PCR驗證，挑選出能擴增得到 637bp DNA片段的克隆。PCR驗證的克隆再接種培養，提取質粒，用Spe I和SacI雙酶切驗 證，能切出約615bp片段的克隆確定為「pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列」陽性克隆。接 著，將「pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列」陽性克隆提取的質粒以及擴增合成的637bp的 0sKinesin-13A基因RNAi片段再用Kpn I和BamH I進行雙酶切，酶切後將二者連接構建 "pTCK303-0sKinesin-13A-正向序列-內含子-反向序列」(簡稱p0sKinesin_13A-RNAi)連 接產物。pOsKinesin-UA-RNAi連接產物轉化大腸桿菌DH5a菌株並提取質粒，分別用Spe I單酶切、Sac I單酶切、Hind III和BamH I雙酶切、以及Hind III和Kpn I雙酶切進行酶 切驗證。由於插入的0sKinesin_13A反向片段內部也含有Sac I和Spe I酶切位點，因此Spe I單酶切可切下約500bp的水稻內含子片段，Sac I單酶切可切下0sKinesin-13A-正向序 列_內含子_反向序列片段，共約1. 7kb。HindIII和BamH I雙酶切可切出約2kb的玉米泛素 啟動子片段；Hindlll和Kpn I雙酶切可切出約2. 6kb的泛素啟動子-0sKinesin-13A-反向 序列片段。酶切驗證顯示的酶切圖譜與上述預期完全一致，證實0sKinesin-13A基因RNAi 片段的正向及反向序列均已正確插入到PTCK303質粒中，得到了 p0sKinesin-13A-RNAi陽 性質粒。經PCR和酶切驗證的大腸桿菌陽性克隆最終還進行了測序驗證，證實正、反兩個 0sKinesin-13A-RNAi序列都已經插入到pTCK303載體中，且插入方向和核苷酸序列都正 確。構建好且測序驗證正確的p0SKineSin-13A-RNAi質粒(圖4)通過凍融法轉化到 農桿菌菌株 EHA105 (Hood 等，1993，Transgenic Research, 2 208-218)中，塗布到含有利福 平(25 u g/mL)和卡那黴素(50 u g/mL)的LB固體培養基上篩選陽性轉化克隆，生長出來的 農桿菌單克隆用以下兩個引物對分別進行PCR驗證。在PTCK303載體Kpn I酶切位點內側 的內含子上，用引物 5 :5，-ATGCTCTAACCTTGAGTACCTATC-3，禾口引物 4 5 』 -GGGGATCCGAGCTCATTTCCACATCATCACAAG-3 』進行PCR可擴增得到約650bp的0sKinesin-13A-反向序列片段；在pTCK303載體 Spe I酶切位點內側的內含子上，用引物 3 :5，-GGGGTACCACTAGTTGACAGGGTTAAAAGTCTC-3，禾口引物 6 5，-TTCTCTTGAATCTGGTTGGCAA-3，進行PCR可擴增得到約600bp的0sKineSin-13A-正向序列片段。能同時擴增得 到正向和反向序列的克隆確定為最終陽性轉化克隆。
經PCR鑑定驗證為陽性的轉化克隆用實施例2所述的水稻遺傳轉化法轉化野生 型水稻愈傷組織，經潮黴素篩選及分化後獲得7個獨立的、0sKinesin-13A基因RNA幹擾抑 制表達的轉基因野生型植株株系(TO代)。同時用帶有PTCK303空載體的農桿菌EHA105 菌株轉化野生型水稻，獲得RNA幹擾對照植株(TO代)。為了確定轉基因株系中內源 0sKinesin-13A基因的表達是否受到抑制，我們通過半定量RT-PCR的方法對轉基因株系和 野生型水稻中0sKinesin-13A的表達量進行了檢測。分別提取7個獨立的TO代轉基因株 系和野生型水稻成熟葉片的總RNA，用引物1和2進行RT-PCR擴增。結果顯示，所有7個株 系中內源0sKinesin-13A表達量與野生型相比均出現了顯著降低(圖7)，說明RNA幹擾機 制在轉基因株系中發揮作用，抑制了 0sKinesin-13A基因的表達。分別從RNA幹擾抑制表達轉基因TO代植株及RNA幹擾對照TO代植株上收穫種 子，然後將種子置於添加了潮黴素(25mg/L)的MS培養基上進行篩選培養，獲得具有潮 黴素抗性的陽性轉化Tl代小苗，將Tl代小苗移植到大田中生長發育至成熟。對Tl代 的0sKinesin-13A-RNAi轉基因植株和RNA幹擾對照植株進行表型觀察，結果顯示，所有 0sKinesin-13A-RNAi轉基因植株的籽粒長度變短、呈現為圓形(圖2中F)，植株高度變矮 (圖1中E)，而所有RNA幹擾對照植株的植株籽粒和株高與野生型表型一致(圖1中F)。 這些結果說明通過本實施例所述的方法，可以降低水稻0sKinesin-13A基因的表達水平， 達到改變水稻籽粒形狀和植株高度的目的，培育籽粒長度變短、植株矮化的水稻品種。本實施例中所用的RNAi雙元工具載體PTCK303是在過量表達雙元工具載體 PUN1301的基礎上構建的，S卩，在pUN1301載體的KpnI和Sac I酶切位點之間插入了 "KpnI-Xho I-Sal I-Bgl II-NheI_478bp 的水稻內含子-Cla I-Spe I-Xba I-Sac I「DNA 片段(Wang 等，2004，Plant Molecular Biology R印orter，22 :409_417 ；專利申請號 03160092. 1)。因此，RNAi工具載體pTCK303包含了玉米泛素蛋白啟動子和水稻的內含子， 內含子兩側具有豐富的酶切位點，只需將目標基因的正反兩個序列分別插入水稻內含子兩 側就可以完成RNAi載體的構建；轉化水稻後，插入基因組的「正向序列-內含子-反向序 列」片段將被轉錄成外源RNA ；這種具迴文序列的RNA會形成帶髮夾結構的雙鏈RNA，然後 雙鏈RNA被降解成21 23nt的小RNA片段，驅動RNA幹擾機制的運行，導致目標基因轉錄 和轉譯產物水平的降低或消失。實施例4 :0sKinesin-13A基因在水稻中的表達模式分析本發明利用RT-PCR和實時螢光定量RT-PCR方法對0sKinesin_13A基因在水稻中 的表達模式進行了分析。RT-PCR分析的具體實施步驟為用Trizol試劑提取野生型水稻不同組織的總 RNA,包括7天齡水稻幼苗的根、4mm長的幼芽、成熟葉(葉片和葉鞘的混合物)、拔節後的 莖、授粉前的成熟穎花、授粉後發育6天的籽粒及成熟胚誘導的愈傷組織；以總RNA為模板， 反轉錄獲得第一鏈cDNA ；再以第一鏈cDNA為模板，用0sKinesin-13A基因特異性的引物 對引物 7 5，-TCTACTACTCAGTATGGTGGCTCCC-3，禾口引物 8 5，-TTCTCTTGAATCTGGTTGGCAA-3，進行PCR擴增。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，在檢測的不同組織 中，0sKinesin-13A基因均有較高水平的表達，且表達量的差異並不明顯(圖5中A)。
同時，應用實時螢光定量RT-PCR技術對0sKineSin-13A基因在水稻各個組織中 的相對表達量進行定量分析，具體實施步驟為以上述來源於不同組織的第一鏈cDNA為模 板，用0sKinesin-13A基因特異性的引物對引物 9 5，-TGGTCAAACAGGTAGTGGC-3，禾口引物 10 5，-GGTAGACAGGCTGATGCAA-3，進行了實時螢光定量PCR擴增；擴增結果按2_AACT方法進行了相對定量分析。結 果顯示0sKinesin-13A基因在檢測的7種組織中表達量非常接近，其中籽粒中表達量最低， 幼芽中表達量最高並約為籽粒中表達量的2. 5倍，其餘組織中的表達量約為籽粒中表達量 的1 2倍(圖5中B)。0sKinesin-13A基因這種組成性的、廣泛的表達模式說明該基因 在水稻的各個生長發育過程中都可能具有一定的功能，是控制水稻株高和粒形的重要基因 之一。
權利要求
一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻粒形和株高相關的由(a)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述蛋白的編碼基因為如下1)_3) 中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系和重組菌。
5.一種培育轉基因植物的方法，是通過抑制權利要求2或3所述編碼基因的表達水平， 得到轉基因植物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述轉基因植物為下述1)、2)或3)的植物1)與目的植物相比，籽粒變為圓形且植株矮化；2)與目的植物相比，籽粒變為圓形；3)與目的植物相比，植株矮化。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述抑制權利要求2或3所述的編 碼基因的表達水平是通過RNA幹擾實現的。
8.根據權利要求7所述方法，其特徵在於所述RNA幹擾是通過將雙鏈RNA的編碼 DNA導入目的植物中實現的；其中，所述雙鏈RNA的一條鏈的核苷酸序列是將序列2的第 1587-2195位鹼基序列中的T替換為U得到的核糖核苷酸序列，另一條鏈與其反向互補。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述雙鏈RNA的編碼DNA的是如下雙鏈 DNA片段SEQ正向-X-SEQ反向；其中，的核苷酸序列是序列2的第1587-2195位鹼基序列；與所述向互補； X是3￡0_與SEQ_之間的間隔序列，X與所述均不互補。
10.根據權利要求5或6或7所述的方法，其特徵在於所述目的植物為雙子葉植物或 單子葉植物；所述單子葉植物為水稻。全文摘要
本發明公開了與水稻粒形和株高相關的蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻粒形和株高相關的由1)衍生的蛋白質。本發明中與水稻粒形和株高相關的蛋白主要控制水稻粒形和株高，通過RNA幹擾降低所述蛋白編碼基因的表達水平，可得到籽粒變為圓形、植株矮化的水稻。因此利用該基因可以培育籽粒為圓形、植株矮化的新型水稻品種，對提高和穩定水稻產量、提升稻米外觀品質具有重要的意義。
文檔編號C12N1/19GK101870727SQ20101022742
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者嚴長傑, 李唐, 王臺, 鄧祝雲 申請人:中國科學院植物研究所