一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子及其構建方法

2023-06-09 07:06:21

專利名稱：：一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子及其構建方法
技術領域：
：本發明屬於生物工程
技術領域：
，涉及一種轉基因生物及其產品檢子及構建方法，具體是一種適用於轉基因大豆M0N89788定性和定量PCR檢子及其構建方法。
背景技術：
：自1996年以來，全球轉基因作物種植面積以年均10%以上的速率增長，2008年達到1.25億公頃。與轉基因作物產業化的蓬勃發展相對應的，是各國民眾對其安全性的擔憂。為保障消費者知情權和選擇權，許多國家和地區都制訂了轉基因生物標識管理制度，我國自2001年相繼頒布了一系列法律法規，對大豆、玉米等5類轉基因作物的17種產品實施強制性定性標識。標識制度的實施依賴於轉基因產品檢測技術。目前主要有兩類技術一類基於核酸方法，如PCR、基因晶片等，另一類基於蛋白質方法，如ELISA、試紙條等，其中PCR方法應用最廣。根據靶序列不同，PCR檢測策略分為4種，即篩查、基因特異性、構建特異性、轉化體特異性。轉化體特異性PCR方法以外源載體與受體植物基因組的連接區序列為檢測對象，具有品種特異性，已成為轉基因產品檢測方法的首選。在應用PCR方法檢測轉基因產品時，需要設置陽性對照來對檢測活動進行監控，特別是在定量PCR檢測中需要用含量準確的轉基因生物陽性標準品來製作標準曲線。然而，由於專利權和現有技術的限制，轉基因生物陽性標準品很難獲得，這種現狀已成為檢測方法建立和應用的瓶頸。因此亟需研製能夠替代轉基因生物陽性標準品的新型陽性對照材料，以滿足不斷發展的轉基因檢測需求。經過查閱文獻資料發現，質粒標準分子的概念及應用最早由日本學者Shindo等提出，相關內容發表在《JournalofAOACInternational》(國際官方農業化學家協會雜誌)2002年第85巻第5期1119-1126頁，文中介紹了利用質粒標準分子替代轉基因生物陽性標準品用於轉基因作物及其產品檢測的方法。近年來，國內外眾多學者報導了一些用於轉基因產品檢測的質粒標準分子，例如張大兵等人於2007年構建了適用於9種轉基因玉米檢測的質粒標準分子。然而，在對現有專利和文獻的分析中發現，還沒有任何轉基因大豆M0N89788檢測用質粒標準分子構建的專利和文獻報導。
發明內容本發明的目的是提供一種轉基因大豆M0N89788轉化體特異性檢測用質粒標準分子及其構建方法，以克服轉基因大豆M0N89788轉化體特異性定性和定量PCR檢測中陽性標準品的匱乏，滿足轉基因大豆M0N89788轉化體特異性檢測需求。為實現上述目的，本發明提供一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子，其特徵在於通過特異性PCR引物，從轉基因大豆M0N89788基因組DNA中擴增出大豆內標準基因lectin特異性序列、M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列和5'端轉化體特異性序列，利用酶切、連接、轉化分子克隆技術將這3個片段依次構建到質粒載體pMD18-T中，獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。—種轉基因大豆檢測用質粒標準分子的構建方法，包括以下步驟(1)利用GenBank資料庫和相關文獻檢索，獲得大豆內標準基因lectin、轉基因大豆M0畫883'端和5'端轉化體特異性序列。所述的大豆內標準基因lectin,是指大豆凝集素基因，在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數等特點。所述的轉基因大豆M0N897883'端轉化特異性序列，是指轉基因大豆M0N89788外源載體3'端與大豆基因組連接區的DNA序列。所述的轉基因大豆M0N897885'端轉化特異性序列，是指轉基因大豆M0N89788外源載體5'端與大豆基因組連接區的DNA序列。(2)根據lectin基因序列、M0N89788大豆的3'端和5'端轉化體特異性序列，設計定性PCR引物，對轉基因大豆M0N89788陽性標準品的基因組DNA進行PCR擴增。所述的定性PCR引物，是指長度為25士8nt的寡核苷酸鏈，與lectin基因或M0N89788大豆的3'端或5'端轉化體特異性序列完全相同或者互補。所述的轉基因大豆M0N89788陽性標準品，是指轉基因含量為100%的轉基因大豆M0N89788籽粒。(3)分別回收lectin基因以及M0N89788大豆3'端和5'端轉化體特異性序列的定性PCR產物。將lectin基因PCR回收產物構建到質粒載體pMD18-T上獲得中間質粒分子pMD-L。所述的中間質粒分子，是指在構建質粒標準分子pMD-LM3M5過程中，產生的一系列質粒分子。(4)將中間質粒載體pMD-L和M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列PCR回收產物，用限制性內切酶BamHI和EcoRI分別進行雙酶切。回收這2種酶切產物，用T4DNA連接酶連接獲得中間質粒分子pMD-LM3。所述的雙酶切，是指在一個反應體系中加入兩種限制性內切酶和一種通用緩衝液，對同一個目標分子進行酶切。(5)將中間質粒分子pMD-LM3和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列PCR回收產物，用限制性內切酶NcoI和EcoRI分別進行雙酶切。回收這2種酶切產物，用T4DNA連接酶連接獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。大豆內標準基因lectin特異性序列，是由SEQIDN01和SEQIDN02組成的引物對，擴增M0N89788大豆獲得的擴增子序列。M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列，是由SEQIDN03和SEQIDN04組成的引物對，擴增M0N89788大豆獲得的擴增子序列。M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列，是由SEQIDN05和SEQIDN06組成的引物對，擴增M0N89788大豆獲得的擴增子序列。本發明質粒標準分子，包含SEQIDN07的序列。所述的定性PCR驗證，是指用定性PCR方法驗證構建的質粒標準分子pMD-LM3M5中能擴增出與轉基因大豆M0N89788相同的大豆內標準基因lectin以及M0N89788大豆3'端和5'端轉化體特異性序列，且pMD-LM3M5中特異性序列的檢測靈敏度能滿足定性PCR檢測的要求。所述的定量PCR驗證，是指用定量PCR方法分析構建的質粒標準分子pMD-LM3M5中大豆內標準基因lectin和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列的檢測極限、定量極限以及重複性、重演性等特性，以鑑定該質粒標準分子替代轉基因大豆M0N89788陽性標準品的能力，進而驗證該質粒標準分子在轉基因大豆M0N89788樣品實際檢測中的有效性。本發明的有益效果利用酶切、連接、轉化等分子克隆技術首次構建了含有大豆內標準基因lectin以及轉基因大豆M0N89788的3'端和5'端轉化體特異性序列的質粒標準分子pMD-LM3M5。本發明中提出該質粒標準分子可以完全替代轉基因大豆M0N89788陽性標準品，用於M0N89788大豆轉化體特異性定性和定量PCR檢測，很好地解決了M0N89788大豆檢測過程中陽性標準品匱乏的問題。該質粒標準分子在實際檢測中具有特異性好、靈敏度高等優點，應用該質粒標準分子進行實際樣品定量分析時，樣品檢測結果的偏差在國際上廣泛認可的允許範圍內。因此，本發明構建的質粒標準分子pMD-LM3M5完全適用於對轉基因大豆M0N89788及其產品中M0N89788大豆轉化體成分的定性和定量PCR檢測。附圖為本發明構建質粒標準分子pMD-LM3M5的示意圖。圖中，"pMD-18T"表示用於構建質粒標準分子的載體；"BamHI"、"NcoI"、"EcoRI"分別表示存在相應的酶切位點；"lectin"表示大豆內標準基因lectin特異性序列；"M0N89788-3'"表示M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列；"M0N89788-5'"表示M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件操作，例如Sambrook等編著的分子克隆實驗室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例質粒標準分子pMD-LM3M5的構建—、實驗材料轉基因大豆M0N89788。二、試劑限制性內切酶BamHI、EcoRI、Nco1購自上海生工生物工程技術服務有限公司；pMD18-T載體、T4DNA連接酶及緩衝液、ExTaqDNA聚合酶及其緩衝液、dNTPs、DL2000Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產物回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DH5a感受態菌株購自北京天根生物技術有限公司；CTAB、Tris、EDTA等其他生化試劑購自北京鼎國生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。三、主要儀器設備C1000型PCR儀(Bio-RadLaboratories,Inc.)Gel型凝膠成像系統(Bio-RadLaboratories,Inc.)ND1000紫外分光光度計(NanoDropTechnologies,Inc.)其他儀器包括恆溫水浴鍋，離心機，恆溫培養箱，電子天平，微量移液器等。四、實驗方法和過程1、引物設計通過GenBank查詢獲得大豆內標準基因lectin;通過檢索相關文獻資料和國內外，獲得轉基因大豆M0N89788的3'端和5'端轉化體特異性序列。根據獲得的序列信息，利用PrimerPremier5軟體，設計三對定性PCR引物，分別用於擴增lectin基因、M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列和5'端轉化體特異性序列。lectin基因特異性序列擴增引物由SEQIDN01和SEQIDN02組成，M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列擴增引物由SEQIDN03和SEQIDN04組成，M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列擴增引物由SEQIDN05和SEQIDN06組成。2、特異性序列擴增2.1總DNA提取a、取適量植物樣品，在液氮中充分研磨，稱取80-150mg研磨好的樣品(不需研磨的可直接稱取)轉入1.5mL離心管中；b、加入0.6mLCTAB提取液(15gL—1CTAB，50mmo1L—工Tris-HCl(pH8.0)，10,1L—1EDTA(pH8.0)，lmolL—1NaCl，7.5gL—1PVP)和50iigRNaseA，65。C孵育40min，期間顛倒混勻3-5次；c、加入0.6mL氯仿，顛倒混勻1-2min，12OOOrpm離心10min，轉移上清至新的1.5mL離心管中，重複本步驟1次；d、加入0.6倍體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫靜置10min，12OOOrpm離心10min，棄上清；e、加入lmL70%乙醇洗滌沉澱，12OOOrpm離心5min，棄上清；f、晾乾，加入100iiL超純水溶解DNA沉澱。用ND1000分光光度計檢測DNA質量和濃度，將DNA稀釋至50mgL—、備用。2.2PCR擴增根據表1列出的引物，以M0N89788大豆基因組DNA為模板，進行特異性序列擴增，反應體系和程序見表1、2。獲得424bp的lectin基因特異性序列，312bp的M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列以及420bp的M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列。表1構建質粒標準分子的PCR反應體系反應試劑體積(nL)終濃度10xPCRBufferlx(50mmol丄-1KC1,10mmol'I/1Tris-HCl，pH8.3'1.5mmol.L"MgCl2)dNTPs4每種dNTP為200urnolU1上遊引物1200nmol-L"下遊引物1200nmolL4ExTaqDNA聚合酶0.251.25UDNA模板2100ng超純水補足至50nL表2構建質粒標準分子的PCR反應程序循環數溫度(°C)時間1945mill9430s355830s7240s17210min3、質粒標準分子構建3.1中間質粒分子pMD-L構建按PCR產物回收試劑盒說明書，回收lectin基因以及M0N89788大豆3'端和5'端轉化體特異性序列的PCR產物。按照pMD18-T載體試劑盒說明書，將lectin基因特異性序列構建到載體上獲得中間質粒分子pMD-L，並轉化DH5a感受態菌株。利用菌落PCR對重組菌株進行鑑定，按照質粒提取試劑盒說明書提取中間質粒pMD-L。3.2中間質粒分子pMD-LM3構建將中間質粒載體pMD-L和M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列回收產物，用限制性內切酶BamHI和EcoRI分別進行雙酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠回收後，用T4DNA連接酶連接獲得中間質粒分子pMD-LM3。反應體系見表3，16t:孵育12h。將連接產物轉化DH5a感受態菌株。利用菌落PCR對重組菌株進行鑑定，按照質粒提取試劑盒說明書提取中間質粒pMD-LM3。表3構建中間質粒分子pMD-LM3的連接反應體系_反應試劑體積(iiL)_10X連接酶緩衝液1T4連接酶1pMD-L質粒2M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列3超純水3_3.3質粒標準分子pMD-LM3M5構建將中間質粒載體pMD-LM3和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列回收產物，用限制性內切酶NcoI和EcoRI分別進行雙酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠回收後，用T4DNA連接酶連接獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。反應體系見表4，16。C孵育12h。將連接產物轉化DH5a感受態菌株。利用菌落PCR對重組菌株進行鑑定，按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒標準分子pMD-LM3M5。通過測序分析確定質粒標準分子中的外源序列與預期一致。表4構建質粒標準分子pMD-LM3M5的連接反應體系_反應試劑體積(iiL)_10X連接酶緩衝液1T4連接酶1pMD-LM3質粒2M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列3超純水3_構建的質粒標準分子pMD-LM3M5的簡要圖譜如附圖所示。圖中"pMD-18T"表示用於構建質粒標準分子的載體；"BamHI"、"NcoI"、"EcoRI"表示存在相應的酶切位點；"lectin"表示大豆內標準基因lectin特異性序列；"M0N89788-3'"表示M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列;"M0畫88-5'"表示M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列。3段序列通過2次雙酶切和3次連接轉化依次構建到pMD-18T載體上，獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。質粒標準分子經測序分析，包含SEQIDN07的序列。實驗例質粒標準分子pMD-LM3M5在實際檢測中的應用—、實驗材料轉基因大豆M0N89788。非轉基因大豆吉育84。其他轉基因材料大豆GTS40-3-2、A5547-127，玉米M0N810、M0N863、NK603、GA21，棉花M0N1445、M0N15985、M0N88913，油菜MS1、RF1、0xy235，甜菜H7-l。二、試劑2XMixTaqMan定量PCR試劑盒購自吉林省標新科技發展有限公司。TaqDNA聚合酶及其緩衝液、dNTPs、DL2000Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒購自北京天根生物技術有限公司；CTAB、Tris、EDTA等其他生化試劑購自北京鼎國生物技術有限公司；T叫Man探針和引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。三、主要儀器設備7500型實時螢光定量PCR儀(AppliedBiosystems.)C1000型PCR儀(Bio-RadLaboratories,Inc.)Gel型凝膠成像系統(Bio-RadLaboratories,Inc.)ND1000紫外分光光度計(NanoDropTechnologies,Inc.)其他儀器包括恆溫水浴鍋，離心機，恆溫培養箱，電子天平，微量移液器等。四、實驗方法和過程1、DNA提取1.1植物基因組DNA提取a、取適量植物樣品，在液氮中充分研磨，稱取80-150mg研磨好的樣品(不需研磨的可直接稱取)轉入1.5mL離心管中；b、加入0.6mLCTAB提取液(15gL—1CTAB，50mmo1L—工Tris-HCl(pH8.0)，10,1L—1EDTA(pH8.0)，lmolL—1NaCl，7.5gL—1PVP)和50iigRNaseA，65。C孵育40min，期間顛倒混勻3-5次；c、加入0.6mL氯仿，顛倒混勻1-2min，12000rpm離心10min，轉移上清至新的1.5mL離心管中，重複本步驟1次；d、加入0.6倍體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫靜置10min，12OOOrpm離心10min，棄上清；e、加入lmL70%乙醇洗滌沉澱，12000rpm離心5min，棄上清；f、晾乾，加入100iiL超純水溶解DNA沉澱。1.2質粒標準分子pMD-LM3M5DNA提取a、將37。C培養12h的1-5mL菌液於10000rpm離心30s，徹底棄上清;b、按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA。1.3DNA濃度測定與稀釋a、取3iiLDNA樣品，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷DNA完整性；b、用ND1000分光光度計檢測DNA純度和濃度；c、用超純水將植物基因組DNA稀釋至50mgL—、4"C保存備用；d、根據質粒標準分子DNA初始濃度和大小，用0.1XTE緩衝液將其依次稀釋成106、105、104、103、102、10禾卩lcopyyL—、4。C保存備用。2、質粒標準分子pMD-LM3M5在定性PCR檢測中的應用通過檢索相關文獻資料，獲得大豆內標準基因lectin、M0N89788大豆3'端和5'端轉化體特異性定性PCR檢測方法。PCR反應體系和程序見表6、7。以質粒標準分子pMD-LM3M5(106copyiiL—0、轉基因大豆M0N89788、非轉基因大豆吉育84和其他轉基因材料的DNA為模板進行定性PCR檢測，判斷質粒標準分子用於定性PCR檢測的特異性。以不同濃度的質粒標準分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、104、103、102、10禾口lcopy*PL—1)為模板進行定性PCR擴增，判斷質粒標準分子用於定性PCR檢測的靈敏度。表6pMD-LM3M5用於定性PCR檢測的反應體系反應試劑體積(nL)終濃度10xPCRBuffer2.5lx(50mmol.L"KCl，10mmol-I/1Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol'L-1MgCl2)dNTPs2每種dNTP為200nmol-I/1上遊引物0.5200歸ol.L-1下遊引物0.5200nmol-L—1TaqDNA聚合酶0.1250.625UDNA模板1超純水補足至25表7pMD-LM3M5用於定性PCR檢測的反應程序循環數溫度(°C)時間1945min9430s355830s7230s17210min3質粒標準分子pMD-LM3M5在定量PCR檢測中的應用3.1pMD-LM3M5用於定量PCR檢測的檢測極限和定量極限通過檢索相關文獻資料，獲得大豆內標準基因lectin和M0N89788大豆5'端轉化體特異性定量PCR檢測方法。PCR反應體系和程序見表8、9。以不同濃度的質粒標準分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、10J、103、102、10禾口lcopy*iiL—0為模板進行定量PCR擴增，每個反應重複三次，根據定量PCR擴增標準曲線與擴增螢光信號間的線性關係，確定利用構建的質粒標準分子PMD-LM3M5替代轉基因大豆M0N89788陽性標準品時，M0N89788大豆轉化體特異性定量PCR檢測方法的檢測極限(LOD)和定量極限(LOQ)。表8pMD-LM3M5用於定量PCR檢測的反應體系反應試劑體積(HL)終濃度2xMix10lx上遊引物0.5250nmol'L"下遊引物0.5250nmol-L"TaqMan探針0.4200,1-L"DNA模板1超純水補足至25nL表9pMD-LM3M5用於定量PCR檢測的反應程序tableseeoriginaldocumentpage113.2應用pMD-LM3M5對轉基因大豆M0N89788樣品的定量分析根據利用質粒標準分子pMD-LM3M5建立的M0N89788大豆特異性定量PCR標準曲線，分別對3個轉基因大豆M0N89788樣品(轉基因質量分數分別為2%、1%和0.5%)進行分析，確定構建的質粒標準分子pMD-LM3M5是否適用於實際樣品中轉基因大豆M0N89788的定量檢測。五、實驗結果1、質粒標準分子pMD-LM3M5在定性PCR檢測中的特異性和靈敏度利用相關文獻資料的方法，對質粒標準分子pMD-LM3M5(106COpyyL—0、轉基因大豆M0N89788、非轉基因大豆吉育84和其他轉基因材料進行定性PCR檢測。結果顯示，在pMD-LM3M5和M0N89788大豆中均能擴增出lectin基因、M0N89788大豆3'端禾P5'端轉化體特異性序列，在非轉基因大豆吉育84和其他轉基因大豆中僅能擴增出lectin基因特異性序列，其他轉基因材料中沒有擴增出任何產物，表明質粒標準分子pMD-LM3M5與轉基因大豆M0N89788陽性標準品具有等效的特異性。以不同濃度的質粒標準分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、104、103、102、10禾口lcopyiiL-0為模板進行PCR擴增，結果顯示，在pMD-LM3M5濃度為10copyyL-1及以上的樣品中均能穩定地擴增出lectin基因、M0N89788大豆3'端和5'端轉化體特異性序列，表明質粒標準分子pMD-LM3M5的定性PCR檢測靈敏度可達10copy。說明本發明構建的質粒標準分子pMD-LM3M5可替代轉基因大豆M0N89788陽性標準品，用於M0N89788大豆定性PCR檢測。2、質粒標準分子pMD-LM3M5在定量PCR檢測中的檢測極限和定量極限利用相關文獻資料的方法，對不同濃度的質粒標準分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、104、103、102、10禾3lcopyyL—0進行定量PCR擴增。結果顯示，質粒標準分子pMD-LM3M5的lectin基因和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列的定量PCR檢測LOD均為1個拷貝，LOQ為10個拷貝，且具有很好的重複性和重演性。以濃度為106、105、104、103、102和10copyiiL-1的質粒標準分子pMD-LM3M5為標準品建立lectin基因和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列定量PCR標準曲線，兩個標準曲線的相關係數均大於0.99，斜率在-3.1-3.6之間，具有很好的線性關係，說明本發明構建的質粒標準分子pMD-LM3M5可替代轉基因大豆M0N89788陽性標準品，用於M0N89788大豆及其產品的定量PCR檢測。3、應用質粒標準分子pMD-LM3M5對轉基因大豆M0N89788樣品的定量分析根據利用質粒標準分子pMD-LM3M5建立的lectin基因和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列定量PCR標準曲線，對質量分數分別為1%、0.5%和0.1%的3個轉基因大豆M0N89788樣品進行定量分析，定量分析結果顯示3個樣品的含量分別為1.22%、0.55%和0.12%，與真實值的偏差分別為22%、10%和20%，標準偏差在0.020.20之間。結果表明利用質粒標準分子pMD-LM3M5對實際樣品分析的結果比較準確，檢測結果的偏差在國際上廣泛認可的0-25%範圍內，表明本發明構建的質粒標準分子pMD-LM3M5可替代轉基因大豆M0N89788陽性標準品，完全適用於轉基因大豆MON89788轉化體特異性定量PCR分析和檢測。權利要求一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子，其特徵在於通過特異性PCR引物，從轉基因大豆MON89788基因組DNA中擴增出大豆內標準基因lectin特異性序列、MON89788大豆3′端轉化體特異性序列和5′端轉化體特異性序列，利用酶切、連接、轉化分子克隆技術將這3個片段依次構建到質粒載體pMD18-T中，獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。2.權利要求1所述的一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子的構建方法，其特徵在於包括如下步驟(1)利用GenBank資料庫和文獻檢索，獲得大豆內標準基因lectin、轉基因大豆M0N897883'端和5'端轉化體特異性序列；(2)根據lectin基因序列、MON89788大豆的3'端和5'端轉化體特異性序列，設計特異性定性PCR引物，對轉基因大豆MON89788陽性標準品的基因組DNA進行PCR擴增；(3)分別回收lectin基因以及MON89788大豆3'端和5'端轉化體特異性序列的定性PCR產物，將lectin基因PCR回收產物構建到質粒載體pMD18-T上獲得中間質粒分子pMD-L;(4)將中間質粒分子pMD-L和M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列PCR回收產物，用限制性內切酶BamHI和EcoRI分別進行雙酶切，回收這2種酶切產物，用T4DNA連接酶連接獲得中間質粒分子pMD-LM3;(5)將中間質粒分子pMD-LM3和M0N89788大豆5'端轉化體特異性序列PCR回收產物，用限制性內切酶Ncol和EcoRI分別進行雙酶切，回收這2種酶切產物，用T4DNA連接酶連接獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。3.權利要求l所述的大豆內標準基因lectin特異性序列，是由SEQIDN01和SEQIDN02組成的引物對，擴增M0N89788大豆獲得的擴增子序列。4.權利要求1所述的M0N89788大豆3'端轉化體特異性序列，是由SEQIDN03和SEQIDN04組成的引物對，擴增MON89788大豆獲得的擴增子序列。5.權利要求l所述的MON89788大豆5'端轉化體特異性序列，是由SEQIDN05和SEQIDN06組成的引物對，擴增M0N89788大豆獲得的擴增子序列。全文摘要一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子及其構建方法，所述質粒標準分子包含大豆內標準基因lectin特異性序列、轉基因大豆MON89788的3′端轉化體特異性序列和5′端轉化體特異性序列。通過設計特異性定性PCR引物，擴增獲得lectin基因特異性序列、MON89788大豆的3′端和5′端轉化體特異性序列；通過酶切、連接、轉化等分子克隆技術將上述3個特異性序列片段構建到一個質粒分子中獲得人工重組質粒標準分子pMD-LM3M5。經驗證，本發明中構建的質粒標準分子可以完全替代轉基因大豆MON89788陽性標準品，適用於對MON89788大豆的轉化體特異性定性和定量PCR分析和檢測。文檔編號C12N15/66GK101775440SQ201010106138公開日2010年7月14日申請日期2010年2月5日優先權日2010年2月5日發明者劉娜,夏蔚,宋新元,康嶺生,張明,李蔥蔥,李飛武,董立明,趙寧,邢珍娟,邵改革申請人:吉林省農業科學院