作為給藥系統的抗體交聯的陽性乳液的製作方法

2023-06-09 07:03:51

專利名稱：：作為給藥系統的抗體交聯的陽性乳液的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種給藥系統和一種生產該藥物靶向系統的方法。本發明還涉及一種有用的在哺乳動物體內確定靶向和將藥物、診斷劑以及其它生理上有效的物質運送到靶點的方法。
背景技術：
：癌症是世界上的主要致死因素，並且是美國的第二大致死因素。在諸多癌症疾病中，乳腺癌是除黑色素瘤皮膚癌外在婦女中最常見的癌症。胰腺癌是美國癌症致死中的第四大主要原因，且據估計結腸直腸癌在2003年造成57000人死亡。傳統的癌症療法是攻擊性的，引發顯著的副作用並且甚至會損害與待治療的惡化器官鄰近的健康組織。對增加抗癌劑特異性達到靶向腫瘤的需求導致產生了大量新型的治療策略。最近，隨著單克隆抗體(MAb)被批准用於治療性用途特別是癌症[1]，新的且令人興奮的生物技術時代出現了。過去20年中已經觀察到，癌症的發展通常伴有一種或幾種被稱為腫瘤抗原的蛋白的過度表達[2]。已經開發了一種靶向對抗p185HER2(HER2)受體酪氨酸激酶，曲妥單抗的代表性MAb。HER-2在乳腺癌，肺癌，卵巢癌以及其它癌症的發病機理中起重要作用[3]，並且在所述腫瘤中過度表達。HER-2過度表達顯然與乳腺癌的不良預後(prognosis)有關[4，5]。因此，使用單克隆抗體治療癌症已經作為靶向癌細胞的方法，同時不傷害正常細胞。市售MAbs中，美羅華和曲妥單抗(分別為Rituxan和Herceptin)在治療癌症中展示出充滿希望和令人鼓舞的結果，並且持續顯著擴展[6]。有時，以單一藥物形式使用MAb不足以產生令人滿意的治療性應答。此外，在用腫瘤細胞系進行的臨床前研究中，發現曲妥單抗與某些化療藥物具有輔助和協同作用[2，7]。對曲妥單抗與各種化療試劑特別是紫杉醇聯合使用的臨床試驗研究已經在肺癌中進行了[8]。研究者利用MAbs對腫瘤組織的高度親和性，並且通過將MAb偶聯至毒素或通過輻射破壞抗原攜帶細胞的放射性同位素(放射免疫療法)設計了創新的且有效的治療性策略[9]。最近，大量臨床研究報導，雖然存在與惡性細胞中H-鐵蛋白過度表達的矛盾數據[11]，但對患有復發性何杰金氏病(HD)的患者治療性使用釔標記的多克隆抗鐵蛋白得到了滿意效果[10]。由此，為了得到更有效的腫瘤藥物靶向，將單克隆抗體與能包埋有效親水性和/或親脂性藥物的膠態載體偶聯，所述膠態載體為脂質體(免疫脂質體)、納米顆粒和乳液(免疫乳液)。這些免疫交聯物應該確保抗體對抗原位點的特異性識別，以及確保膠體給藥系統釋放不同的細胞毒素試劑，所述膠體給藥系統靠近難以接近的病理靶組織，所述病理靶組織可能位於過度表達所述腫瘤抗原的乳腺或結腸或胰腺中。實際上，正如近來報導，免疫脂質體代表一種新穎的和充滿希望的增強腫瘤靶向給藥的策略[12-19]。此外，已經表明，帶有聚乙二醇偶聯的Fab′片段的免疫脂質體在體內顯示出延長的循環時間和高度外滲進入目標實體瘤[15]。然而，上述敏感性脂質體製劑眾所周知的物理化學不穩定性形成一種障礙，如果意欲最終銷售有活性的產品則需克服所述障礙。此外，大部分所述脂質體載體不能結合顯著劑量的親脂性/疏水性活性成分例如紫杉醇(這是治療各種癌症實體瘤最有希望的細胞毒類藥物之一)，所述的不能結合限制了他們潛在的臨床效果，而乳液可以結合顯著量的疏水性藥物特別是紫杉醇[20]，則顯示了其強於脂質體的優點。Lundbergetal.[21]偶聯了用聚乙二醇穩定的磷脂醯乙醇胺改性的帶負電長循環亞微粒乳液和抗B細胞淋巴瘤MAbLL2。它們顯示，結合物(conjugate)可能是一種有用的藥物載體系統，用於更特異性地向B細胞惡性腫瘤釋放抗腫瘤藥物。目前還沒有體內數據，所述研究仍然處於初級階段。本發明人開發和研究的陽離子亞微粒乳液在生理性陽離子的存在下是穩定的，並且可以在體內與帶負電的生物膜相互作用，同時避免被RES吸收[22]。此外，細胞培養研究已經顯示，陽離子乳液增強治療劑的細胞內滲透[23，24]。對於基於免疫學的抗癌療法來說，HER-2蛋白代表一種有吸引力的的靶向，這是由於它在非惡性組織中的限制性表達及其對轉化細胞惡性表型的影響。以HER-2/nue為靶向的與化療結合的曲妥單抗有利於患有過度表達HER-2的轉移性乳腺癌的患者的存活，提高可類似地表達HER-2的其它類型惡性腫瘤利於治療的可能性。此外，已經證明曲妥單抗在其它癌症中作為單一藥物無效。AMB8LK抗體對H-鐵蛋白顯示高度親和性。鐵蛋白是一種由大多數人類細胞表達的蛋白質，且其用於細胞內鐵貯存。該分子的結構數據顯示，它是由被稱為去鐵鐵蛋白的含有一個金屬鐵原子核的糖蛋白外殼組成的大分子。去鐵鐵蛋白的分子量為440kD。具有兩種類型的亞基，被稱為H和L，以可變的比例組合。根據亞基類型，鐵蛋白分為酸性的或者鹼性的。雖然大家熟知鹼性鐵蛋白的作用，但僅僅近來才逐漸闡明酸性鐵蛋白的確切作用。對鐵蛋白和癌症關係的早期觀點所源自的研究表明，患有各種惡性腫瘤患者的血清中總鐵蛋白增加並向酸性(富含H)鐵蛋白轉移[26]。隨後對腫瘤組織本身中鐵蛋白濃度的評價顯示了一個複雜的，也許是疾病特異性的景象例如已經報導，某些情況下例如在結腸癌[27]、睪丸精原細胞瘤[28]以及乳腺癌[29-30]中，與可比較的正常組織相對，腫瘤組織中鐵蛋白增加。Vriensendorp和Quadri近來報導[10]，在何杰金氏病中，循環鐵蛋白量為500ng/ml。隨機研究指出，靜脈注射2.5mg兔抗人鐵蛋白IgG會在循環中主要形成一對一免疫複合物[31]。該抗原抗體複合物不幹擾腫瘤靶向或引起免疫複合物疾病。此外，Vriesendorp和Coll.[32]在臨床研究中證明，在復發性HD患者中，放射性同位素標記的抗鐵蛋白靶向腫瘤間質並且通過放療而不是通過免疫作用來縮小腫瘤。在HD患者的尿中，小於5％的經注射的放射性同位素標記的抗鐵蛋白被消除。此外，血液放射性的40小時有效第二半衰期和α∶β比例低於2.5表明，經放射性同位素標記的兔抗鐵蛋白在體內是穩定的[33，34]。最後，抗鐵蛋白還靶向在正常睪丸和血液中發現的鐵蛋白，但是已經觀察到HD患者中，血池放射性與血液毒性呈良好的相關性，所述血液毒性通常在10-16周後自發消失。HD患者中未發現急性副反應[10，31]。應該強調的是，用於早期臨床研究的抗體是多克隆兔抗人鐵蛋白。AMB8LK，公開於WO01/52889中的由MonoclonalAntibodiesTherapeutics(MAT)Ltd.Evry，France製備的單克隆抗體識別所有異鐵蛋白(酸性的和鹼性的)的共同表位。AMB8LK已經被證明對特定器官具有顯著的親和性，並且與同位素偶聯之後，其可以用於何杰金氏病以及其它腫瘤如胰腺癌和肺(NSCLC)癌的診斷和治療。最後，OrphanDrugStatus已經於近日被ECOrphanMedicinalProductsCommittee批准可將抗鐵蛋白多克隆抗體偶聯至釔90，以治療頑固性何杰金氏病(MAT，ltd.，EvryFrance)。所述識別提供令人信服的證據，及抗鐵蛋白可以被HD患者的腫瘤優先吸收。需要通過特異性配體來選擇性地靶向負載有抗癌藥物的乳液以對抗表達在惡性細胞上的抗原，從而增強所述免疫乳液製品的療效以及降低與化療相關的不良副作用。
發明內容因此，本發明的一個目的是提供組合物和靶向藥物的方法。本發明涉及一種包括陽性水包油乳液和一種抗體的組合產品，其中所述乳液含有在其自然狀態和在油水界面具有游離NH2基團的化合物，其中所述化合物通過異雙功能交聯劑連接至所述抗體上，將所述NH2基團連接至抗體絞鏈區上的SH基團上。本發明更具體地涉及一種組合產品，其中所述產品具有正ζ電荷。本發明還涉及一種組合產品，其中所述具有NH2自由基團的化合物是選自下列的至少一種陽離子脂質C10-C24烷基胺、C10-C24烷醇胺或膽甾醇酯。本發明還涉及一種組合產品，其中所述具有NH2自由基團的化合物是硬脂醯胺或油胺。此外，本發明涉及一種組合產品，其中所述乳液包括具有由界面膜包圍的油性中心的膠體微粒，其中所述界面膜包括在其自然狀態具有自由NH2的化合物、非離子表面活性劑和一種陰離子表面活化劑或陰離子脂質，其中所述膠體微粒具有正ζ電位(potential)。所述乳液公開於國際申請WO03/053405中。更特別地，本發明公開了一種組合產品，其中所述乳液含有一種藥理學活性物質。本發明還涉及一種組合產品，其中所述抗體選自多克隆抗體或單克隆抗體。所述單克隆抗體可以自然形式、合成形式、嵌合形式或人源化形式使用。更特別地，在根據本發明的組合產品中，所述抗體靶向存在病理細胞表面上的抗原。更具體地說，在根據本發明的組合產品中，所述抗體靶向的蛋白選自HER-2、H-鐵蛋白、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或粘蛋白(以高度糖基化為特徵的高分子量糖蛋白。MUC1是迄今為止九個克隆的粘蛋白中表徵最好的。MUC1在前列腺癌和轉移性前列腺癌中過度表達)，CD44(在所有七個AML(急性粒細胞性白血病)亞型的白血病細胞上表達的細胞表面抗原)和視黃醛S-抗原(通過雜交瘤製備的單克隆抗體，所述雜交瘤由視黃醛S-抗原(S-Ag)產生)，對所有受試種(人類，牛，豚鼠和大鼠)的視黃醛Muller細胞顯示出強特異性結合，[35]。更具體地說，所述抗體是AMB8LK抗體，更具體地說，是經胃蛋白酶消化後得到的片段形式F(ab)2。本發明還涉及一種組合產品，其中所述異雙功能交聯劑選自N-1硬脂醯-馬來醯亞胺(SM)、油烯基馬來醯亞胺(oleylmaleimide)、琥珀醯亞胺反式-4-(馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀醯亞胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)。此外，本發明涉及一種製備之前公開的組合產品的方法，所述方法包括下列步驟a)任選地還原一種抗體以在其絞鏈區得到自由SH基團，b)混合一種陽性乳液和具有自由SH基團的抗體以得到所述組合產品，其中所述陽性乳液含有一種在其自然狀態含有自由NH2基團的化合物，其中所述化合物通過所述NH2基團連接至異雙功能交聯劑上。根據已知技術手段實現步驟a)，例如由Hermanson公開的技術[36]。更特別地，本發明公開了一種方法，其中步驟b)所述陽性乳液通過如下獲得i.將交聯劑連接至天然存在於化合物上的自由NH2基團以得到經修飾的化合物，所述化合物用於獲得陽性乳液，ii.混合所述在其自然狀態具有自由NH2基團的經修飾的化合物和另一種得到乳液所必需的產品，以得到陽性乳液。本發明還涉及一種方法，其中步驟b)所述陽性乳液通過如下獲得i.混合在其自然狀態具有自由NH2基團的化合物和另一種為得到乳液所必需的產品，以得到陽性乳液，ii.將交聯劑連接至天然存在於所述化合物上的自由NH2基團上，以得到在所述陽性乳液內的經修飾的化合物。絞鏈區的反應性巰基用於和帶有馬來醯亞胺基團例如SMCC的巰基反應性交聯試劑的結合方案。合成新型交聯試劑的原理是通過混合化學結構與母體陽離子脂質非常類似的新型交聯劑，即在乳液製備過程中分別為硬脂醯胺或油胺的交聯劑來促進免疫乳液的形成並增加反應結合物的產量。通過選擇性結合4種不同表面活性劑(分別為磷脂，泊洛沙姆，硬脂醯胺和烷基馬來醯亞胺或油胺和油烯基馬來醯亞胺)，在O/W界面製備混合的乳化界面膜。此外，由於在抗體偶聯之前不必再將交聯劑與預先形成的乳液反應，而是直接將還原的抗體結合至包括已經位於O/W界面的包含交聯劑的乳液，可以省略結合反應中的一個重要步驟。然後期望不發生交聯反應(在油滴和交聯劑或抗體分子之間)，同時由於還原的抗體在乳液的O/W界面直接面對反應性部分，因此交聯反應的特異性和產量明顯增加。根據本發明，術語藥理學活性物質包括治療劑和診斷劑，其可以用於熱血動物，特別是哺乳動物包括人類，獸類或家畜。根據本發明，藥物靶向系統可能包括一種藥理學活性物質或多種藥理學活性物質乃至更多種藥理學活性物質，只要它們在同一藥物靶向系統中相容。在本發明藥物靶向系統的一個優選實施方案中，藥學上有效物質是親脂性藥物，選自吉西他濱、米託蒽醌、絲裂黴素、長春新鹼、表柔比星、氨甲喋呤、鬼臼亞乙苷、亞德利亞黴素、嘌呤或核苷、博來黴素、絲裂黴素、BCNU、紫杉酚、多西紫杉醇或其它紫杉烷衍生物，更具體地說是紫杉醇油酸鹽或棕櫚酸鹽、喜樹鹼、N4-醯基-1-β-D-阿拉伯糖胞嘧啶(arabinofuranosylcystosines)、地塞米松、棕櫚酸鹽、氟羥脫氫皮醇(上述兩種用於眼部應用)、環孢素、他克莫司或西羅莫司(具有確定的P-gp抑制作用的免疫抑制劑，其能降低多藥耐藥性)。所有上述藥物應該溶於油滴中心中。在一個更加優選的實施方案中，上述藥理學活性物質是活性細胞毒素物質，所述活性細胞毒素物質在與抗體結合之前結合入所述乳液中，例如非水溶性藥物如紫杉醇、紫杉醇油酸鹽或吉西他濱鹼單獨或與環孢素A或他克莫司結合。將含有紫杉醇或吉西他濱的陽離子(cationic)乳液與抗體例如曲妥單抗或AMB8LK偶聯的優點是多重的，所述抗體例如曲妥單抗或AMB8LK可以特異性識別分別過度表達HER-2或H-鐵蛋白的乳腺癌，結腸癌和胰腺癌症腫瘤，或MUC1抗體或者能識別轉移性前列腺癌的PMSAMAb，上述優點包括通過轉移抗體特異性至乳液界面的免疫靶向；延長生物體中的停留時間；在通過抗體確認的腫瘤位點釋放大細胞毒劑量，以及抗體從乳液界面生物降解之後細胞毒類藥物在腫瘤中較好地內化，以及回收負載藥物的帶正電荷的乳液，該乳液經證明可增強各種組織中的藥物滲透。根據本發明的組合物一方面確保抗體能特異性識別抗原位點或受體；另一方面通過靠近目標病理組織的膠體給藥系統釋放不同親脂性細胞毒試劑。所述藥物釋放是由免疫乳液和腫瘤細胞的相互作用引發的。治療劑被預期選擇性地轉移至細胞表面，並且隨後通過原生質膜的結構性內吞或胞飲內陷而內化，最終將細胞毒試劑傳遞至其作用位點，所述位點對於大多數抗癌藥是在細胞內的。上述給藥途徑可以是全身性途徑(非腸道、靜脈注射、腹膜內、脊柱內、腫瘤內)，眼部或局部途徑。根據本發明的有效給藥系統顯著地降低與不良耐受的非選擇性分布和潛在的細胞毒試劑相關的副作用。將含有選擇性細胞毒類藥物的帶正電荷乳液和抗體偶聯在腫瘤學中的優越性是多重，其包括-通過轉移抗體特異性至乳液界面進行免疫靶向，-延長在生物體中的保留時間，-在抗體識別的腫瘤位點釋放大細胞毒劑量，-減少乳液的正電荷及肺向性，-在抗體從乳液界面生物降解之後，細胞毒類藥物在腫瘤中較好地內化，以及回收經證明能增強各種組織中藥物滲透的負載藥物的帶正電荷乳液。通過下列實施例和附圖進一步舉例說明本發明。附圖1表示結合至油滴乳液的抗體的百分比，以初始比值為45曲妥單抗分子/油滴作為增加陽離子乳液中交聯劑SM的濃度的函數。附圖2是帶正電荷亞微粒乳液與單克隆抗體通過SMCC技術偶聯的原理圖。附圖3是帶正電荷亞微粒乳液與單克隆抗體通過SPDP技術偶聯的原理圖。附圖4表示Capan-1細胞對不同乳液製品的吸收。上述免疫乳液的密度為100Ab/微滴。實施例1原料和方法1.1.製備陽離子乳液陽離子空白乳液由水相和油相組成，水相包括蒸餾水，泊洛沙姆188(Poloxamer188)(非離子表面活性劑)，甘油(滲透劑)，油相含有MCT(中鏈甘油三酯)，硬脂醯胺(陽離子脂質)，α-生育酚(抗氧化劑)和類脂E-80(磷脂混合物)。所述類脂E-80，維生素E和硬脂醯胺直接溶於油相，而泊洛沙姆和甘油直接溶於水相。兩相分別加熱至70℃。將水相緩慢混入油相併用磁性攪拌器混合。所得混合物進一步加熱至85℃。使用高剪切Polytron混合器(Kinematica，Luzern，Switzerland)將得到的粗製乳液乳化5分鐘以上，然後迅速冷卻至20℃以下。在冰浴中冷卻後，乳液使用兩級均化閥裝置(Gaulinhomogenizer，APVGaulin，Hilversum，TheNetherlands)以9000psi均化5分鐘。進一步快速冷卻至低於20℃之後，使用0.1N鹽酸調節pH值至7.0。然後通過孔徑0.45μm的TE膜濾器(SchleicherSchuell，Dassel，Germany)過濾所得乳液。最後，在氮氣環境中用矽化玻璃瓶包裝乳液並使用高壓滅菌器在121℃滅菌15分鐘。典型的配方是由下述組成的(w/w％)MCT(5)，泊洛沙姆188(1)，甘油(2.25)，類脂E80(1)，硬脂醯胺(0.25)，α-生育酚(0.01)和水(直至100)。對於免疫乳液製品，添加0.02％合成的交聯劑，得到4000交聯劑/微滴。對於流細胞計數法、螢光和共焦顯微學分析，使用以相對於乳液MCT含量的以1∶200的摩爾比溶於四氫呋喃(THF)的香豆素6製備螢光標記的乳液(香豆素最終濃度490μM或0.17mg/ml)。2小時適度加熱後，香豆素平衡並滲透入乳液中，同時通過蒸發除去THF。使用SephadexG-25柱除去未負載標記。1.2.乳液特徵1.2.1.粒徑分析使用ALV非擴散性背散射高性能顆粒填料器(ALV-NIBSHPPS，Langen，Germany)在25℃測定液滴尺寸，並使用水(折射率1.332；粘度0.894543)作為溶劑。使用波長為632nm的雷射束。靈敏度範圍是0.5nm～5μm。1.2.2.測量ζ電位使用Malvernzetasizer(Malvern，UK)測定在10mMNaCl(150mV)中稀釋的乳液的ζ電位。1.3.製備陰離子乳液使用與Levy和Coll.[37]所描述相同的方法，用油酸代替硬脂醯胺製備陰離子乳液。確切的配方是MCT6.6％，油酸2.3％，類脂E801％，維生素E0.01％，甘油2.25％，普盧蘭尼克F-681％和DDW100％。2.製備抗體片段根據已知的赫爾曼森(Hermanson)[36]方法還原曲妥單抗和AMB8LKF(ab)2片段。在37℃，通過2-半胱胺(MEA，最終濃度0.05M)還原純化的曲妥單抗和AMB8LKF(ab)2抗體(4mg/ml)90min，以製備用於與乳液結合的巰基基團。一旦被2-半胱胺還原，免疫球蛋白就裂成兩部分，形成兩個MW75000-80000的重鏈-輕鏈分子，並且每個含有一個抗原結合位點(應該強調，該方法不引起蛋白質變性)。類似地，F(ab′)2片段可以被還原產生兩個Fab′片段，每個含有一個抗原結合位點。在SephadexG-25柱上洗脫溶液，以1ml餾分收集Fab′片段級分。使用280nm處的UV測定含有Fab′的級分，並合併收集液。4℃氮氣環境中保存Fab′片段(50kD)直至偶聯至乳液。通過SDS-PAGE確定Fab′片段的產生，並且通過夾心ELISA證實其抗原特異性。3.偶聯反應使用1NHCl將根據1新鮮製備的乳液的pH值調至6.5，並且在4℃連續攪動和氮氣環境下與AMB8LKFab′片段(最終濃度0.1-0.5mg/ml)培養過夜。通過與2-巰基乙醇(2mM)培養30分鐘來封閉未反應的馬來醯亞胺基團。通過SepharoseCL-4B柱凝膠過濾，將未結合的抗體和2-巰基乙醇從免疫乳液中分離出來。通過共焦顯微鏡和射電顯微術(TEM)，分別使用FITC或黃金標記的羊抗-小鼠/人IgG，對最終的免疫乳液進行形態學評價。通過ELISA測定與乳液結合的Fab′片段總數。對於使用不同量的結合抗體製備免疫乳液來說，Fab′對馬來醯亞胺-活化的乳液的初始比例是不同的。4.藥物摻入在與抗體結合之前，將經選擇的親脂性或疏水性細胞毒藥物例如環孢素A首先溶於乳液的油相中，以製備有效治療腫瘤細胞的負載藥物的免疫乳液，而這些腫瘤細胞通過常規化療難於接近。5.乳液-抗體結合物的穩定性研究體外通過促進試驗例如升溫、攪拌以及使用長期儲存評價來研究經偶聯的乳液的穩定性。檢驗下列性質液滴尺寸分布，ζ電位，pH值和使用HPLC測定的藥物含量[36]。6.體外藥物釋放動力學評價使用超濾技術在低壓下對從陽離子乳液中的體外藥物釋放分布特徵的測定如下所述將0.4ml含藥乳液(含有1mg環孢素A)直接置於含有100ml釋放介質(維持下沉條件)的Amicon8200攪拌容器中(Amicon，Danvers，MA，U.S.A)。在給定時間間隔下，在低壓條件下(小於7.25psi)使用氮氣，通過YM-100超濾膜過濾釋放介質。使用HPLC測定1ml等分澄清濾液的紫杉醇含量[38]。必須考慮膜吸附和排斥，以準確地測量藥物中的水量，從而在使用超濾技術之前進行證實。7.細胞培養研究免疫染色以用於測定H-鐵蛋白和HER-2過度表達。在不同癌細胞系(用於胰腺癌的CAPAN-1，用於結腸癌的Caco-2和用於乳腺癌的SK-BR-3)和非癌細胞例如成纖維細胞和平滑肌細胞中測定H-鐵蛋白的過度表達。細胞融合之後用胰酶消化並轉移(每孔105細胞)入覆蓋有18mm蓋玻片的16孔板中。細胞在37℃，5％CO2條件下，在蓋玻片上粘附24小時。棄去培養基並且使用新鮮的4％多聚甲醛固定10分鐘。用PBS洗滌細胞並且用50mMNH4Cl及隨後用5％BSA阻斷自身螢光。洗滌細胞並且在4℃用AMB8LK1∶50稀釋物培養過夜。洗滌細胞並且在室溫下用FITC1∶50稀釋物結合山羊抗小鼠IgG1小時。用PBS洗滌第二抗體5次，隨後封片，接著使用螢光顯微鏡或共焦顯微鏡觀察細胞。使用相同過程測定HER-2，使用曲妥單抗和FITC結合的山羊抗人IgG作為第二抗體。8.AMB8LK-免疫乳液的體外結合分析將用香豆素6標記的AMB8LK-免疫乳液和對照乳液(沒有結合AMB8LK的陽離子乳液和陰離子乳液)添加至1×106CAPAN-1細胞中，並在4℃培養30分鐘。用1ml免疫螢光(IF)緩衝液(PBS中1％(w/v)BSA，pH值7.4)洗滌細胞。此後，將已經與用螢光標記的乳液培養過的細胞再次懸浮於500ulIF-緩衝液中，並通過流細胞計數法分析。9.免疫乳液的細胞吸收的共焦雷射掃描顯微學(CLSM)分析CAPAN-1細胞在蓋玻片上生長至亞融合。將細胞與香豆素6標記的乳液(陽離子乳液和AMB8LK免疫乳液)在補充血清的生長培養基中在37℃條件下培養0分鐘，30分鐘和1小時，用PBS充分洗滌，在甘油中封片並用共焦顯微鏡觀察。10.測定細胞對AMB8LK-免疫乳液和藥物的吸收CAPAN-1在24孔板上生長至亞融合。細胞與香豆素6標記的乳液(陽離子乳液，陰離子乳液和AMB8LK免疫乳液)，在PBS中37℃條件下培養1小時，並用PBS充分洗滌。使用BMGLabtechnologies的FluoStar-Galaxy測定平板的螢光，激發波長485nm且發射波長520nm。每個平板讀數4次並計算平均值。沒有經洗滌並與相同樣品培養的孔作為總螢光的參照。實施例1B結果1.1.AMB8LKFah′產生通過SDS-PAGE確定AMB8LKFab′片段的產生，證實F(ab)2通過半胱胺(MEA)的適度還原裂解為Fab′片段。使用鐵蛋白作為包被抗原的夾心ELISA證實了AMB8LKFab′的抗原特異性。以半胱氨酸作為標準，通過監控343nm處吸光度的改變，用Aldrithiol測定自由巰基基團。經該步驟後，抗體暴露3個自由巰基基團。1.2.AMB8LK-免疫乳液特徵使用O/W界面的不同抗體密度(從10多至100抗體分子/油滴)以檢驗其對乳液最終液滴尺寸和ζ電位的影響。有人指出，抗體密度對液滴尺寸和ζ電位沒有影響，分別是110-130nm和+35mV。通過ELISA測定的偶聯效率也未受表面抗體密度的影響。不管起始Ab/液滴比例是多少，除去未反應的Ab後測量到的效率範圍是55～63％。共焦顯微鏡和TEM觀察進一步證實上述情況，分別通過它們可以明顯地推論出，大部分Ab分子在O/W界面附著於油滴，而自由Ab分子集中於外部水介質中。與使用完整的IgG分子得到的結果相比，這些發現說明了明顯的改進。效率從25％增加至63％，而AMB8LK片段的密度進一步從40Ab分子/液滴增加至100Ab分子/液滴。該觀察指出與Ab分子尺寸相關的立體位阻效應的重要性。由此，與MW150000的IgG相比，用Fab′AMB8LK片段(MW50000)可以實現最高密度。可以推斷，隨著MAb片段的分子量降低，偶聯效率增加。1.3.H-鐵蛋白的免疫染色為了測定在不同癌細胞系中例如CAPAN-1(胰腺癌細胞)，SK-BR-3(乳腺癌細胞)，Caco-2(結腸癌細胞)和兩種對照正常細胞系例如成纖維細胞和平滑肌細胞中H-鐵蛋白的過度表達而進行免疫染色。將細胞與AMB8LKFab2片段培養以檢測H-鐵蛋白的過度表達。將不與AMB8LKFab2片段培養的而僅僅與第二抗體培養的細胞作為對照。僅僅在癌症細胞中觀察到清楚的螢光說明了鐵蛋白的表達，而正常細胞不顯示螢光則證實不存在鐵蛋白。因此，似乎可以證實H-鐵蛋白分子能被用作乳腺癌，結腸癌和胰腺癌療法靶分子的假設，並進一步研究其優點。1.4.使用流細胞計數法進行的體外結合分析FACS分析揭示，與由於其負電荷性質而不與細胞結合的陰離子乳液相比，AMB8LK-免疫乳液和陽離子乳液與CAPAN-1細胞繫結合。1.5.通過共焦顯微鏡顯示的體外吸收與空白陽離子乳液相比較，AMB8LK免疫乳液製劑會更迅速且有效地定性結合至Capan-1細胞繫上。1.6.測定定量吸收與使用陰離子乳液(34％)相比較，使用陽離子乳液時，包含於滲透入細胞內的乳液中的螢光親脂性探針的份額更高(42.7％)，這證實了先前的結果，該結果已經證明與陰離子乳液相比，陽離子乳液會增強不同親脂性藥物對不同組織和器官的滲透，與給藥途徑無關[22]。可以推斷，AMB8LK偶聯至酸性乳液不僅不阻止或降低螢光探針的吸收，反而使其顯著增加(增加50％)。探針滲透性增強清楚地表明，內化過程不僅被陽離子油滴的靜電效應調節，還可能被細胞-受體調節的內吞作用調節，所述內吞作用通過受到AMB8LKMAb影響的細胞表面內化受體配體進行。實施例2使用N-(l-硬脂醯)-馬來醯亞胺的結合方法2.1.合成交聯劑N-(1-硬脂醯)-馬來醯亞胺(SM)在室溫下，攪拌在氯仿(10ml)中的硬脂醯胺(0.01摩爾)和馬來酐(0.01摩爾)的混合物超過3小時。濾出沉澱的晶體，用少量的氯仿洗滌以得到純N-(1-硬脂醯)馬來酸。在乙酸酐(30ml)中回流後一化合物(4毫摩爾)和醋酸鈉(0.03g，相當於0.3毫摩爾)超過30分鐘，然後立即在冰浴中冷卻。收集沉澱的晶體並用水洗滌以得到標題化合物N-(1-硬脂醯)-馬來醯亞胺，收率為85％(流程圖-1)。流程圖12.2.曲妥單抗抗體通過硫醚方法結合至乳液2.2.1.曲妥單抗的硫醇化抗體使用2-亞胺巰醇(Traut′sreagent，AldrichChemicalsco.MilwaukeeWisconsin)進行硫醇化。將抗體溶於由50mMTris，1mMEDTA和150mMNaCl組成的pH值為8.5的緩衝溶液中。然後以相對於抗體600∶1的分子比添加2-亞胺巰醇，然後在室溫下培養超過45分鐘。反應混合物上HiTrapTM脫鹽柱(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)以除去過量的2-亞胺巰醇。使用Traut′s試劑修飾抗體不影響其特異性識別SK-BR3細胞上過度表達的抗原HER2的能力。不存在曲妥單抗時沒有螢光，而存在曲妥單抗時記錄到顯著的細胞表面螢光。2.2.2.結合方法將硫醇化的抗體立即添加至含有N-(1-硬脂醯)-馬來醯亞胺(SM)交聯劑的酸性乳液(pH值6.5)中。反應混合物室溫下過夜，同時混合併處於氮氣環境下。使用1.5×25cmSepharoseCL-4B柱(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)，用水洗脫混合物以除去未結合的抗體。2.3.對結合反應效果的評價2.3.1.ELISA根據下列方案的半定量ELISA方法(酶聯免疫吸收測定)，以新型交聯劑N-(1-硬脂醯)-馬來醯亞胺(SM)的濃度為函數來評價結合效率(抗體結合到乳液的百分比)·用免疫乳液或空白乳液(在包覆緩衝液pH值9.5中稀釋)包覆小孔，·37℃培養過夜，·用PBS-Tween洗滌20×3，·通過2％BSA阻斷非特異性結合超過1.5小時，·用PBS-Tween洗滌20×3，·添加第二抗體(Horseraddish結合的抗人IgG，JacksonImmunoresearchLtd.，WestGrove，Pennsylvania，USA)並培養2小時RT，·用PBS-Tween洗滌20×3，·添加底物(TMB/E，SingleOakDrive-Temecula，California)，·使用螢光分光計讀取展開顏色在650nm的UV吸光度。結合效率隨乳液製品中SM交聯劑量的增加而增加，初始比例45曲妥單抗分子/油滴時幾乎達到30％結合。2.3.2.免疫金染色使用其它作者之前報導的技術(6)，用12nm黃金結合的第二抗人IgG抗體(JacksonImmunoresearchLtd.，WestGrove，.Pennsylvania，USA)檢測乳液油滴上的曲妥單抗。在曲妥單抗和黃金第二抗體之間的免疫反應之後，就可以看見實際上是黃金納米微粒的黑點並使用射電顯微術進行局部化。可以明顯地注意到，曲妥單抗位於乳液的油滴上。而且，單一油滴上的黑點數目接近多至5-6Ab分子/液滴。此外，乳液的外部水相中幾乎沒有自由黑點並且發生隨機結合。該結果證實ELISA發現。實施例3活性測定3.1.細胞培養研究在研究的全過程使用已知會過度表達HER2抗原的乳腺癌細胞，SK-BR3細胞(ATCC，Manassas，Virginia，USA)的沿用已久的細胞系模型以在評估曲妥單抗親和性和免疫乳液製品的比活性。3.2.結合研究將細胞固定於蓋玻片上，用5％BSA阻斷非特異性結合。然後，細胞與空白乳液或者免疫乳液(最終稀釋度1∶1000)培養過夜。使用PBS連續洗液3次以除去未結合的油滴，然後添加FITC-結合的抗人抗體(最終稀釋度1∶50)以檢測曲妥單抗。進行一次額外的洗滌。使用Zeiss共焦顯微鏡檢驗螢光。將抗體附著於乳液上並與細胞結合。此外，由於第二抗體識別曲妥單抗，表明製備過程之後曲妥單抗沒有變性。然而，為了使空白乳液也顯相，還用親脂性螢光探針香豆素-6(PolyscienceInc，Warrington，Pennsylvania)以油相中香豆素對類脂E801∶1000的比例標記乳液(7)。將細胞固定於蓋玻片上，用5％BSA阻斷非特異性結合。在室溫下與標記的空白乳液和免疫乳液(最終稀釋度1∶1000)培養超過1小時。用PBS連續洗滌細胞3次，然後使用共焦顯微鏡觀察。觀察到空白乳液和免疫乳液與SK-BR3細胞結合的定性顯著差異，其反映為螢光密度上的差異。可以明顯看出，免疫乳液廣泛地結合於細胞上，而在室溫下培養超過1小時後空白乳液的結合最低。為了證明，使用FACS分析(螢光激活細胞分類分析)進行額外的研究。將細胞固定，單獨用曲妥單抗或者與免疫乳液(兩個樣品中曲妥單抗濃度相同)培養超過1小時。用PBS連續洗滌細胞3次，然後添加FITC-結合的第二抗體(最終稀釋度1∶50)。再次用PBS洗滌細胞，然後通過FACS分析。顯然，與相同量的自由抗體相比，免疫乳液的親和程度為約5％。然而，與對照相比，發生顯著的油滴結合，並且可以促進負載於陽離子油滴的顯著藥物用量的內化。3.3.吸收研究將SK-BR3細胞在37℃與空白乳液或用香豆素-6標記的免疫乳液培養不同時間5，15，30分鐘。用PBS連續洗滌細胞3次，然後固定並用Zeiss共焦顯微鏡檢測。可以明顯記錄到，空白乳液以最低程度與細胞結合，然而定性地免疫乳液更強烈地與細胞結合併且結合程度隨時間更加顯著。實施例4使用SMCC進行的結合方法附圖2.說明，可以使用兩種不同方法將SMCC偶聯至硬脂醯胺(SA)上。首先製備乳液，並且將SMCC添加至乳液中，所以反應會在O/W界面發生。或者，SMCC可以首先附著於天然SA上，在乳液形成之前將新型偶聯劑摻入油相中。在第二階段中，1，4-二硫赤蘚糖醇(DTT)存在時在溫和條件下還原抗體。室溫下，2mg/mlPBS緩衝液中的抗體溶液與20mMDTT培養30分鐘，或與50nM半胱胺在37℃攪拌下培養1小時。然後，使用SephadexG25對部分還原的抗體溶液進行凝膠過濾，以除去過量未反應的DTT，並且用2.25％甘油溶液(不含PBS)替換溶液介質。然後，將100g上述還原的抗體添加至10ml馬來醯亞胺衍生的乳液(活化的乳液)中，室溫下恆定攪拌過夜。實施例5使用SPDP進行的結合方法附圖3.說明，首先將SPDP添加至乳液中，在O/W界面與SA的NH2部分反應，形成二硫鍵。然後，所得的混合的二硫鍵與還原劑(DTT)反應超過2小時，導致釋放吡啶二硫代丙醯結合物並且在液滴表面形成自由SH基團。該過程結束後，進行vivaspin20(10kDa)透析，以除去吡啶二硫代丙醯副產物、未反應的DTT和任何可能過量的SPDP。然後所得乳液(具有自由SH基團)與活化的抗體(與SMCC反應的IgG)培養，以產生最終的抗體-乳液結合物。實施例6ANB8LK的結合6.1.1.製備乳液如前所述製備AMB8LK免疫乳液。使用香豆素6探針製備螢光乳液。以1∶200的摩爾比將探針摻入乳液中。由於MCT濃度是5％(～97.6μmol/ml)，添加的香豆素6劑量是0.488μmol/ml。簡要地，SepharoseCL-4B分離之後，將4μl9.3mM香豆素6四氫呋喃(THF)溶液添加至500μl乳液中。混合物渦流並在37℃培養2小時。6.1.2.FACS分析對於FACS分析，Capan-1細胞系生長至融合。細胞用胰酶消化並以1200rpm離心5分鐘。除去上清液並添加1mlFACS緩衝液。整個過程中細胞始終置於冰上。洗滌FACS管中的1-2×105細胞並再次離心，然後將每個色斑置於100μlFACS緩衝液中，所述緩衝液以1∶1000的稀釋度含有不同乳液配方。在冰上培養30分鐘。再次洗滌細胞，離心並懸浮於0.5-1mlFACS緩衝液中。然後進行FACS分析。6.1.3.螢光顯微學分析Capan-1細胞達到融合之後用胰酶消化，並且轉移(每孔105細胞)至用18mm蓋玻片覆蓋的16孔板上。將細胞粘附於蓋玻片24小時，37℃，5％CO2。24小時之後，棄去培養基，37℃下細胞與標記的乳液對PBS1∶1000培養0，30和60分鐘。之後，使用新鮮的4％多聚甲醛固定10分鐘。棄去多聚甲醛並用PBS×3洗滌細胞。用50mMNH4ClPBS阻斷自身螢光5分鐘。再次用PBS×3洗滌細胞，並用螢光顯微鏡和共焦顯微鏡觀察。6.1.4.定量分析Capan-1細胞達到融合之後用胰酶消化，並且轉移(每孔105細胞)至24孔板上。37℃且5％CO2條件下，將細胞附著於平板直至達到融合。下一步，用各種標記的乳液樣品與細胞(PBS中1∶1000)37℃培養超過45分鐘。用PBS×3洗滌細胞樣品，而不洗滌對照。使用BMGLabtechnologies的FluoStar-Galaxy測定平板的螢光，激發波長485nm且發射波長520nm。每個平板讀數4次並計算平均值。6.2.結果6.2.1.標記乳液共焦顯微學觀察得出結論，即用香豆素6標記油滴。6.2.2.比較AMB8LK免疫乳液和陽離子乳液(標記的製劑)37℃時，它們與Capan-1細胞培養不同時間間隔0，30和60分鐘。使用共焦和螢光顯微鏡對兩種製劑進行比較。6.2.3.陽離子乳液，陰離子乳液和免疫乳液的結合研究還使用FACS分析(4℃，30分鐘)研究不同乳液製劑的結合。所有製劑，除陰離子乳液之外，在4℃與Capan-1細胞繫結合30分鐘。當在37℃培養1小時時，可更好地觀察到陽離子乳液和AMB8LK免疫乳液之間差異。6.2.4.吸收研究使用FlouStar-Galaxy進行螢光測定，以測定Capan-1細胞對乳液樣品的定量吸收。可以從附圖4的數據得知，與陰離子乳液相比較，滲透入細胞內的乳液所包含的螢光親脂性探針的份額對於陽離子乳液更高。AMB8LK偶聯至陽離子乳液，不僅不阻止或降低螢光探針的吸收，反而顯著地增強(50％)探針的滲透，這清楚地表明內化過程不僅僅被陽離子油滴的靜電效應調節，而且被細胞受體調節的內吞作用調節，所述內吞作用是通過受AMB8LK單克隆抗體影響的細胞表面內化受體配體進行的。參考1.AllenTM.Ligand-targetedtherapeuticsinanticancertherapy.NatRevCancer.2002Oct；2(10)750-63.2.FarahRA，ClinchyB，HerreraL，VitettaES.Thedevelopmentofmonoclonalantibodiesforthetherapyofcancer，CritRevEukaryotGeneExpr.1998；8(3-4)321-56.3.OlayioyeMA.UpdateonHER-2asatargetforcancertherapyIntracellularsignalingpathwaysofErbB2/HER-2andfamilymembers.BreastCancerRes.2001；3(6)385-9.4.SlamonDJ，ClarkGM，WongSG，LevinWJ，UllrichA，McGuireWL.HumanbreastcancercorrelationofrelapseandsurvivalwithamplificationoftheHER-2andneuoncogene.Science，1987Jan.9；235(4785)177-82.5.SlamonDJ，GodolphinW，JonesLA，HoltJA，WongSG，keithDE，LevinWJ，StuartSG，UdoveJ，UllrichA，etal.StudiesoftheHER-2/neuproto-oncogeneinhumanbreastandovariancancer.Science.1989May12；244(4905)707-12.6.RossJS，GrayK，GrayGS，WorlandPJ，RolfeM.Anticancerantibodies，AmJClinPathol.2003Apr；119(4)472-85.7.MerlinJL，Barberi-HeyobM，Invitrocomparativeevaluationoftrastuzumab(Herceptin)combinedwithpaclitaxel(Taxol)ordocetaxel(Taxotere)inHER2-expressinghumanbreastcancercelllines.AnnOncol.2002；13(11)1743-8.8.NishimuraR，NagaoK，MiyayamaH，OkazakiS，NakagawaK，FujimuraY.AcaseofrecurrentbreastcancerwithlungmetastasisandoverexpressionofHER2thatrespondedtoUFTandcyclophosphamidecombinationtherapyaftersequentialtreatmentswithepirubicin，taxanes，andtrastuzumab，GanToKagakuRyoho.2003Jun；30(6)879-82.9.KadoucheJ，LevyR.Utilisationd』anticorpsmonoclonauxanti-ferritiensdansletraitementdecertainscancers.2002.FR0000718.10.VriesendorpHM，QuadriSM.Radiolabeledimmunoglobulintherapyoldbarriersandnewopportunities.ExpertRevAnticancerTher.2001Oct；1(3)461-78.11.AlanR，etal.DistributionofmonoclonalantiferritinantibodyinKaposi’ssarcoma，Hodjkin’sdiseaseandhepatocellularcareinoma.HumanPathology.2003April；34381-84.12.ParkJW，KirpotinDB，HongK，ShalabyR，ShaoY，NielsenUB，MarksJD，PapahadjopoulosD，BenzCC.Tumortargetingusinganti-her2immunoliposomes.JControlRelease.2001Jul6；74(1-3)95-113.13.ParkJW，HongK，KirpotinDB，ColbernG，ShalabyR，BaselgaJ，ShaoY，NielsenUB，MarksJD，MooreD，PapahadjopoulosD，BenzCC.Anti-HER2immunoliposomesenhancedefficacyattributabletotargeteddelivery.ClincancerRes.2002Apr；8(4)1172-81.14.NamSM，KimHS，AhnWS，ParkYS.Stericallystabilizedanti-G(M3)，anti-Le(X)immunoliposomestargetingtoB16BL6，HRT-18cancercells.OncolRes.1999；11(1)9-16.15.MaruyamaK，TakahashiN，TagawaT，NagaikeK，IwatsuruM.Immunoliposomesbearingpolyethyleneglycol-coupledFab』fragmentshowprolongedcirculationtimeandhighextravasationintotargetedsolidtumorsinvivo.FEBSLett.1997Aug11；413(1)177-80.16.KoningGA，MorseltHW，VelinovaMJ，DongaJ，GorterA，AllenTM，ZalipskyS，KampsJA，ScherphofGL.Selectivatransferofalipophilicprodrugof5-fluorodeoxyuridinefromimmunoliposomestocoloncancercells.BiochimBiophysActa.1999Aug20；1420(1-2)153-67.17.LopesdeMenezesDE，PilarskiLM，AllenTM.InvitroandinvivotargetingofimmunoliposomaldoxorubicintohumanB-celllymphoma，CancerRes.1998Aug1；58(15)3320-30.18.MastrobattistaE，StormG，vanBlooisL，ReszkaR，BloemenPG，CrommelinDJ，HenricksPA.Cellularuptakeofliposomest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