一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法

2023-06-09 05:50:06

一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法。該鑑定方法是將取自癌症病人的一小塊腫瘤組織，在特定的培養基中刺激腫瘤組織中的淋巴細胞，培養5天，然後直接用酶聯免疫測定法檢測培養基中的γ幹擾素水平，從而鑑定腫瘤殺傷性淋巴細胞。本發明直接測定培養基中γ幹擾素水平，快速，耗時較短。
【專利說明】一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學領域，尤其涉及的是一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法。
【背景技術】
[0002]環境汙染和遺傳因素會導致DNA和基因的突變，癌細胞起源於人體內細胞由於DNA突變和損傷的無控制生長。通常，癌細胞生長形成腫瘤，癌細胞還會轉移到別處繼續生長，從而破壞正常的組織器官，導致病人的死亡。
[0003]癌症已成為常見病、多發病。據2008年的統計數據，全球有新發癌症病例1266萬，死亡800萬，估計至2015年新發癌症病例將達到1500萬之多。《2012中國腫瘤登記年報》對外發布，報導全國每6分鐘就有一人被確診為癌症，每天有8550人成為癌症患者，每七到八人中就有一人死於癌症。全國癌症發病形勢嚴峻，發病率與死亡率呈持續上升趨勢，每年新發癌症病例約350萬，因癌症死亡約250萬。伴隨著對空氣中瀰漫的PM2.5的不安，這一連串灰色的數字令中國人對癌症的認知繃得更緊了。
[0004]目前癌症是繼心血管之後的第二位導致人類死亡的因素，大約一半的男人和三分之一多的女人會產生癌症。我國居民一生罹患癌症的概率為22%，癌症已成為人類第一殺手。目前，還沒有很有效的辦法來對付癌症，特別是晚期癌症病人的治療。20世紀以來，以手術治療、放射治療和化學治療三大常規武器為治療和康復做出巨大的貢獻，但這些傳統治療手段均有其局限性，在癌症治療中未能取得整體滿意效果。比如手術治療，只適合大約20%的較早期的癌患者，有一部分手術治療可以獲得滿意的根治效果，遺憾的是這樣的情況實在是少數，大部分病例不適合手術治療。化療是雙刃劍，全身化療，毒副作用大，少數病種可以獲得根治效果，但大部分化療只是姑息或輔助效果，盲目化療無益生活質量提高，甚至因為化療導致併發症而增加身體和經濟負擔。為了根治癌症，迫切需要找到一種有效的治療癌症的辦法。
[0005]腫瘤的免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免疫抗癌的新型生物技術治療方法。它是運用生物技術和生物製劑對從病人體內採集的免疫細胞進行體外培養和擴增後回輸到病人體內的方法，來激發，增強機體自身免疫功能，從而達到治療腫瘤的目的。腫瘤的免疫治療是繼手術、放療和化療之後的第四大腫瘤治療技術。
[0006]利用特異的殺傷性淋巴細胞進行腫瘤免疫治療起源於八十年代，利用抗腫瘤的淋巴細胞進行腫瘤免疫治療是一種特異、有效而先進的癌症治療手段。近年來，這一技術在皮膚癌晚期病人的治療上得到成功的應用。臨床試驗證明，四分之三的皮膚癌晚期病人經過治療後癌症腫塊明顯消退，一半的皮膚癌晚期病人完全康復。因此，利用抗腫瘤的淋巴細胞進行腫瘤細胞免疫治療是一種非常有效的癌症治療新技術，有著廣闊的應用前景。
[0007]利用特異的殺傷性淋巴細胞進行腫瘤免疫治療的過程包括腫瘤組織樣品的取得，從腫瘤樣品中分離腫瘤殺傷性淋巴細胞，腫瘤殺傷性淋巴細胞的大量擴增和活化，腫瘤殺傷性淋巴細胞輸入癌症病人和臨床效果的觀察。腫瘤殺傷性淋巴細胞的分離是關鍵。對從皮膚癌症病人分離腫瘤殺傷性淋巴細胞已進行了大量的研究，並取得了很好的效果，可以從百分之八十以上的皮膚癌症病人分離得到腫瘤殺傷性淋巴細胞。研究顯示，也可以從其他癌症病人患者分離得到腫瘤殺傷性淋巴細胞。因此，腫瘤殺傷性淋巴細胞的腫瘤免疫治療也可以應用於其他癌症病人。
[0008]腫瘤免疫治療的關鍵是從癌症病人體內分離、鑑定腫瘤殺傷性淋巴細胞。通常，從癌症病人中切除一小塊腫瘤組織，經過7-10天的刺激和培養，得到幾百萬的腫瘤浸潤性淋巴細胞。然後，進行腫瘤浸潤性淋巴細胞和腫瘤細胞的共培養。二十四小時後，利用酶聯免疫測定法檢測淋巴細胞是否釋放Y幹擾素，從而確定淋巴細胞是否具有腫瘤殺傷性。這種經典的鑑定腫瘤殺傷性淋巴細胞的方法，耗時較長，而且需要腫瘤細胞作為靶細胞。往往從癌症病人腫瘤組織中誘導培養原代腫瘤細胞，非常困難。所以，迫切需要簡易快速的方法來鑑定來自癌症病人的腫瘤殺傷性淋巴細胞，以便有效地用於腫瘤的免疫治療。

【發明內容】

[0009]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供了一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法。
[0010]本發明的技術方案如下:
[0011]一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法，包括以下步驟:
[0012](I)取0.5釐米大小的癌症病人的腫瘤組織塊，在生物安全櫃中用手術刀將其切成I毫米見方的腫瘤組織小塊；
[0013](2)將腫瘤組織放於24孔培養板，添加RPM1-1640培養基和白細胞介素_2，然後將24孔培養板置於37°C和5% C02培養箱中培養；
[0014](3)培養兩天後，再添加RPM1-1640培養基和白細胞介素_2，將24孔培養板置於37°C和5% C02培養箱中繼續培養；
[0015](4)第五天，從每孔培養基吸取0.5毫升培養基，置於_20°C冰箱保存；用伽馬乾擾素酶聯免疫試劑盒測定培養基中伽馬乾擾素的含量；培養基中含有100皮克/毫升以上的伽馬乾擾素所對應的孔中的淋巴細胞，是具有抗腫瘤活性的淋巴細胞。
[0016]所述的鑑定方法，步驟(2)中，24孔培養板每孔放入一塊(I)所述腫瘤組織小塊；每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和1000IU白細胞介素_2。
[0017]所述的鑑定方法，步驟(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和200IU白細胞介素_2。
[0018]本發明的特點是直接測定培養基中Y幹擾素水平。所以，快速，耗時較短，不需要從癌症病人腫瘤組織誘導培養原代腫瘤細胞作為靶細胞。本發明的原理是當腫瘤組織中的腫瘤浸潤性淋巴細胞受到特定培養基刺激時，腫瘤組織中的癌細胞本身也可以刺激淋巴細胞。也就是說，腫瘤組織中的癌細胞本身作為靶細胞，來刺激淋巴細胞釋放Y幹擾素，以此來鑑定來自癌症病人的抗腫瘤淋巴細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為乳腺癌病人LMC5130的淋巴細胞抗癌活性的測定。
[0020]圖2為肺癌病人LMC576的淋巴細胞抗癌活性的測定。
[0021]圖3為腎癌病人LMC584的淋巴細胞抗癌活性的測定。[0022]圖4為大腸癌病人LMC586的淋巴細胞抗癌活性的測定。
【具體實施方式】
[0023]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0024]實施例1
[0025]從乳腺癌病人(病人代碼為LMC5130)中手術切除0.5釐米大小的腫瘤塊及其臨近的正常乳腺組織塊。在生物安全櫃中用手術刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把乳腺正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和乳腺正常組織放於24孔培養板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置於4個孔中培養。乳腺正常組織標記為5130Ν-1、5130Ν-2、5130Ν-3和5130N-4 ;乳腺腫瘤組織標記為5130Tu_l、5130Tu-2、5130Tu-3 和 5130Tu_4。每一孔添加 I 毫升 RPM1-1640 培養基和 1000IU 白細胞介素-2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中培養。培養兩天後，每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和200IU白細胞介素_2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中繼續培養。第五天，從每孔培養基吸取0.5毫升，置於-20°C冰箱保存。用伽馬乾擾素酶聯免疫試劑盒測定培養基中伽馬乾擾素的含量。
[0026]測定結果如圖1所示，從圖1看出，從乳腺癌病人LMC5130腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-5130TU-1和抗腫瘤的淋巴細胞株-5130TU-3，在這兩株淋巴細胞樣品的培養基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬乾擾素釋放。
[0027]實施例2
[0028]從肺癌病人(病人代碼為LMC576)中手術切除0.5釐米大小的腫瘤塊及其臨近的正常肺組織塊。在生物安全櫃中用手術刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把肺正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和肺正常組織放於24孔培養板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置於4個孔中培養。肺正常組織標記為 576Ν-1、576Ν-2、576Ν-3 和 576N-4 ;肺癌腫瘤組織標記為 576Tu-l、576Tu-2、576Tu_3 和576TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養基和1000IU白細胞介素_2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中培養。培養兩天後，每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和200IU白細胞介素-2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中繼續培養。第五天，從每孔培養基吸取0.5毫升，置於-20°C冰箱保存。用伽馬乾擾素酶聯免疫試劑盒測定培養基中伽馬乾擾素的含量。
[0029]測定結果如圖2所述，從圖2可以看出，從肺癌病人LMC576腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-576Τ-1、576Τ-2、576Τ-3和576Τ-4。從肺正常組織中，也檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-576Ν-1和576Ν-2。在這些淋巴細胞樣品的培養基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬乾擾素釋放。
[0030]實施例3
[0031]從腎癌病人(病人代碼為LMC584)中手術切除0.5釐米大小的腫瘤塊及其臨近的正常腎組織塊。在生物安全櫃中用手術刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把腎正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和腎正常組織放於24孔培養板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置於4個孔中培養。腎正常組織標記為 584Ν-1、584Ν-2、584Ν-3 和 584Ν-4 ;腎癌腫瘤組織標記為 584Tu-l、584Tu-2、584Tu_3 和584TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養基和IOOOIU白細胞介素_2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中培養。培養兩天後，每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和200IU白細胞介素-2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中繼續培養。第五天，從每孔培養基吸取0.5毫升，置於-20°C冰箱保存。用伽馬乾擾素酶聯免疫試劑盒測定培養基中伽馬乾擾素的含量。
[0032]測定結果見圖3，從圖3可以看出，從腎癌病人LMC584腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-584TU-2和584TU-3，在這兩株淋巴細胞樣品的培養基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬乾擾素釋放。
[0033]實施例4
[0034]從大腸癌病人(病人代碼為LMC586)中手術切除0.5釐米大小的腫瘤塊及其臨近的正常大腸組織塊。在生物安全櫃中用手術刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把大腸正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和大腸正常組織放於24孔培養板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置於4個孔中培養。大腸正常組織標記為586Ν-1、586Ν-2、586Ν-3和586N-4 ;大腸癌腫瘤組織標記為586Tu_l、586Tu-2、586Tu-3和586Tu_4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養基和1000IU白細胞介素-2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中培養。培養兩天後，每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和200IU白細胞介素_2。把24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中繼續培養。第五天，從每孔培養基吸取0.5毫升，置於-20°C冰箱保存。用伽馬乾擾素酶聯免疫試劑盒測定培養基中伽馬乾擾素的含量。
[0035]測定結果如圖4所示，從圖4可以看出，大腸癌病人LMC586腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-586TU-3，在這個淋巴細胞樣品的培養基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬乾擾素釋放。
[0036]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種抗腫瘤淋巴細胞的鑑定方法，其特徵是，包括以下步驟: (1)取0.5釐米大小的癌症病人的腫瘤組織塊，在生物安全櫃中用手術刀將其切成I毫米見方的腫瘤組織小塊； (2)將腫瘤組織放於24孔培養板，添加RPM1-1640培養基和白細胞介素_2，然後將24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中培養； (3)培養兩天後，再添加RPM1-1640培養基和白細胞介素_2，將24孔培養板置於37°C和5% CO2培養箱中繼續培養； (4)第五天，從每孔培養基吸取0.5毫升培養基，置於-20°C冰箱保存；用伽馬乾擾素酶聯免疫試劑盒測定培養基中伽馬乾擾素的含量；培養基中含有100皮克/毫升以上的伽馬乾擾素所對應的孔中的淋巴細胞，是具有抗腫瘤活性的淋巴細胞。
2.根據權利要求1所述的鑑定方法，其特徵是，步驟(2)中，24孔培養板每孔放入一塊(I)所述腫瘤組織小塊；每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和1000IU白細胞介素_2。
3.根據權利要求1所述的鑑定方法，其特徵是，步驟(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培養基和200IU白細胞介素-2。
【文檔編號】G01N33/68GK103823068SQ201310690699
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】周菊華 申請人:周菊華