一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法
2023-06-08 21:09:26
專利名稱：一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白質藥物的生產過程，特別提供了一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法。
背景技術：
隨著基因工程技術的日益成熟，越來越多的重組蛋白質藥物被開發利用。由於生產過程中涉及到革蘭氏陰性大腸桿菌以及分離純化過程複雜，因此會造成內毒素的汙染。
親和技術是分離純化生物大分子的有效手段，主要利用配基與生物大分子之間的親和作用原理。將配基通過共價鍵合多孔介質上就得到親和介質，可以用來選擇性地吸附內毒素，實現從重組蛋白質溶液中去除內毒素的目標。已有的親和配基和親和介質包括單克隆抗體，多克隆抗體，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亞胺，組氨酸，凝膠過濾柱，親和膜，顆粒吸附劑等。如專利EP0800862，採用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用離子交換的原理，來去除重組蛋白質腫瘤壞死因子或白介素中的內毒素，主要吸附重組蛋白質。
專利EP0337243，使用串聯的兩隻反相液相色譜柱，來純化重組人IL-2。在純化重組人白介素-2的同時，去除內毒素雜質，流速低，介質昂貴。
專利US4885168，採用低分子量殼聚糖，利用殼聚糖上帶正電荷的氨基來與帶負電荷的核酸與內毒素作用，達到除去核酸與內毒素的目的。但殼聚糖的利用率低。
專利00123290.6，魏桂林等的一種用於內毒素去除的疏水荷正電親和膜，將胺類疏水荷正電親和配基鍵合到纖維素膜上，得到相應的親和膜。胺類疏水荷正電親和配基包括2～12碳的烴基二胺、帶有乙烯基的不飽和雜環化合物、帶有環氧基團的季銨鹽及帶有多個疏水基團的季銨鹽。
D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91.)採用去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，以微孔尼龍膜為介質，製成親和膜。採用單張親和膜，可以去除緩衝液或牛血清白蛋白中的內毒素。但流速低，阻力高，處理量少，不易放大。
由於重組蛋白質種類較多，其分離純化(的方式和步驟)步驟各不相同，生產過程中對其中的內毒素含量要求也有差異，因此去除內毒素的方法和效果無法完全通用。
發明內容
本發明提供了一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，用該方法可以達到既 去除內毒素，又儘可能減少流感疫苗活性損失的目的。
本發明提供了一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，以親和介質製成親和柱或親和膜分離器，以靜態吸附、過濾的方式處理流感疫苗去除其中的內毒素，其特徵在於所述親和介質是以聚乙烯亞胺為親和配基，親和介質的含氮量為0.75-7.0％。
本發明從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法中，所述聚乙烯亞胺的分子量最好在600到60,000。
本發明從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法中，所述親和配基可以通過共價交聯的方式結合到N，N′-亞甲基-次(甲基丙烯醯胺)甲基丙烯酸縮水甘油酯-丙烯基縮水甘油醚和甲基丙烯醯胺的共聚物顆粒上製成親和介質。
本發明從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法中，所述親和配基又可以通過共價交聯的方式結合到纖維素膜上製成親和介質。
本發明從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法中，所述親和配基還可以與纖維素、異硫氰酸酯混合、反應，得到膜狀荷電微孔親和介質，膜孔徑為0.2-1微米。
本發明從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法中，流感疫苗與親和介質的比例為20-200毫升/克。
本發明針對流感疫苗製劑生產過程中的內毒素，根據其分子量大小、等電點的範圍、溶液中其它物質的含量和種類的需要，判斷和選擇聚乙烯亞胺作為親和配基。
將聚乙烯亞胺共價結合到N，N′-亞甲基-次(甲基丙烯醯胺)甲基丙烯酸縮水甘油酯，丙烯基縮水甘油醚和甲基丙烯醯胺的共聚物顆粒上，得到親和介質並裝成2ml體積的填充柱，加入(處理)10ml流感疫苗溶液，經單次過濾處理，疫苗溶液的內毒素濃度從＞250EU/ml降低到＜50EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率為90％以上。
將聚乙烯亞胺共價結合到纖維素濾膜上，取0.03克親和膜，加入3ml流感疫苗，靜態吸附3小時後，疫苗溶液中的內毒素濃度從＞4400EU/ml降低到＜2200EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率為52％以上。
將聚乙烯亞胺與纖維素、異硫氰酸酯混合、反應，得到共混荷電微孔親和膜，取0.04克親和膜，加入2ml流感疫苗，靜態振蕩吸附2小時後，對疫苗溶液中內毒素的去除率為57％，流感疫苗中有效成分回收率為93％。
總之，本發明對內毒素的去除率高，特異性好，流感疫苗活性回收率高，適合生產的要求。
具體實施例方式實施例1.聚乙烯亞胺與顆粒的鍵合分別溶解0.3g不同分子量(600，60000)的聚乙烯亞胺於PH＝9、濃度為1mol/L的磷酸鉀緩衝液12ml中，分別加入2gN，N′-亞甲基-次(甲基丙烯醯胺)甲基丙烯酸縮水甘油酯-丙烯基縮水甘油醚和甲基丙烯醯胺的共聚物顆粒；室溫下放置72-96小時，抽濾去除液體；顆粒用50ml 0.1mol/LPH＝9的磷酸鉀緩衝液分三次洗滌，備用。製成的親和介質經凱氏定氮法測定其含氮量，分別為7.0％、6.8％。
實施例2.聚乙烯亞胺與纖維素膜的鍵合分別取50片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水衝洗乾淨，置於一個200ml的燒杯中，加入40ml環氧氯丙烷、120ml濃度為1M的NaOH溶液和0.19gNaBH4，混合均勻，室溫下靜置過夜，進行活化。次日取活化後的膜，用大量水洗至中性，瀝乾，然後分別加入125ml1％聚乙烯亞胺溶液(分子量分別為600，1800，10000)，於30℃恆溫放置過夜(16小時以上)。次日取活化後的膜，用大量水洗至中性，瀝乾，然後加入100ml0.25％硼氫化鈉溶液(0.1M pH8.5磷酸緩衝液配製)，室溫下還原反應4小時。取還原後的膜，用大量水洗至中性，瀝乾並烘乾。裝配成相應的親和膜反應器。該親和介質經凱氏定氮法測定其含氮量，分別為2.4％、1.5％、1.2％。
實施例3.荷電微孔親和膜的製備纖維素以重量百分比7％的二醋酸纖維素，二甲基甲醯胺43.8％，丙酮22.7％，甘油26.5％，配製成制膜液，加入50％聚乙烯基亞胺(分子量為60000)水溶液、配製高分子溶液，將多異氰酸酯(二苯基甲基二異氰酸酯的多聚體)的7％溶液(DMF與丙酮各半為溶劑)，按多異氰酸酯與50％聚乙烯基亞胺重量比0.23∶1的量加入，交聯後，再加入50％聚乙烯基亞胺和甘油配製制膜液，其最終重量百分比為二醋酸纖維素7％，二甲基甲醯胺43.8％，丙酮22.8％，50％聚乙烯基亞胺水溶液1.6％，多異氰酸酯用量0.25％，甘油24.5％，將膜液刮塗於玻璃板上，厚400μm，於50℃，相對溼度高於95％的空氣中吸溼沉澱2min。待分相基本完成後浸入水中，使溶劑交換完全並除去不必要的組分，固化膜結構，製得平板微濾膜，膜孔徑為0.2-1微米。所得經凱氏定氮法測定膜的含氮量為0.75％。
實施例4.聚乙烯亞胺親和顆粒處理流感疫苗將實施例1的2ml親和介質(聚乙烯亞胺分子量為600)填充成柱，乾重0.5g，流感疫苗與親和介質的比例為20毫升/克，以8ml/min流速，循環過濾處理10ml流感疫苗製劑，1小時後，過濾後溶液中的內毒素濃度從＞250EU/ml降低到＜80EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為80％。
實施例5.聚乙烯亞胺親和顆粒處理流感疫苗將實施例1的2ml親和介質(聚乙烯亞胺分子量為60000)填充成柱，乾重約0.5g，流感疫苗與親和介質的比例為20毫升/克，以8ml/min流速，反覆循環過濾10ml流感疫苗製劑，過濾後溶液中的內毒素濃度從＞2500EU/ml降低到＜750EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為91％。
實施例6.聚乙烯亞胺親和膜處理流感疫苗將實施例2的3張親和膜(Φ13mm)浸泡於裝有流感疫苗製劑2ml的西林瓶中，流感疫苗與親和介質的比例為67毫升/克，以200r/min的振數振蕩處理，經過3小時後，溶液中的內毒素濃度從＞4500EU/ml降低到＜100EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為90％。
實施例7.荷電微孔親和膜處理流感疫苗取實施例3的荷電微孔親和膜0.012g，浸泡於裝有流感疫苗製劑2ml的西林瓶中，流感疫苗與親和介質的比例為167毫升/克，以200r/min的振數處理，經過二小時後，溶液中的內毒素濃度從＞4500EU/ml降低到＜450EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為77％。
權利要求
1.一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，以親和介質製成親和柱或親和膜分離器，以靜態吸附、過濾的方式處理流感疫苗去除其中的內毒素，其特徵在於所述親和介質是以聚乙烯亞胺為親和配基，親和介質的含氮量為0.75-7.0％。
2.按照權利要求1所述從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，其特徵在於所述聚乙烯亞胺的分子量在600到60,000。
3.按照權利要求1所述從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，其特徵在於所述親和配基通過共價交聯的方式結合到N，N′-亞甲基-次(甲基丙烯醯胺)甲基丙烯酸縮水甘油酯-丙烯基縮水甘油醚和甲基丙烯醯胺的共聚物顆粒上製成親和介質。
4.按照權利要求1所述從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，其特徵在於所述親和配基通過共價交聯的方式結合到纖維素膜上製成親和介質。
5.按照權利要求1所述從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，其特徵在於所述親和配基與纖維素、異硫氰酸酯混合、反應，得到膜狀荷電微孔親和介質，膜孔徑為0.2-1微米。
6.按照權利要求1所述從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，其特徵在於流感疫苗與親和介質的比例為20-200毫升/克。
全文摘要
一種從流感疫苗製劑中去除內毒素的方法，以親和介質製成親和柱或親和膜分離器，以靜態吸附、過濾的方式處理流感疫苗去除其中的內毒素，其特徵在於所述親和介質是以聚乙烯亞胺為親和配基，親和介質的含氮量為0.75－7.0％。本發明對內毒素的去除率高，特異性好，流感疫苗活性回收率高，適合生產的要求。
文檔編號C12N7/02GK1621088SQ200310119268
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月26日 優先權日2003年11月26日
發明者李京華, 邵英光, 陳兆安, 叢潤滋, 王俊德 申請人:中國科學院大連化學物理研究所