一種環丙沙星免疫原及其製備方法
2023-06-09 01:11:31
專利名稱：一種環丙沙星免疫原及其製備方法
技術領域：
本發明涉及到動物源食品藥物殘留的檢測領域。與酶聯檢測方法有關。更具體地說是關於環丙沙星的酶聯免疫檢測方法中所用檢測試劑的生產技術。
背景技術：
下列定義適用於整個說明書和權利要求書BSA＝牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)PBS＝磷酸生理鹽水緩衝液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.4)Sephadex-G75＝葡聚糖凝膠Ciprofloxacin-EDC＝環丙沙星與碳二亞胺形成的活性中間體環丙沙星(Ciprofloxacin)屬於喹諾酮類抗生素。這類抗生素由於其抗菌譜廣，殺菌能力強，是繼土黴素之後在畜禽水產養殖中廣泛應用的藥物。這類藥物可以有效地預防和治療家禽細菌和黴形體疾病。環丙沙星是其中最常用最有效的藥物之一。但人們通過研究逐漸發現，喹諾酮類抗生素在動物源食品中的殘留對人體有毒害。作為一種人畜共用藥，喹諾酮類抗生素在食品中的殘留通過食物鏈對人體健康危害很大。新英格蘭明尼蘇達州衛生署的KIRK E SMITH為首的研究小組發現，家禽使用喹諾酮類藥物使彎曲桿菌產生了耐藥性。根據美國疾病控制與預防中心的調查，一種由食品引起疾病的彎曲桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我國尚未頒布動物源食品中殘留的喹諾酮類藥物的檢測方法和相應標準。美國由於考慮到這類藥物的交叉感染，已經開始在畜禽養殖業中禁用喹諾酮類抗生素。我國雖尚未在畜禽水產養殖業中禁用喹諾酮類抗生素，但有嚴格的停藥期規定。隨著人民生活水平的提高及我國加入WTO，對動物源食品的品質要求也越來越高，食品中藥物殘留的檢測必將法制化，常規化。因此，研究喹諾酮類藥物在食品中的殘留限量和檢測方法是非常必要的。
在抗生素藥物殘留的檢測中，儀器法如液相色譜和質譜以及液相質譜聯用是應用最廣泛的方法。這些方法準確，穩定，可靠，可以作為標準方法。但儀器法價格昂貴，費時較長，需要大型儀器設備，需要專門的技術人員，所以難於用於現場操作。酶聯免疫檢測法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準確，簡易，不需要專門人員操作等優點，這使得ELISA法成為一種理想的，可用於常規掃描的檢測方法。酶聯免疫檢測法的核心是需要高質量的抗體。大多數抗生素包括喹諾酮類藥物都是小分子有機化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化合物轉變成能引發動物免疫系統產生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。本發明所合成的環丙沙星-牛血清蛋白偶合物(Ciprofloxacin-BSA Conjugate)，就是用來製備對環丙沙星有特異反應的抗體。據我們所知，現在世界上尚未有關於環丙沙星的免疫原的合成的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能引發動物免疫系統產生抗體的環丙沙星免疫原以及製備這種免疫原的方法。
本發明所製備的環丙沙星免疫原，其代表式為 式中BSA牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)。
n為與一個牛血清蛋白分子結合的環丙沙星的分子數。
在本發明中，n＝2-6。
該偶聯體現顯示出如下物化特徵(1)外觀白色粉末固體。
(2)紫外吸收光譜275nm，322nm，332nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547該偶聯體可用於製備環丙沙星的酶聯免疫檢測試劑。
本發明所述的環丙沙星免疫原就是通過環丙沙星與大分子蛋白偶聯，得到能引發動物免疫系統而產生特異抗體的免疫原。在本發明中選用牛血清蛋白與環丙沙星的偶聯反應來製備環丙沙星免疫原，主要包括以下步驟(1)溶液A的製備將環丙沙星(Ciprofloxacin)，N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，碳二亞胺鹽溶液(EDC.HCl)，以摩爾比1∶4∶6溶解在二甲基甲醯胺(DMF)中，反應生成環丙沙星與碳二亞胺的活性中間體(Ciprofloxacin-EDC)，備用。
(2)溶液B的配置把BSA溶於PBS緩衝溶液中，配成9.52mg/ml的溶液，備用。
(3)在室溫和不斷攪拌下，把溶液A逐漸加入到溶液B中。環丙沙星和BSA的摩爾比為6∶1。
(4)用PBS緩衝溶液透析，高速離心，取上清液。
(5)凍幹上清液，得到環丙沙星免疫原粗品。
(6)用葡聚糖凝膠層析作純化分離。PBS緩衝溶液為洗脫液。收集偶合物純品，再經凍幹得到環丙沙星免疫原的白色固體粉末。
具體實施例方式
(1)溶液A的製備在50ml圓形反應瓶內，攪拌中，加入環丙沙星13.9mg(0.042mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)19.33mg(0.168mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)48.3mg(0.252mmol)，溶解於10ml二甲基甲醯胺(DMF)中。反應4小時。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的製備在100ml圓形反應瓶內，加入476mg BSA 50ml PBS(pH＝7.4)。得到溶液B。備用。
(3)製備環丙沙星免疫原在20℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應4小時。得到環丙沙星免疫原溶液。用PBS緩衝液透析三天，每12小時更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍幹上清液，得到412mg白色固體粉末，即為環丙沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集偶合物純品。凍幹得到環丙沙星免疫原固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產物的偶聯和偶聯率。
本發明成功地製取了環丙沙星免疫原。這種免疫原可以用於製備環丙沙星抗體，從而為開發環丙沙星在食品中殘留的酶聯檢測方法奠定基礎。
權利要求
1.一種環丙沙星免疫原，其代表式為 式中BSA牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，n為與一個牛血清蛋白分子結合的環丙沙星的分子數，在本發明中，n＝2-6；該偶聯體現顯示出如下物化特徵(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜(nm)275，322，332 ；(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547；該偶聯體可用於製備環丙沙星的酶聯免疫檢測試劑。
2.依照權利要求1所述的環丙沙星免疫原的製備方法，其特徵在於包括以下主要步驟(1)溶液A的製備將環丙沙星，羥基琥珀醯亞胺，碳二亞胺鹽溶液，以摩爾比1∶4∶6溶解在二甲基甲醯胺中，反應生成環丙沙星與碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)溶液B的配置把BSA溶於PBS緩衝溶液中，配成9.5mg/ml的溶液，備用；(3)在室溫和不斷攪拌下，把溶液A逐漸加入到溶液B中，環丙沙星和BSA的摩爾比為6∶1；(4)用PBS緩衝溶液透析，高速離心，取上清液；(5)凍幹上清液，得到環丙沙星免疫原粗品；(6)用葡聚糖凝膠層析作純化分離，PBS緩衝溶液為洗脫液，收集偶合物純品，再經凍幹得到環丙沙星免疫原的白色固體粉末。
全文摘要
一種環丙沙星免疫原是由環丙沙星和牛血清蛋白在室溫下，進行偶聯反應，用PBS緩衝液進行透析，經高速離心，凍幹上清液，得到環丙沙星免疫原粗品。再用葡聚糖凝膠層析純化，凍幹得到環丙沙星免疫原純品。研究表明，該發明使用的方法成功地合成了這種可用於製備環丙沙星特異抗體的免疫原。本發明為開發環丙沙星藥物殘留酶聯免疫檢測方法奠定了基礎。
文檔編號C07K14/435GK1560077SQ200410023718
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月5日 優先權日2004年3月5日
發明者郗日沫, 盧聖欣 申請人:山東大學