一種山桐子葉片組織培養方法與流程
2023-06-09 01:13:46
本發明涉及植物組織培養快速繁殖的方法，具體為山桐子葉片為外植體的組織培養方法。
背景技術：
山桐子(Idesia polycarpa Maxim.)別名椅、水冬瓜、水冬桐、椅樹、椅桐、鬥霜紅。大風子科、山桐子屬落葉喬木，樹皮淡灰色，不裂；小枝圓柱形，細而脆，黃棕色，有明顯的皮孔，冬日呈側枝長於頂枝狀態，枝條平展，近輪生，樹冠長圓形，當年生枝條紫綠色，有淡黃色的長毛；冬芽有淡褐色毛，花單性，雌雄異株或雜性，黃綠色，有芳香，花瓣缺，排列成頂生下垂的圓錐花序，花序梗有疏柔毛，果梗細小，種子紅棕色，圓形。生於海拔400-2500米的低山區的山坡、山窪等落葉闊葉林和針闊葉混交林中。山桐子為多功能樹種，既可觀賞也是良好的生物油料樹種，為了擴大繁殖，國內外學者已經開展了扦插、嫁接和以芽、根等為外植體的組培快繁研究。在現有繁殖技術中，組織培養的方法已有報導，但報導中研究採用當年生嫩枝的芽為外植體的芽生芽方式進行組培繁殖，使用外植體多，增殖係數偏低，繁殖效率不高等問題。
技術實現要素：
發明目的：為了解決上述技術問題，本發明提供一種山桐子葉片組織培養方法。
技術方案：為了實現上述發明目的，本發明公開了一種山桐子葉片組織培養方法，包括以下步驟
(1)外植體選擇及處理：採用當年生山桐子的當年生嫩葉片為外植體，經70％酒精消毒20-25秒，再用0.1％的升汞溶液滅菌7-9分鐘，用無菌水衝洗3-5次；
(2)愈傷組織誘導培養：在超淨的工作檯上，將消毒的外植體接種在誘導愈傷組織培養基的三角瓶中，先將其置於黑暗條件下10天後，再置於普通日光燈為光源、光照強度為1500-2000lx下,每日光照16小時，溫度25-27℃、溼度為60％，培養50天，長成愈傷組織；
所述的誘導愈傷組織培養基為：每升基本培養基含：玉米素(ZT)0.2-0.8毫克、6-苄基嘌呤(6-BA)0.5-1.0毫克、α-萘乙酸(NAA)0.1-0.2毫克、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5-1.0毫克；
(3)分化增殖培養：將從(2)步中培養的愈傷組織，轉接於含有分化增殖培養基的三角瓶中，進行增殖培養，不斷增殖；所述的分化增殖培養基為：每升基本培養基含：玉米素1.0-1.5毫克、6-苄基嘌呤1.0-1.5毫克、α-萘乙酸0.08-0.1毫克；
(4)壯苗培養：將(3)步中培養的試管苗，接種於含有壯苗培養基的三角瓶中，進行壯苗培養；所述的壯苗培養基為：每升基本培養基含：玉米素0.5-1.0毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸0.1-0.2毫克；
(5)生根培養：將(4)步中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-4片葉，接種於含有生根培養基的三角瓶中，進行生根培養10-15天；所述的生根培養基為：每升基本培養基含：α-萘乙酸0.3-0.5毫克、吲哚乙酸(IAA)0.5-0.8毫克和維生素C50-100毫克；
(6)移栽：將(5)步中生長的生根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黃心土體積比為泥炭：黃心土＝1：1的基質中，澆透水，保持溫度28℃左右，相對溼度85％以上，前15天遮光70％，後逐漸見光，55天後，全光照。
作為優選，步驟(2)所述誘導愈傷組織培養基中基本培養基為：每升基本培養基中含有：硝酸鉀1550-1900mg，硝酸銨1350-1650mg，磷酸二氫鉀140-170mg，硫酸鎂300-370mg，二水氯化鈣440mg，碘化鉀0.83mg，硼酸6.2mg，四水硫酸錳22.3mg，七水硫酸鋅8.6mg，二水鉬酸鈉0.25mg，五水硫酸銅0.025mg，氯化鈷0.025mg，七水硫酸亞鐵27.8mg，乙二胺四乙酸鈉37.3mg，維生素B1 1.0mg，維生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖30000mg，卡拉膠6500mg。
作為另一種優選，步驟(3)所述分化增殖培養基中基本培養基為：每升基本培養基中含有：四水硝酸鈣375-560mg，硝酸銨270-400mg，硫酸鉀650-990mg，七水硫酸鎂250-370mg，磷酸二氫鉀120-170mg，二水氯化鈣75-95mg，四水硫酸錳22.4mg，七水硫酸鋅8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸銅0.25mg，二水鉬酸鈉0.25mg，七水硫酸亞鐵34.1mg，乙二胺四乙酸鈉46.6mg，維生素B1 1.0mg，維生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉膠6500mg。
作為另一種優選，步驟(4)所述壯苗培養基中基本培養基為：每升基本培養基中含有：四水硝酸鈣375-560mg，硝酸銨270-400mg，硫酸鉀650-990mg，七水硫酸鎂250-370mg，磷酸二氫鉀120-170mg，二水氯化鈣75-95mg，四水硫酸錳22.4mg，七水硫酸鋅8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸銅0.25mg，二水鉬酸鈉0.25mg，七水硫酸亞鐵34.1mg，乙二胺四乙酸鈉46.6mg，維生素B1 1.0mg，維生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉膠6500mg。
作為另一種優選，步驟(5)所述生根培養基中基本培養基為：每升基本培養基中含有：四水硝酸鈣375-560mg，硝酸銨270-400mg，硫酸鉀650-990mg，七水硫酸鎂250-370mg，磷酸二氫鉀120-170mg，二水氯化鈣75-95mg，四水硫酸錳22.4mg，七水硫酸鋅8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸銅0.25mg，二水鉬酸鈉0.25mg，七水硫酸亞鐵34.1mg，乙二胺四乙酸鈉46.6mg，維生素B1 1.0mg，維生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉膠6500mg。
作為另一種優選，步驟(4)所述壯苗培養的時間為30天。
作為另一種優選，所述步驟(2)愈傷組織誘導培養和步驟(3)分化增殖培養之間，還包括將培養的愈傷組織用溶液浸泡2天，所述溶液中成分為：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
技術效果：相對於現有技術，本發明的山桐子葉片組織培養方法，在短期內生產大量優質種苗，使用較少的外植體，繁殖速度快，增殖係數和生根率高，繁殖效率高。
具體實施方式
實施例1
山桐子葉片的離體培養所用的基本培養基配方如表1、表2
表1每升基本培養基中含有物質種類和質量(誘導愈傷組織培養)
表2每升基本培養基中含有物質種類和質量(分化增殖、壯苗和生根培養基)
愈傷組織培養：每升基本培養基(表1)+ZT 0.2mg+BA0.5mg+NAA0.1mg+2,4-D0.5mg；
分化增殖培養：每升基本培養基(表2)+ZT 1.0mg+BA1.0mg+NAA0.08mg；
壯苗培養：每升基本培養基(表2)+ZT 0.5mg+BA0.5mg+NAA0.1mg；
生根培養：每升基本培養基(表2)+NAA0.3mg+IAA0.8mg+VC50mg。
將上述培養基注入三角瓶中，經高溫高壓消毒(120-125℃，1.1Kg/cm2)20分鐘，待用。
1、採用經篩選的多年生山桐子當年生嫩葉為外植體，經70％酒精消毒20-25秒，再用0.1％的升汞溶液消毒7-9分鐘，用無菌水衝洗3-5次；
2、在超淨的工作檯上，無菌條件下，將消毒的外植體接種在經消毒的含有形成愈傷組織培養基的三角瓶中，先將其置於黑暗條件下10天後,再置於普通日光燈為光源、光照強度為1500-2000lx下，每日光照16小時，溫度25-27℃、溼度為60％，培養50天，形成愈傷組織；
3、將從步驟2中愈傷組織，剪切，轉接於含有分化增殖培養基的三角瓶中，進行增殖培養，不斷增殖，一個周期30天的繁殖倍數為8.5，生長高度達4.9cm，視繁殖生產需要達500瓶時進入下一步；
4、將步驟3中培養的試管芽苗，剪切，接種於經消毒的含有壯苗培養基的三角瓶中，進行壯苗培養，30天後進入下一步；增值係數達8.5。
5、將步驟4中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-4片葉，接種於含有生根培養培養基的三角瓶中，進行生根培養10-15天；
6、將步驟5中生長的帶根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黃土體積比為泥炭：黃心土＝1：1的基質中，澆透水，保持溫度25℃左右，相對溼度85％以上，前15天遮光70％，後逐漸見光，20天後生根成活，生根率達95.2％，55天左右，全光照，可實現山桐子的規模化生產。
實施例2
本實施例按實施例1的步驟進行操作，只是培養基的重量配比和原料組分不同，本實施例所用的基本培養基配方如表3、表4，增殖及壯苗培養35天的增殖係數達8.6，高生長達4.7cm，生根率為94.3％。
表3每升基本培養基中含有物質種類和質量(誘導愈傷組織培養)
表4每升基本培養基中含有物質種類和質量(分化增殖、壯苗和生根培養基)
愈傷組織培養：每升基本培養基(表3)+ZT0.8mg+BA 1.0mg+NAA 0.2mg+2,4-D1.0mg；
分化增殖培養基：每升基本培養基(表4)+ZT 1.5mg+BA 1.5mg+NAA 0.1mg；
壯苗培養：每升基本培養基(表4)+ZT 1.0mg+BA 1.0mg+NAA 0.2mg；
生根培養：每升基本培養基(表4)+NAA 0.5mg+IAA 0.5mg+VC 100mg。
實施例3
與實施例1相同，不同之處在於所述步驟(2)愈傷組織誘導培養和步驟(3)分化增殖培養之間，還包括將培養的愈傷組織用溶液浸泡2天，所述溶液中成分為：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
該方法增殖係數達10.6，生根率為98.9％。
實施例4
與實施例2相同，不同之處在於所述步驟(2)愈傷組織誘導培養和步驟(3)分化增殖培養之間，還包括將培養的愈傷組織用溶液浸泡2天，所述溶液中成分為：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
該方法增殖係數達10.2，生根率為99.2％。
以上已以較佳實施例公開了本發明，然其並非用以限制本發明，凡採用等同替換或者等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護範圍之內。