六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法
2023-06-09 01:43:31
專利名稱：六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法
技術領域：
本發明涉及一種治療肝病的藥品的檢測方法。
背景技術：
目前，肝病是我國的常見病，多發病。過量飲酒，藥物濫用導致肝臟疾患逐年上升，臨床迫切需要療效確切、安全性高的藥物以解除廣大患者的痛苦。
國家藥典委員會批准命名為六維磷脂軟膠囊，是一種安全有效的肝病治療用藥，為軟膠囊，內容物為棕黃色油狀液體。每粒膠囊含300mg大豆磷脂，6mg維生素B1，6mg維生素B2，6mg維生素B6，26μg維生素B1，6mg維生素E，30mg煙醯胺。國外的同類產品是肝得健(現名易善力)，一種德國A.NattermannCie.GmbH生產軟膠囊。
中國藥典標準中，煙醯胺鑑別方法為化學法、紫外光譜法和紅外光譜法；維生素B1鑑別方法為化學法；維生素B2鑑別方法為化學法、紫外光譜法和紅外光譜法；維生素B6鑑別方法為化學法、液相色譜法和紅外光譜法；維生素E鑑別方法為化學法和紅外光譜法。測定之前，樣品均需經化學方法的預處理，經顯色，測定吸收度，方法比較麻煩。這些鑑別方法麻煩、費時、浪費財力和物力。
肝利健質量標準中，煙醯胺的鑑別方法為薄層色譜法；維生素B1和維生素B2的鑑別方法均為經前處理後，觀察螢光顏色的物理方法；維生素B6的鑑別方法為化學方法；維生素E為氣相色譜法。這些鑑別方法麻煩、費時、浪費財力和物力，而且需對五種物質分別進行鑑別，適用性差。煙醯胺和維生素B6的含量測定，均為紫外分光光度法。測定之前，樣品均需經化學方法的前處理，經顯色，測定吸收度，方法比較麻煩。而維生素B1和維生素B2的含量測定方法則均為螢光分光光度法。螢光分析法遠不如高效液相色譜法普及，螢光法作為含量測定方法，因靈敏度較高，幹擾因素也多，如溶劑、測定液的澄清度、所用玻璃儀器及吸收池的潔淨度、包括溫度對螢光強度影響甚大。
綜上所述，目前對六維磷脂軟膠囊的含量測定方法，普遍存在著需要多種測定方法和儀器，對各組分分別進行測定。還未見簡單方便的六維磷脂軟膠囊的含量測定方法的報導，急需一種簡便易行的六維磷脂軟膠囊的含量測定方法。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法。本發明旨在使六維磷脂軟膠囊的鑑別與含量測定方法有較強的專屬性和可靠性，靈敏、準確、省時並可控。
為達到上述目的，本發明提出以下技術方案以高效液相色譜法(用PLC法)鑑別煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6和維生素E，並測定煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6和維生素E的含量。
在含量測定項下記錄的色譜圖中，煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6供試品各組分的主峰保留時間應分別與其對照品主峰的保留時間一致；並且在含量測定項下記錄的色譜圖中，維生素E供試品主峰的保留時間應與其對照品主峰的保留時間一致。
在測定煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量時，用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為容量比14∶6∶80的乙腈-甲醇-水，水中含0.0506％庚烷磺酸鈉和0.12％三乙胺，並用磷酸調節至pH2.5；檢測波長為273nm；煙醯胺、維生素B1、維生素B2和維生素B6的色譜峰之間的分離度大於1.5，理論板數按煙醯胺計算不低於1200。
測定維生素E的含量時，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為容量比97∶3的甲醇-水；檢測波長為280nm，理論板數按維生素E峰計算不低於3500。
具體測定時，測定時採用避光操作；取裝量差異項下的內容物適量，精密稱定後置於容器中，加甲醇適量溶解並稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液；另取對照品，按與供試品相同的製備方法，製得對照品溶液；精密量取對照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。
中國藥典標準中和肝利健標準中維生素E的含量測定方法為氣相色譜法。因為用高效液相色譜儀能夠同時檢測六維磷脂軟膠囊中5種成分(煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6和維生素E)的含量與鑑別，避免只為測定維生素E而購置氣相色譜儀造成資金浪費，所以，新的維生素E的含量測定方法也為高效液相色譜法。含量測定方法的方法學研究結果表明，本方法同氣相色譜法一樣簡便、靈敏，是可靠的檢測方法。
本發明無須專門進行鑑別試驗，利用含量測定時的高效液相色譜圖即可。即方便又準確，而且省時、節約。方法學研究數據證明了本發明具有專屬性，準確性高，可控性強。
具體實施例方式
儀器，試藥，樣品及對照品1.1儀器和試藥高效液相色譜儀 島津LC-10AT檢測器 島津SPD-10A控制器 島津Class-VP工作站色譜柱 ODSC18 5μm150×4.6mm乙腈、甲醇 均為色譜純三乙胺、庚烷磺酸鈉 均為分析純1.2原料大豆磷脂 本公司生產國家標準(地標升部標)煙醯胺北京第二製藥廠中國藥典2000年版維生素B1 華中製藥廠中國藥典2000年版維生素B2 上海新亞製藥廠中國藥典2000年版維生素B6 上海新亞製藥廠中國藥典2000年版維生素B12 廣東製藥廠中國藥典2000年版維生素E 河北製藥有限公司 中國藥典2000年版1.3樣品六維磷脂軟膠囊 由申請人自製1.4對照品煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6對照品 取原料多次精製而得(含量測定按中國藥典2000年版二部測定)煙醯胺 99.1％
維生素B199.5％維生素B2100.0％維生素B699.3％維生素E 由中檢所提供實施例1 煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6含量測定方法色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為重量比為14∶6∶80的乙腈-甲醇-水混合物，水中含0.0506％庚烷磺酸鈉和0.12％三乙胺，並用磷酸調PH值至2.5；檢測波長為273nm。煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的色譜峰之間分離度1.8，理論板數按煙醯胺計算為1200。
對照品溶液的配製 分別精密稱取煙醯胺約60mg、維生素B1約12mg、維生素B2約12mg、維生素B6約12mg，置於200ml量瓶中，加乙醇100ml，加熱溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置於50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為混合對照品溶液(每1ml中含煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6分別為30μg、6μg、6μg、6μg)，備用。
供試品溶液的製備 精密稱取裝量差異項下的內容物適量(約相當於煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6分別為30mg、6mg、6mg、6mg)，置於圓底燒瓶中，加乙醇約100ml，在水浴上加熱回流至內容物溶解，放冷至室溫，用流動相將溶液轉移至200ml量瓶中，並稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置於25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，高速離心，取上清液為供試品溶液。
測定法 精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。
流動相與檢測波長的選則 通過參考2000版中國藥典二部，有關文獻(1、《藥學進展》2003年第27卷第1期P44-47，作者王林、孫國慶、平其能；2、《中國公共衛生》1994年06期，作者王雅賢、李靜；3、《藥物分析雜誌》1995年05期，作者黃冠文、薛衛平、於志超)及相關試驗，最終選定上述色譜條件。在色譜圖中，當流速為0.7ml/min時，煙醯胺主峰的保留時間為3.6分鐘、維生素B1主峰的保留時間為8.9分鐘、維生素B2主峰的保留時間為10.4分鐘、維生素B6主峰的保留時間為5.2分鐘。在同一張色譜圖中，四種成分的出峰順序為煙醯胺，維生素B6，維生素B1，維生素B2。
專屬性按處方精密稱取空白樣品(除煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6外，輔料及所有成分)適量，按供試品溶液的製備項下製備空白對照溶液，按選定的色譜條件試驗。精密量取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。精密量取對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，所用輔料及大豆磷脂、維生素E均得到基線分離，而且不幹擾煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的測定，說明本試驗所採用含量測定方法的色譜條件具有良好的專屬性。
線性關係 精密稱取對照品煙醯胺97.12mg、維生素B118.14mg、維生素B218.80mg、維生素B619.42mg，置50ml量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0ml，分別置於25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。繪製以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標的標準曲線圖。以各組分峰面積與其相應的濃度進行回歸處理，求得回歸方程.試驗結果表明，在本試驗的色譜條件下，煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6在各自的濃度範圍內，濃度與其相對應的色譜峰面積呈有良好的線性關係，結果見表1。
表1 藥物濃度與峰面積的線性關係
重複性 取同一供試品溶液20μl，以上述色譜條件，重複進樣6次，記錄色譜圖。分別測定煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的峰面積，其相對標準偏差(RSD)％分別為0.16％，0.21％，0.20％，0.24％，結果見表2。
表2 煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6重複性測定結果
穩定性 取混合對照品溶液20μl，按上述色譜條件，分別於0小時、1小時、4小時、8小時、12小時進樣1次，測定其峰面積，記錄色譜圖。結果表明12小時內測定值基本穩定。見表3。
表3 煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6穩定性測定結果
耐用性 為了考查本測定方法的耐用性，選用同類柱不同廠牌的C18色譜柱(蘭州化物所ODS柱與迪馬公司鑽石柱)，對同一樣品(批號030819)進行測定，考查其理論板數、分離度、重複性、拖尾因子等能否通過系統適用性試驗要求。試驗結果(表4)表明，色譜條件稍有變動，仍能夠滿足系統適用性試驗要求，確保了測定方法的有效性。
表4 煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6耐用性試驗中重複性測定結果
中間精密度 取樣品(批號030819)適量，攪拌均勻，各精密稱取6份樣品，以不同試驗者，在不同日期，用同一臺高效液相色譜儀，按規定的含量測定方法進行檢測。試驗結果(表5)表明，隨機變動因素(試驗者、日期)對測定結果的精密度影響甚小。
表5 中間精密度測試結果
回收率 按處方比例配製三個空白樣品(包括輔料，大豆磷脂，維生素E及維生素B12)，煙醯胺按標示量的80％，100％，120％分別加入，維生素B1、維生素B2、維生素B6按標示量的70％，100％，130％分別加入，製成低，中，高三種含量的樣品。每種樣品各取3份平行樣，精密稱定，每份取約相當於1粒量，按含量測定方法操作，分別測定其回收率。結果見表6，表7，表8，表9。試驗結果表明，在本試驗採用的色譜條件條件下，煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的回收率良好。
表6 煙醯胺的回收率測定結果
表7 維生素B1的回收率測定結果
表8 維生素B2的回收率測定結果
表9 維生素B6的回收率測定結果
兩種含量測定方法的比對精密稱取同一批樣品，各取6份，分別用修訂前後的含量測定方法進行測定，結果見表10，表11，表12，表13。
表10 兩種方法測定煙醯胺含量的比對結果
表11 兩種方法測定維生素B1含量的比對結果
表12 兩種方法測定維生素B2含量的比對結果
表13 兩種方法測定維生素B6含量的比對結果
六維磷脂軟膠囊中，煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量測定 取裝量差異項下的內容物適量(約相當於煙醯胺30mg、維生素B16mg、維生素B26mg、維生素B66mg)，精密稱定，置於圓底燒瓶中，加乙醇約100ml，在水浴上加熱回流至內容物溶解，放冷至室溫，用流動相將溶液轉移至200ml量瓶中，並稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，高速離心，取上清液作為供試品溶液。另取煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6對照品60mg、12mg、12mg、12mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加乙醇100ml，加熱溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml中含煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6分別為30μg、6μg、6μg、6μg的混合對照品溶液)。精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，結果見表14～17。
表14 六維磷脂軟膠囊中煙醯胺的含量測定結果
表15 六維磷脂軟膠囊中維生素B1的含量測定結果
表16 六維磷脂軟膠囊中維生素B2的含量測定結果
表17 六維磷脂軟膠囊中維生素B6的含量測定結果
實施例2 維生素E的含量測定方法色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；重量比為97∶3的甲醇-水混合物為流動相；檢測波長為280nm，理論板數按維生素E峰計算為3500。
對照品溶液的配製 避光操作。精密稱取維生素E對照品適量，加甲醇適量溶解並稀釋製成每1ml中含維生素E 0.48mg的溶液，作為對照品溶液。
供試品溶液的製備 避光操作。取裝量差異項下的內容物適量(約相當於維生素E 12mg)，精密稱定，置於25ml量瓶中，加甲醇適量溶解並稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。
測定法 避光操作。分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。
流動相與檢測波長的選則 通過參考2000版中國藥典，有關文獻及相關試驗，最終選定上述色譜條件。當流速為1ml/min時，維生素E主峰的保留時間為18.3分鐘。
專屬性 按處方精密稱取空白輔料(除維生素E外，所有成分和輔料)適量，加甲醇製備空白對照溶液，按選定的色譜條件試驗。精密量取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。精密量取維生素E對照品溶液20μl(0.473mg/ml)，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，在本色譜條件下，所用輔料及大豆磷脂、煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12均得到基線分離，不幹擾維生素E的測定，說明本試驗所採用含量測定方法的色譜條件具有良好的專屬性。
線性關係 精密稱取維生素E對照品26.83mg，置於25ml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液0.6、1.25、2.5、5.0ml分別置於10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液和貯備液20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。繪製以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標的標準曲線。結果表明維生素E濃度在64.4μg～1073μg/ml範圍內與峰面積呈良好的線性關係。回歸方程為A＝5585C+27720r＝1.000取同一供試品溶液20μl，以上述色譜條件，重複進樣6次，記錄色譜圖，測定維生素E的峰面積。相對標準偏差(RSD％)為0.17％。結果見表18。
表18 維生素E重複性測定結果
穩定性 取維生素E對照品溶液20μl，以上述色譜條件分別於0h、0.5h、1h、3h、6h各進樣1次，記錄色譜圖，測定其峰面積。結果表明6小時內測定值比較穩定。結果見表19。
表19 維生素E穩定性測定結果
耐用性 為了考查本測定方法的耐用性，選用同類柱不同廠牌的C18色譜柱(蘭州化物所ODS柱與迪馬公司鑽石柱)對同一樣品(批號030819)進行測定，考查其理論板數、分離度、重複性、拖尾因子等能否通過系統適用性試驗要求。試驗結果(表20)表明，色譜條件稍有變動，仍能夠滿足系統適用性試驗要求，確保了測定方法的有效性。
表20 維生素E耐用性試驗中重複性測定結果
中間精密度 取樣品(批號030819)適量，攪拌均勻，各精密量取6份樣品，以不同試驗者，在不同日期，用同一臺高效液相色譜儀，按規定的含量測定方法進行檢測。試驗結果(見表21)表明，隨機變動因素(試驗者、日期)對測定結果的精密度影響甚小。
表21 維生素E中間精密度測試結果
回收率 按處方量配製三個空白樣品(包括輔料，大豆磷脂，煙醯胺、維生素B1，維生素B2，維生素B6，維生素B12)，維生素E對照品按標示量的70％、100％、130％分別加入，每個樣品各取三份平行樣，加甲醇適量溶解並稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，精密量取20μl，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，維生素E的平均回收率為100.03％(RSD 0.44％)。結果見表22。結果表明，在本試驗採用含量測定的色譜條件下，維生素E含量測定的方法的回收率良好。
表22 維生素E的回收率測定結果
兩種含量測定方法的比對 精密稱取同一批樣品，各取6份，分別用修訂前後的含量測定方法(GC法HPLC法)進行測定，結果見表23。
表23 兩種方法測定維生素B6含量的比對結果
六維磷脂軟膠囊中維生素E的含量測定避光操作。取裝量差異項下的內容物適量(約相當於維生素E12mg)，精密稱定，置於25ml量瓶中，加甲醇適量溶解並稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。另取維生素E對照品適量，加甲醇製成每1ml中含維生素E約0.48mg的溶液，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。結果見表24。
表24 六維磷脂軟膠囊中維生素E的含量測定結果
以上對本發明所提供的六維磷脂軟膠囊的含量測定方法進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對於本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在具體實施方式
及應用範圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
權利要求
1.一種六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法，其特徵在於以高效液相色譜法鑑別煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6和維生素E，並測定煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6和維生素E的含量。
2.如權利要求1所述的六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法，其特徵在於在含量測定項下記錄的色譜圖中，煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6供試品各組分的主峰保留時間應分別與其對照品主峰的保留時間一致；並且在含量測定項下記錄的色譜圖中，維生素E供試品主峰的保留時間應與其對照品主峰的保留時間一致。
3.如權利要求1所述的六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法，其特徵在於測定煙醯胺、維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量時，用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為容量比14∶6∶80的乙腈-甲醇-水，水中含0.0506％庚烷磺酸鈉和0.12％三乙胺，並用磷酸調節至pH2.5；檢測波長為273nm；煙醯胺、維生素B1、維生素B2和維生素B6的色譜峰之間的分離度大於1.5，理論板數按煙醯胺計算不低於1200。
4.如權利要求1所述的六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法，其特徵在於測定維生素E的含量時，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為容量比97∶3的甲醇-水；檢測波長為280nm，理論板數按維生素E峰計算不低於3500。
5.如權利要求1所述的六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法，其特徵在於測定時採用避光操作；取裝量差異項下的內容物適量，精密稱定後置於容器中，加甲醇適量溶解並稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液；另取對照品，按與供試品相同的製備方法，製得對照品溶液；精密量取對照品溶液和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。
全文摘要
本發明公開了一種六維磷脂軟膠囊的鑑別和含量測定方法。以高效液相色譜法鑑別煙醯胺、維生素B
文檔編號G01N30/86GK1808115SQ200510097538
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者周有財 申請人:黑龍江澳利達奈德製藥有限公司