土豆磷酸化酶的分離提取方法
2023-06-05 05:58:26
專利名稱：土豆磷酸化酶的分離提取方法
技術領域：
本發明涉及一種磷酸化酶的分離提取方法，特別是指一種土豆磷酸化酶(E.C.2.4.1.1)的分離提取方法。
背景技術：
多糖如同蛋白質和核酸一樣，在生命活動中起著重要作用。但是多糖的合成遠比蛋白質和核酸複雜，這是由其較為複雜的結構所決定的。最近研究發現，通過酶促反應合成多糖是一個新的發展方向。由於酶具有專一性和酶促反應步驟簡單的優點，該方法已被應用於合成多種複雜的多糖。這將有利於進一步研究多糖結構與其生物活性之間的關係，促進多糖在醫藥業和農業上等領域的應用。
相關研究表明，土豆磷酸化酶(E.C.2.4.1.1)可應用於合成結構可控的直鏈澱粉多糖。但目前尚未見有關直接從土豆中分離提取土豆磷酸化酶的研究工作和相關技術報導，更未見工業化生產土豆磷酸化酶。
發明內容
為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的目的在於提供一種工藝簡便、比活力高的土豆磷酸化酶的分離提取方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種土豆磷酸化酶的分離提取方法，包括如下步驟(1)將450～800克土豆去皮、切塊，攪碎成土豆汁；在土豆汁中加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.1～0.3克/升；高速冷凍離心土豆汁，除去白色沉澱物A即土豆澱粉，調節上層離心清液I的pH至6.0～8.0。
(2)加熱離心清液I至50～70℃，恆溫攪拌30～90分鐘，高速冷凍離心，除去白色沉澱物B即失活的澱粉酶，得到離心清液II。
(3)在離心清液II中加入硫酸銨溶液，調節溶液密度至1.05～1.10克/毫升，於0～4℃靜置2～6小時後，高速冷凍離心，除去白色沉澱物C即雜蛋白，得到離心清液III。
(4)在離心清液III中加入硫酸銨溶液，調節溶液密度至1.15～1.25克/毫升，於0～4℃靜置6～12小時後，高速冷凍離心，收集白色沉澱物D即為粗土豆磷酸化酶。
(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶溶於15～25毫升緩衝溶液中，高速冷凍離心，除去不溶性雜質，製得土豆磷酸化酶液。
本發明製得的土豆磷酸化酶液經磷鉬藍吸光光度法(波長為860nm，如圖2所示)和蛋白質紫外吸收法(波長為280nm，如圖3所示)檢測，可計算出其比活力，於冰箱中0～4℃低溫保存，活性可保持2個月。
為了更好地實現本發明，所述步驟(1)～步驟(5)中高速冷凍離心條件溫度為2～6℃，轉速為10000～20000轉/分，時間為10～50分鐘。
所述步驟(1)中的亞硫酸鈉的作用是抑制酚氧化酶產生的變色反應，其在土豆汁混合溶液中的濃度為0.1～0.3克/升。
所述步驟(1)中的上層離心清液I的pH值採用濃氨水、碳酸鈉溶液或氫氧化鈉溶液等調節。
所述步驟(5)中的緩衝溶液的pH為6.5～7.6，特別優選的緩衝溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液或者硼酸-硼砂緩衝液。
本發明的原理是採用硫酸銨分級鹽析法，從土豆中分離出土豆磷酸化酶。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明通過硫酸銨分級鹽析法直接從新鮮土豆中提取具有較高比活力的土豆磷酸化酶。本發明的操作步驟主要為高速冷凍離心，本發明工藝簡單，操作方便，易於實施，造價低廉，易於從土豆中分離純化製得具有較高比活力的土豆磷酸化酶。本發明提取出的土豆磷酸化酶可以用於高效合成結構可控的直鏈澱粉多糖。本發明製備的土豆磷酸化酶可廣泛應用於醫藥、食品、保健、生物、農業等領域。
圖1是本發明分離提取土豆磷酸化酶的工藝流程圖。
圖2是磷鉬藍的吸收曲線。
圖3是蛋白質的紫外吸收曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1如圖1所示，土豆磷酸化酶的分離提取方法，包括如下步驟(1)稱取洗淨的新鮮土豆約450克，去皮，切塊，置於飛利浦機械榨汁機(HR2826型)中榨汁3分鐘。向土豆汁加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.2克/升，2℃高速冷凍離心(15000轉/分，20分鐘)，除去白色沉澱物A(土豆澱粉)，滴加濃氨水溶液調節上層離心清液I的pH至6.0。
(2)加熱離心清液I至50℃，恆溫低速(250rpm)攪拌30分鐘，2℃高速冷凍離心(15000轉/分，20分鐘)，除去白色沉澱物B(失活的澱粉酶)，得到離心清液II。
(3)在離心清液II中加入濃度為400克/升的硫酸銨溶液，調節離心清液II密度至1.05克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置6小時後，2℃高速冷凍離心(15000轉/分，20分鐘)，除去白色沉澱物C(雜蛋白)，得到離心清液III。
(4)在離心清液III中加入400克/升硫酸銨溶液，調節離心清液III密度至1.20克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置7小時後，4℃高速冷凍離心2℃高速冷凍離心(15000轉/分，20分鐘)，收集白色沉澱物D(粗土豆磷酸化酶)。
(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶沉澱溶於15毫升磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液中(pH＝6.5)，2℃高速冷凍離心(15000轉/分，20分鐘)，除去不溶性雜質。製得的土豆磷酸化酶液經磷鉬藍吸光光度法(波長為860nm)和蛋白質紫外吸收法(波長為280nm)檢測，計算出其比活力為0.167unit/mg，於冰箱中0～4℃低溫保存，活性可保持2個月。
實施例2(1)稱取洗淨的新鮮土豆約600克，去皮，切塊，置於飛利浦機械榨汁機(HR2826型)中榨汁5分鐘。向土豆汁加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.1克/升，4℃高速冷凍離心(12000轉/分，30分鐘)，除去白色沉澱物A(土豆澱粉)，滴加碳酸鈉溶液調節上層離心清液I的pH至7.0。
(2)加熱離心清液I至55℃，恆溫低速(250rpm)攪拌45分鐘，4℃高速冷凍離心(12000轉/分，30分鐘)，除去白色沉澱物B(失活的澱粉酶)，得到離心清液II。
(3)在離心清液II中加入濃度為400克/升的硫酸銨溶液，調節離心清液II密度至1.08克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置4小時後，4℃高速冷凍離心(12000轉/分，30分鐘)，除去白色沉澱物C(雜蛋白)，得到離心清液III。
(4)在離心清液III中加入400克/升硫酸銨溶液，調節離心清液III密度至1.15克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置12小時後，4℃高速冷凍離心(12000轉/分，30分鐘)，收集白色沉澱物D(粗土豆磷酸化酶)。
(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶沉澱溶於18.5毫升Tris-鹽酸緩衝溶液中(pH＝7.1)，4℃高速冷凍離心(12000轉/分，30分鐘)，除去不溶性雜質。製得的土豆磷酸化酶液經磷鉬藍吸光光度法(波長為860nm)和蛋白質紫外吸收法(波長為280nm)檢測，計算出其比活力為0.153unit/mg，於冰箱中0～4℃低溫保存，活性可保持2個月。
實施例3(1)稱取洗淨的新鮮土豆約800克，去皮，切塊，置於飛利浦機械榨汁機(HR2826型)中榨汁7分鐘。向土豆汁加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.3克/升，5℃高速冷凍離心(18000轉/分，40分鐘)，除去白色沉澱物A(土豆澱粉)，滴加氫氧化鈉溶液調節上層離心清液I的pH至6.5。
(2)加熱離心清液I至65℃，恆溫低速(250rpm)攪拌80分鐘，5℃高速冷凍離心(18000轉/分，40分鐘)，除去白色沉澱物B(失活的澱粉酶)，得到離心清液II。
(3)在離心清液II中加入濃度為400克/升的硫酸銨溶液，調節離心清液II密度至1.10克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置2小時後，5℃高速冷凍離心(18000轉/分，40分鐘)，除去白色沉澱物C(雜蛋白)，得到離心清液III。
(4)在離心清液III中加入400克/升硫酸銨溶液，調節離心清液III密度至1.18克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置10小時後，5℃高速冷凍離心(18000轉/分，40分鐘)，收集白色沉澱物D(粗土豆磷酸化酶)。
(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶沉澱溶於25毫升硼酸-硼砂緩衝溶液中(pH＝7.4)，5℃高速冷凍離心(18000轉/分，40分鐘)，除去不溶性雜質。製得的土豆磷酸化酶液經磷鉬藍吸光光度法(波長為860nm)和蛋白質紫外吸收法(波長為280nm)檢測，計算出其比活力為0.171unit/mg，於冰箱中0～4℃低溫保存，活性可保持2個月。
實施例4(1)稱取洗淨的新鮮土豆約700克，去皮，切塊，置於飛利浦機械榨汁機(HR2826型)中榨汁6分鐘。向土豆汁加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.1克/升，6℃高速冷凍離心(20000轉/分，10分鐘)，除去白色沉澱物A(土豆澱粉)，滴加碳酸鈉溶液調節上層離心清液I的pH至7.5。
(2)加熱離心清液I至70℃，恆溫低速(250rpm)攪拌90分鐘，6℃高速冷凍離心(20000轉/分，10分鐘)，除去白色沉澱物B(失活的澱粉酶)，得到離心清液II。
(3)在離心清液II中加入濃度為400克/升的硫酸銨溶液，調節離心清液II密度至1.05克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置5小時後，6℃高速冷凍離心(20000轉/分，10分鐘)，除去白色沉澱物C(雜蛋白)，得到離心清液III。
(4)在離心清液III中加入400克/升硫酸銨溶液，調節離心清液III密度至1.15克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置6小時後，6℃高速冷凍離心(20000轉/分，10分鐘)，收集白色沉澱物D(粗土豆磷酸化酶)。
(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶沉澱溶於18.5毫升巴比妥鈉-鹽酸緩衝溶液中(pH＝7.6)，6℃高速冷凍離心(20000轉/分，10分鐘)，除去不溶性雜質。製得的土豆磷酸化酶液經磷鉬藍吸光光度法(波長為860nm)和蛋白質紫外吸收法(波長為280nm)檢測，計算出其比活力為0.153unit/mg，於冰箱中0～4℃低溫保存，活性可保持2個月。
實施例5(1)稱取洗淨的新鮮土豆約800克，去皮，切塊，置於飛利浦機械榨汁機(HR2826型)中榨汁7分鐘。向土豆汁加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.3克/升，3℃高速冷凍離心(10000轉/分，50分鐘)，除去白色沉澱物A(土豆澱粉)，滴加濃氨水溶液調節上層離心清液I的pH至8.0。
(2)加熱離心清液I至65℃，恆溫低速(250rpm)攪拌80分鐘，3℃高速冷凍離心(10000轉/分，50分鐘)，除去白色沉澱物B(失活的澱粉酶)，得到離心清液II。
(3)在離心清液II中加入濃度為400克/升的硫酸銨溶液，調節離心清液II密度至1.10克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置3小時後，3℃高速冷凍離心(10000轉/分，50分鐘)，除去白色沉澱物C(雜蛋白)，得到離心清液III。
(4)在離心清液III中加入400克/升硫酸銨溶液，調節離心清液III密度至1.25克/毫升，於冰箱中0～4℃靜置9小時後，3℃高速冷凍離心(10000轉/分，50分鐘)，收集白色沉澱物D(粗土豆磷酸化酶)。
(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶沉澱溶於25毫升磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝溶液中(pH＝7.2)，3℃高速冷凍離心(10000轉/分，50分鐘)，除去不溶性雜質。製得的土豆磷酸化酶液經磷鉬藍吸光光度法(波長為860nm)和蛋白質紫外吸收法(波長為280nm)檢測，計算出其比活力為0.171unit/mg，於冰箱中0～4℃低溫保存，活性可保持2個月。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種土豆磷酸化酶的分離提取方法，其特徵在於包括如下步驟(1)將450～800克土豆去皮、切塊，攪碎成土豆汁；在土豆汁中加入亞硫酸鈉溶液，使土豆汁混合溶液中亞硫酸鈉的濃度為0.1～0.3克/升；高速冷凍離心土豆汁，除去白色沉澱物A即土豆澱粉，調節上層離心清液I的pH至6.0～8.0；(2)加熱離心清液I至50～70℃，恆溫攪拌30～90分鐘，高速冷凍離心，除去白色沉澱物B即失活的澱粉酶，得到離心清液II；(3)在離心清液II中加入硫酸銨溶液，調節溶液密度至1.05～1.10克/毫升，於0～4℃靜置2～6小時後，高速冷凍離心，除去白色沉澱物C即雜蛋白，得到離心清液III；(4)在離心清液III中加入硫酸銨溶液，調節溶液密度至1.15～1.25克/毫升，於0～4℃靜置6～12小時後，高速冷凍離心，收集白色沉澱物D即粗土豆磷酸化酶；(5)將步驟(4)收集的粗土豆磷酸化酶溶於15～25毫升緩衝溶液中，高速冷凍離心，除去不溶性雜質，製得土豆磷酸化酶液。
2.根據權利要求1所述的土豆磷酸化酶的分離提取方法，其特徵在於所述高速冷凍離心條件溫度為2～6℃，轉速為10000～20000轉/分，時間為10～50分鐘。
3.根據權利要求1所述的土豆磷酸化酶的分離提取方法，其特徵在於所述步驟(1)中的上層離心清液I的pH值採用濃氨水、碳酸鈉溶液或氫氧化鈉溶液調節。
4.根據權利要求1所述的土豆磷酸化酶的分離提取方法，其特徵在於所述步驟(5)中的緩衝溶液的pH為6.5～7.6。
5.根據權利要求1所述的土豆磷酸化酶的分離提取方法，其特徵在於所述步驟(5)中的緩衝溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液或者硼酸-硼砂緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種土豆磷酸化酶的分離提取方法，該方法以土豆為原料，通過硫酸銨分級鹽析法提取具有較高比活力的土豆磷酸化酶。本發明的方法工藝簡單，操作方便，造價低廉，易於從土豆中分離純化製得具有較高比活力的土豆磷酸化酶。該土豆磷酸化酶可以用於高效合成結構可控的直鏈澱粉多糖。本發明製備的土豆磷酸化酶可廣泛應用於醫藥、食品、保健、生物、農業等領域。
文檔編號C12N9/12GK101050454SQ20071002717
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月16日 優先權日2007年3月16日
發明者楊立群, 孔韜, 梁秋儀, 張黎明 申請人:中山大學