食品中河弧菌的pcr檢測方法

2023-06-04 23:34:26

專利名稱：食品中河弧菌的pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種食品中河弧菌的PCR檢測方法。
背景技術：
目前，國內關於致病性弧菌的檢測方法還是傳統的微生物學檢測方法，尚不夠完善，每種檢測方法僅能檢測一種致病性弧菌，而國外的傳統微生物學檢測方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以單一或少數目標菌為目的設計的程序。因此，幾乎每檢測一種致病性弧菌都需配製不同的培養基和試劑，耗時又耗力。在分子生物學檢測方法方面，FDA2004標準仍是以檢測一種致病性弧菌為目的設計PCR程序，檢測不同的弧菌需要不同的反應條件。國內的檢測人員設計PCR檢測方法時也是以毒力基因為待擴增序列，而且關注的大都是O1型和O139型霍亂弧菌與副溶血弧菌，PCR方法檢測創傷弧菌的報導只有2000年有過1例，擬態弧菌、溶藻弧菌和河弧菌至今仍未見到過。

發明內容
本發明提供了一種食品中河弧菌的PCR檢測方法，在不影響檢出率的條件下，較以往傳統檢測方法的檢測速度更快，而且減少了工作量和檢測成本。
本發明所提供的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌後，採用水煮法提取弧菌基因組DNA，然後經PCR反應後，再經電泳、染色、漂洗，最後用凝膠成像儀觀察結果並拍照，最後經過譜圖分析即可得出檢測結果。
本發明所提供的食品中河弧菌的PCR檢測方法，採用河弧菌的溶血素基因(AF348455)為目的基因檢測河弧菌，其優點在於在不影響檢出率的條件下，較以往傳統檢測方法的檢測速度更快，而且減少了工作量和檢測成本。


圖1為本發明的流程圖。
圖2為本發明的引物序列表圖。
圖3為本發明的V.fl PCR檢測結果示意圖。
圖4為本發明實施例的V.fl PCR檢測結果圖。
其中，圖3中，1Marker(100bp-1000bp)；2-5河弧菌產生的446bp的條帶；6少於10cfu/ml的河弧菌沒有產生條帶；7-8無河弧菌；9陰性對照。
圖4中，1100bp Marker，2河弧菌，3、4麵包蝦，5、6文蛤，7陰性對照。
具體實施例方式
本發明所提供的一種食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌後，採用水煮法提取弧菌基因組DNA，然後經PCR反應後，再經電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結果並拍照，最後經過譜圖分析即可得出檢測結果。
所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl鹼性蛋白腖水的滅菌容器內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl鹼性蛋白腖水(APW)的滅菌試管內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h。
所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為取培養的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然後加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉澱，振蕩混勻後，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環境下儲存備用。
所述的PCR反應，其反應體系為H2O14.6μl，Buffer2.0μl，DNTP0.4μl，P(0.4*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl。其反應循環參數為94℃預變性3min；然後94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復性1min循環35次，最後72℃延伸7min。
所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為PCR反應結束後以98V電壓2.5％凝膠電泳90min。
所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min。
所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對於譜圖中是否有相應特徵位置條帶的出現，即可判別被檢測對象中是否有河弧菌的存在。
以下結合具體實施例子說明實施例一麵包蝦的檢測1.無菌操作，取25g麵包蝦樣品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl鹼性蛋白腖水(APW)的滅菌容器內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl鹼性蛋白腖水(APW)的滅菌試管內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
3.移液槍吸取1.5ml培養的菌液，加入1.5ml離心管中13000rpm離心1min，棄上清。
4.加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉澱，振蕩混勻，100℃水浴10min。
5.12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃備用。
6.加樣，做PCR7.取10μl PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖實施例二文蛤的檢測1.無菌操作，取25g文蛤樣品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl鹼性蛋白腖水(APW)的滅菌容器內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl鹼性蛋白腖水(APW)的滅菌試管內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
3.移液槍吸取1.5ml培養的菌液，加入1.5ml離心管中13000rpm離心1min，棄上清。
4.加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉澱，振蕩混勻，100℃水浴10min。
5.12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃備用。
6.加樣，做PCR7.取10μl PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖針對上述兩個實施例的譜圖分析根據圖4可見，四份樣品均無河弧菌的特徵條帶出現，由此可見，四份樣品全部不含河弧菌。
權利要求
1.一種食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌後，採用水煮法提取弧菌基因組DNA，然後經PCR反應後，再經電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結果並拍照，最後經過譜圖分析即可得出檢測結果。
2.根據權利要求1所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl鹼性蛋白腖水的滅菌容器內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl鹼性蛋白腖水(APW)的滅菌試管內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h。
3.根據權利要求1所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為取培養的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然後加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉澱，振蕩混勻後，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環境下儲存備用。
4.根據權利要求4所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的PCR反應，其反應體系為H2O14.6μl，Buffer2.0μl，DNTP0.4μl，P(0.4*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl。
5.根據權利要求4所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的PCR反應循環參數為94℃預變性3min；然後94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復性1min循環35次，最後72℃延伸7min。
6.根據權利要求1所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為PCR反應結束後以98V電壓2.5％凝膠電泳90min。
7.根據權利要求1所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min。
8.根據權利要求1所述的食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對於譜圖中是否有相應特徵位置條帶的出現，即可判別被檢測對象中是否有河弧菌的存在。
全文摘要
一種食品中河弧菌的PCR檢測方法，其特徵在於其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌後，採用水煮法提取弧菌基因組DNA，然後經PCR反應後，再經電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結果並拍照，最後經過譜圖分析即可得出檢測結果。本發明所提供的食品中河弧菌的PCR檢測方法，採用河弧菌的溶血素基因(AF348455)為目的基因檢測河弧菌，其優點在於在不影響檢出率的條件下，較以往傳統檢測方法的檢測速度更快，而且減少了工作量和檢測成本。
文檔編號G01N21/84GK1967236SQ20061006856
公開日2007年5月23日 申請日期2006年8月26日 優先權日2006年8月26日
發明者黃曉蓉, 鄭晶, 陳彬, 呂海滄 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心