由人體體表角質生長物測定體內甾體激素及其衍生物含量的檢測方法

2023-06-05 11:57:26

專利名稱：：由人體體表角質生長物測定體內甾體激素及其衍生物含量的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種由人體體表的毛髮、指甲或趾甲等角質生長物測定體內甾體激素及其衍生物含量的檢測方法。甾體激素是人體內分泌激素中的主要組成部分之一，不僅對正常的新陳代謝和生理功能有重要和巨大的影響，而且體內不同種類的甾體激素含量水平的變化也常可預示和反映身體的不同生理狀況，因而對其在體內含量水平的檢測常用於醫學診斷和其它有關領域的分析判斷。例如，對雌二醇、孕酮等生殖激素的檢測，在女性的生理變化或疾病診斷中是一個重要的檢測項目和判斷依據；在體育比賽的興奮劑檢測中，對運動員體內的雄性激素等甾體激素或其衍生物含量的檢測也是用於判斷的重要依據。此外，對體內多種腎上腺皮質類的甾體激素或其衍生物含量的檢測在醫學診斷和治療上也常具有十分重要的意義和價值。目前臨床上檢測人體內甾體激素含量的方法都是通過對人體的血液、唾液、尿液、精液或組織等採樣後才能進行檢測，其中大多數又都是依賴抽取血樣進行的。這些方法，特別是抽取血樣的方法，許多缺點是十分明顯的。首先，被採樣者必須到醫院或有相應條件的地點才能取血，血液的抽取量不能太大，並還容易因此傳播或被傳染上疾病，因而許多人不易接受。其次，血液樣品的處理過程麻煩，易被汙染，且必須在冰箱中保存，又不宜長途運輸。而在對以雄性激素或其衍生物為主的興奮劑檢測時，長期以來一直使用對採集的尿液樣品進行檢測的方法。而尿液的採集也有許多困難，且尿液的處理也十分麻煩，檢測儀器又非常昂貴，但最大的問題還是興奮劑的服用者可以採取一些方法避開對其真實尿液的興奮劑檢測。因此，在興奮劑的檢測上目前也已有越來越多的呼籲以血液檢測代替尿液檢測，但隨血液檢測而來所不可避免的上述諸多缺點，必然又會成為無法迴避和要解決的問題。本發明的目的是為解決上述問題而提供一種新的人體內甾體激素及其衍生物含量水平的檢測方法，它是通過對人體的體表角質生長物為採樣樣品進行檢測，從而克服和進免了目前以體液，特別是以血液為樣品進行檢測的諸多缺點和問題。本發明的體內甾體激素及其衍生物含量的檢測方法，是以人體的頭髮、鬍鬚、指甲或趾甲等體表的角質生長物為採樣的樣品，其中特別以人的頭髮為採樣樣品最方便和有實際應用價值。測定方法按下述步驟操作1)取人體體表的角質生長物粉碎，例如，可剪切成細碎小段或碎末後，用可溶解被檢測的甾體激素或其衍生物成分的有機溶劑浸泡，充分萃取至少一次，一般可為兩次，然後將全部萃取液揮盡溶劑，得到萃取提取物；2)將上步得到的萃取提取物置於pH7.2-7.4的磷酸緩衝液中，於相當於人體體溫的溫度，即35-39℃放置25-35分鐘後，再於室溫至少混旋1分鐘；3)用常規的放射免疫方法或酶免疫方法測定上步混旋液中被測的甾體激素或其衍生物的含量。上述方法中所說萃取用的有機溶劑最好為沸點低於100℃的低沸點類溶劑，以便萃取後揮除或回收萃取溶劑的操作。例如可以使用常規的甲醇、乙醇、乙醚、丙酮等低沸點的含氧溶劑，也可以使用沸程為30-60℃的石油醚等非極性溶劑。其中尤以使用乙醚作為萃取溶劑為佳，萃取效果好，沸點低，易於揮除和回收，後處理方便，且價廉易得。本專利申請的發明以採集人頭髮樣品為例，按下述方法進行處理，提取不同的甾體激素，進行了檢測和有關的分析研究。將人的頭髮剪切成細碎次段後，用乙醚(或沸程為30-60℃的石油醚)作萃取溶劑，按每25-50毫克頭髮樣品用溶劑約2毫升的比例混旋至少1分鐘後，放置1小時以上，分離出萃取液後，再按上述一半的比例加入同種溶劑重複上述的萃取操作1-2次。合併各次萃取液自然揮盡或水浴加熱揮盡溶劑後，得到萃取提取物。將磷酸二氧鈉-磷酸氧二鈉組成的pH7.2-7.4的磷酸緩衝液0.2-0.3毫升加入到該萃取提取物中混旋並置於35-39℃，通常最好可在37±0.5℃的水浴中約30分鐘後取出，在室溫下再混旋約1分鐘，即成為供檢測用的備用品。採用與對人血清(或血漿)甾體激素檢測相同的放射免疫方法(RIA)或酶免疫方法(EIA)等常規檢測方法，或者世界衛生組織(WHO)規定的放射免疫方法或酶免疫方法，對上述檢測備用品中的有關甾體激素進行檢測。以採用125碘標記的RIA檢測方法為例，對上述人發樣品中所含的甾體類生殖激素的含量變化情況及影響因素進行了檢測和進一步的深入研究。將樣本數n＝17例在24小時內未用任何洗髮劑洗過的女性頭髮樣品分別取樣後，分為直接檢測、分別用市售的中日合資上海花王有限公司生產的「花王牌洗髮劑」和「詩芬牌洗髮劑」洗過的三種被檢測試樣樣品，並又均將其按發尖部、發中段和髮根部三部分分別檢測，以考察頭髮不同部位中的雌二醇(E2)和孕酮(P)兩種甾體激素的分布差異，以及洗髮劑對其在頭髮中含量的影響。實驗結果分別如表1和表2所示。表1和表2的實驗數據清楚顯示出，在頭髮的不同部位間，E2和P兩種甾體激素的含量，以及洗髮劑對頭髮不同部位中該兩種激素含量變化的影響，以表1所列各數據間的差異為大。對表1中「三種頭髮狀況分部位的E2量平均值」的數據中的最大差異值(42.8與47.1)經統計學的處理，t＝0.90，0.677(t＜1.291，故0.50＞p＞0.20，表明其最大差異組間已無顯著性差異。由此可知，其它各組數據間顯然也更無顯著性差異了。這既說明了人體內的甾體激素在人的頭髮中是普遍存在的，且其在頭髮中的存在和分布可不受頭髮的根、中、梢等採樣部位差異的影響，也表明了其含量不會因是否用洗髮劑清洗等外部處理因素的影響而改變，具有相對的穩定性，因而使本發明的方法具有了可實際應用的基礎和價值。同時，這一實驗所表明的另一方面的重要的意義和價值還在於如果某一洗髮劑或化裝品對頭髮或其它使用部位的體表角質生長物的甾體激素檢測產生較大或是嚴重的影響，則至少可以作為表明該洗髮劑或化裝品很可能是不適合於人體使用的重要依據。分別將不同樣本數的男性和女性的頭髮樣品與血液樣品中的同種激素的含量進行檢測，並進行統計學處理，作其相關性研究。結果表明，此二者間存在有明顯的相關性。有關相關性的實驗和統計結果數據參見表3。將樣本數n＝37例的女性在其正常月經周期中的卵泡期(月經第7-10天)、排卵期(月經第14天)和黃體期(月經第20-24天)三個生理階段中分別取頭髮樣品進行檢測，以考察頭髮中的甾體激素含量與人體生理狀況變化間的規律關係。檢測得其中雌二醇的平均含量分別為22.8、21.8和25.6(pg/g)。此含量變化規律與L.特雷格在其所著的《類固醇激素》(科學出版社，1980)中記載的女性雌二醇激素的血漿水平與性周期關係研究結果中所表述的變化規律是完全吻合的。除以上述的頭髮樣品進行實驗外，以人的指甲為檢測樣品，同樣進行了甾體激素含量的檢驗實驗。將取自女性的指甲樣品粉碎後，用上述相同的處理方法得到待測的混旋液後，檢測到其中雌二醇的含量為102pg/g，孕酮的含量為5.9ng/g。表明除頭髮外，人體體表的其它角質生長物同樣也含有可以利用並具有檢測意義和價值的甾體激素。除上述激素外，對人體內的其它甾體激素的檢測也同樣是可行的。例如，分別對n＝7例的男性和n＝7例女性的進行檢測發現，其每50毫克毛髮中皮質醇激素的平均含量均為9ng。這些實驗結果已充分表明，無論男性還是女性，甾體激素不僅在頭髮中均穩定存在，而且其含量及變化與其在血液中的存在狀況具有顯著的相關性。即，對其在頭髮中含量的檢測與對其在血液中含量的檢測是具有同等的意義和價值的。以放射免疫方法對上述有關甾體激素的檢測實驗結果及其結論，採用「磁性微粒分離的免疫酶聯測定法(IEMA)」檢測同樣是可行的。顯然，上述的檢測原理及操作方法對於有關的甾體激素衍生物的檢測無疑同樣也是適用和可行的。由於迄今為止，人們並未認識到在人發中，當然更不可能認識到在人的鬍鬚、指(趾)甲等人體體表的這些角質生長物中含有甾體激素，並有著與人體生理、病理狀況的變化相適應的自身變化規律及其重要的應用價值，因此本發明的方法在科學上的重要意義是顯而易見的。上述實驗結果所表明的實際應用意義和價值同樣也是顯而易見的，它可以徹底改變對人體甾體激素及其衍生物的檢測必須到醫院或有相應條件的地點抽取血樣的傳統方式，以人體體表的角質生長物，特別是以量大易得而目前通常被視為廢棄物的人發為檢測樣品，可以具有同等的意義和作用，簡便易行，沒有任何痛苦，不會感染和傳播疾病，因而易於為人們廣泛接受，而且避免了隨對血液的採樣和檢測而帶來的諸多弊端和不便，又大大降低了檢測的費用成本，不僅在疾病的醫學檢驗和診斷上有重大的使用意義和價值，在科學研究上也有重要意義，它可成為內分泌研究的重要手段。在簡化和方便如對運動員的興奮劑檢測等其它有關領域的應用也具有重要和巨大的現實意義和價值。表1頭髮中雌二醇(E2)的含量測定結果(n＝17，E2含量單位為pg/g)注含量單位中的pg為10-12克表2頭髮中孕酮(P)的含量測定結果(n＝17，P含量單位為ng/g)注含量單位中的ng為10-9克表3人發與血液中同種甾體激素間的相關性\性別及樣本數激素種類頭髮中含量血清中含量發中含量/血中含量相關值(r)相關性女n＝35雌二醇25.6pg/g59.8pg/ml42.8％0.3960.05＞p＞0.025顯著性相關女n＝35孕酮8.25ng/g13.1ng/ml63.5％0.4400.025＞p＞0.01顯著性相關男n＝5睪酮1.30ng/g4.86ng/ml26.7％0.9200.025＞p＞0.01顯著性相關權利要求1.一種由人體體表角質生長物測定體內甾體激素及其衍生物含量的檢測方法，其特徵在於按下述步驟操作1)取人體體表的角質生長物粉碎後，用可溶解被檢測的甾體激素或其衍生物成分的有機溶劑浸泡，充分萃取至少一次後，將全部萃取液揮盡溶劑，得到萃取提取物；2)將上步得到的萃取提取物置於pH7.2-7.4的磷酸緩衝液中，於35-39℃放置25-35分鐘後，再於室溫至少混旋1分鐘；3)用常規的放射免疫法或酶免疫法測定上步混旋液中被測甾體激素或其衍生物的含量。2.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於所說的有機溶劑為沸點低於100℃的低沸點有機溶劑。3.如權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於所說的有機溶劑為含氧的低沸點有機溶劑。4.如權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於所說的有機溶劑為乙醚。5.如權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於所說的有機溶劑為沸點範圍為30-60℃的石油醚。6.如權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於所說的用溶劑萃取時有機溶劑的用量為25-50毫克的被萃取角質物用溶劑2毫升的比例，萃取次數至少為兩次。7.如權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於所說的用溶劑萃取時有機溶劑的用量為25-50毫克的被萃取角質物用溶劑2毫升的比例，萃取次數至少為兩次，每次萃取和放置時間至少為60分鐘，合併各次萃取液自然揮盡或水浴揮盡萃取溶劑後得到萃取提取物。8.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於將所說的萃取提取物置於由磷酸二氫鈉—磷酸氫二鈉組成的緩衝液中，於37±0.5℃水浴下放置約30分鐘後取出，再於室溫下混旋1分鐘後，用常規的免疫測定方法測定其中的甾體激素或其衍生物含量。9.如權利要求1至8之一所述的檢測方法，其特徵在於所說的人體體表角質生長物為人體的毛髮。10.如權利要求1至8之一所述的檢測方法，其特徵在於所說的人體體表角質生長物為人體的指甲或趾甲。全文摘要本發明涉及的是一種由人體體表角質生長物測定體內甾體激素及其衍生物含量的檢測方法,按下述步驟操作:1)取人體體表的角質生長物粉碎後,用可溶解被檢測的甾體激素或其衍生物成分的有機溶劑浸泡,充分萃取至少一次後,將全部萃取液揮盡,得萃取提取物;2)將所得到的萃取提取物置於pH7.2—7.4的磷酸緩衝液中,於35—39℃放置25—35分鐘後,再於室溫至少混旋1分鐘;3)用常規的放射免疫法或酶免疫法測定上步的混旋液中甾體激素或其衍生物的含量。文檔編號G01N33/53GK1173641SQ97107498公開日1998年2月18日申請日期1997年5月19日優先權日1997年5月19日發明者楊惠鍾申請人:四川省計劃生育科學研究所