菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法
2023-06-05 16:42:31 3
專利名稱：菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法
技術領域：
本發明涉及一種環境生物工程混合菌絲球的方法，特別是涉及一種菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法。
背景技術：
光合細菌(Photosynthetic bacteria,簡稱PSB)是一種在汙水淨化領域具有廣闊應用前景的原始光能合成體系微生物。該類微生物具有隨環境條件變化而靈活改變代謝類型的特性，可以在厭氧光照和好氧黑暗條件下對廢水中有機物進行降解。此外，PSB還具有工藝設備簡單、有機負荷高、菌體可回收利用、不造成二次汙染等優良特性。基於此，近年來國內外學者對光合細菌進行了廣泛應用和深入研究，並對食品加工、印染、焦化、養殖、製藥等多種行業高濃度有機廢水作了成功處理。然而，光合細菌的細胞個體普遍十分微小，其中球狀細菌的直徑為0.3 0.6μ m,杆狀為0.5 1.0 μ mX 0.9 2.0 μ m。因此，直接利用游離態的光合細菌處理廢水存在諸多不足，包括菌體細胞易被水中原生動物所吞噬，自然沉降困難，在有限的時間內固液分離效果不理想，菌體不易回收重複利用等問題，從而一方面造成了光合細菌細胞的流失，使得廢水處理過程中需要不斷添加新鮮菌體；另一方面導致處理後的廢水攜帶有大量細胞，使出水具有一定色度，COD和BOD偏高，無法達到直接排放標準。光合細菌存在的這些問題，嚴重製約了其在有機廢水處理過程中的推廣應用。要解決此類問題，可以考慮採用一定的物理或化學手段，如利用載體材料、包埋物質等，使光合細菌細胞通過人為作用將其限制在有限的空間區域中，同時保持細菌的生物活性，達到反覆利用的目的，這就是固定化微生物技術。常見的固定化載體和包埋材料為聚乙烯醇、海藻酸鈉、瓊脂、明膠等。然而，利用這些化學載體固定化光合細菌常會出現抑制細胞的生物活性，降低體系的傳質速率等問題，從而在一定程度上影響了其對有機廢水的處理能力。因此，開發廉價、高效的新型載體成為固定化光合細菌發展的必然趨勢。菌絲球是由黴菌或放線菌在培養過程中自動聚集形成的具有一定機械強度和大小的球狀顆粒物，它們是由菌絲纏繞而成，易於吸附其他顆粒物質。菌絲球具有諸多優點:
(I)具有一定的親疏水平衡值，有利於細菌的附著；(2)沉降性能良好，易於固液分離；
(3)菌絲球表面有很多空隙，傳質擴散阻力小；(4)成球和生長條件寬泛，生產成本低廉；
(5)具有一定的機械強度，能夠抵抗較大的水流剪切力。菌絲球的這些優點也是作為菌體細胞附著生長的載體所應具備的特點，即具有一定的機械強度、優越的物理形狀和傳質性能，以及無毒性。因此，可以利用菌絲球的吸附作用，將具有特殊降解功能的光合細菌固定在黴菌菌絲形成的純生 物質載體上，構建「混合菌絲球」。這樣形成的「混合菌絲球」有望對有機廢水具有高效的處理能力，將是今後廢水處理領域研究的熱點。而與此有關的研究國內外卻尚未見有報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，該方法提高了游離光合細菌處理有機廢水時出水的水質，並利用化學載體固定時不抑制光合細菌的細胞生物活性，提高了體系的傳質速率，在保證光合細菌生長活性的前提下，提高了對有機廢水的處理效果。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述方法包括孢子懸液的製備、菌絲球的製備、光合細菌細胞懸液的製備及吸附法混合菌絲球的製備，所述孢子懸液的製備是在生長的黴菌孢子使孢子脫落並懸浮於生理鹽水中，置空氣浴振蕩器中震蕩，使孢子呈均勻分散狀態，即得孢子懸液；菌絲球製備，首先配製菌絲球液體培養基，取葡萄糖，KH2P04，MgS04 -7H20加入無菌去離子水中，用NaOH和HCl調節pH，攪拌均勻，即為菌絲球液體培養基；培養菌絲球，取培養基滅菌，配製、培養基含黴菌孢子振蕩培養，成菌絲球後，保存在無菌生理鹽水中備用；製備光合細菌細胞懸液，配製光合細菌液體培養基取葡萄糖，酵母膏、尿素、2S04、蛋白腖，KH2P04, K2HP04, CaS04, MgS04.7H20 加入蒸餾水中，NaOH 和 HCl 調節PH，攪拌均勻，即為光合細菌液體培養基；光合細菌的富集培養，配製細菌液體培養基，將光合細菌打散、混勻，進行黑暗好氧培養，培養後取出備用；光合細菌細胞懸液的製備，將培養液於培養棄去上清液，收集菌體，將菌體重新懸浮於無菌生理鹽水中，配得光合細菌細胞懸液；吸附法製備混合菌絲球，將備用的菌絲球衝洗乾淨，裝光合細菌細胞懸液的錐形瓶中，用NaOH和HCl調節pH，黑暗好氧培養即獲得黴菌與光合細菌所形成的混合菌絲球。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述孢子懸液的製備:在無菌操作臺上，用接種環輕刮斜面固體培養基上生長的黴菌孢子，使孢子脫落，用10毫升無菌生理鹽水反覆衝洗固體斜面，直至孢子懸浮於生理鹽水中，用移液管將衝洗後的含有黴菌孢子的生理鹽水移至100毫升錐形瓶中，添加無菌去離子水，使每毫升去離子水中含有孢子約108個，然後置於空氣浴振蕩器中震蕩I小時，使孢子呈均勻分散狀態，即得孢子懸液。
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所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述菌絲球的製備:配製菌絲球液體培養基，稱取葡萄糖0.1 20克，蛋白腖0.1 20克，KH2P04 0.1 10克，MgS04.7Η20
0.ΟΓ Ο克加入到1000毫升無菌去離子水中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 5.(Tl0.0，攪拌均勻，即為菌絲球液體培養基。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述菌絲球的製備:培養菌絲球，取100毫升菌絲球液體培養基，倒入250毫升錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為115 1:或121 °C，滅菌時間為30分鐘，在無菌操作臺上，用無菌移液管移取孢子懸液於滅菌冷卻後的錐形瓶中，配製成每毫升液體培養基含黴菌孢子濃度約103 106個，將錐形瓶用無菌紗布封口後置於空氣浴振蕩器中進行振蕩培養，其中振蕩器轉速為10(Γ200轉/分鐘，培養溫度為2(T35°C，培養2飛天待形成大小均勻且較為密實的菌絲球後，取出過濾，收集菌絲球，保存在無菌生理鹽水中備用。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述葡萄糖為蔗糖，可溶性澱粉；蛋白腖為牛肉膏、酵母膏，馬鈴薯，NaN03、尿素。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述光合細菌細胞懸液的製備:配製光合細菌液體培養基，稱取葡萄糖0.Γ10克，酵母膏0.Γ20克，ΚΗ2Ρ04 0.Γ Ο克，Κ2ΗΡ04 0.Γ5克，CaS04 0.1 5克，MgS04.7H20 0.01 10克加入到1000毫升蒸餾水中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 5.(Tl0.0，攪拌均勻，即為光合細菌液
體培養基。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述葡萄糖為丙酸鈉、乙酸鈉、可溶性澱粉，酵母膏為牛肉膏，NaN03、尿素、(NH4) 2S04、蛋白腖。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述光合細菌細胞懸液的製備:光合細菌的富集培養，配製100毫升光合細菌液體培養基，倒入250毫升錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為115 1:或121 °C，滅菌時間為30分鐘，取出錐形瓶冷卻至室溫。用接種環移取1飛環固體培養基中保存的光合細菌至錐形瓶內，用無菌玻璃球將光合細菌打散、混勻，取出玻璃球，用黑布將錐形瓶周圍包好，置於空氣浴振蕩器中進行黑暗好氧培養，其中振蕩器轉速為6(Γ200轉/分鐘，培養溫度為1(T60 °C;培養2飛天后取出備用，SP得光合細菌富集培養液。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述光合細菌細胞懸液的製備:將光合細菌富集培養液於培養溫度為4°C，振蕩器轉速為6 000轉/分鐘的條件下高速離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體，將菌體細胞重新懸浮於無菌生理鹽水中，使每毫升生理鹽水含有光合細菌細胞約103 108個，即配得光合細菌細胞懸液。所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述吸附法製備混合菌絲球:用無菌生理鹽水將備用的菌絲球衝洗乾淨，然後按照廣30%的體積比加入裝有100毫升光合細菌細胞懸液的錐形瓶中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 5.(Tl0.0，用黑布將錐形瓶周圍包好，置於空氣浴振蕩器中黑暗好氧培養18 48小時，培養溫度為1(T60°C，振蕩器轉速為6·(Γ200轉/分鐘，即獲得黴菌與光合細菌所形成的混合菌絲球。本發明的優點與效果是:
本發明以黴菌形成的菌絲球為生物質載體，通過菌絲球的吸附作用將光合細菌固定在菌絲球表面及內部孔隙中，形成「混合菌絲球」，從而達到固定化光合細菌的目的，克服了投加光合細菌游離細胞處理有機廢水所存在的一系列問題。本發明以光合細菌的吸附率作為考察指標，表明黴菌所形成的菌絲球對光合細菌細胞顯示出良好的吸附效果，且形成的「混合菌絲球」具有較好的沉降性能和機械強度。本發明在保證光合細菌生長活性的前提下，減少了光合細菌的菌體流失。相比其他包埋材料而言，提高了對有機廢水的處理效果。此外，通過黴菌的吸附作用固定化光合細菌構建「混合菌絲球」的方法還具有操作簡便、培養成本低、培養時間短、可重複使用等優點，對大規模利用光合細菌處理有機廢水具有重要意義。
圖1為培養得到的「單一菌絲球」外觀顯微鏡 圖2為培養得到的「混合菌絲球」外觀顯微鏡圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明。本發明所涉及的光合細菌是一株可降解鄰氯苯酚的沼澤紅假單胞菌PSB-1D(Rhodopseudomonas palustris PSB-1D),16SrDNA 序列為 GenBank Accession N0.HM068966。該菌是已知現有菌種,各大菌種保藏庫均有保存。本發明所涉及的黴菌為一株命名為DH-1的青黴菌(Penicillium sp.)。本發明採用HZQ-C型空氣浴震蕩器作為微生物培養設備。本發明的高壓蒸汽滅菌採用LD2X-40BI電熱壓力蒸汽滅菌器。本發明採用的無菌水為經過高壓蒸汽滅菌鍋處理的去離子水，處理條件為溫度121 °C，壓力0.105Mpa的條件下維持30分鐘。實施例1:
一、孢子懸液的製備
在無菌操作臺上，用接種環輕刮斜面固體培養基上生長的青黴菌DH-1孢子，使孢子脫落。用10 mL無菌生理鹽水反覆衝洗固體斜面，直至孢子懸浮於生理鹽水中。用移液管將衝洗後含有青黴菌DH-1孢子的生理鹽水移至100毫升錐形瓶中，添加無菌去離子水，使每毫升去離子水中含有孢子約108個。然後置於空氣浴振蕩器中震蕩I小時，使孢子呈均勻分散狀態，即得孢子懸液。二、菌絲球的製備
1.配製菌絲球液體培養基
稱取葡萄糖10克，蛋白腖5克，KH2P04 I克，MgS04.7H20 0.5克加入到1000毫升無菌去離子水中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 7.0，攪拌均勻。即為菌絲球液體培養基。2.培養菌絲球
取100毫升菌絲球液體培養基，倒入250毫升錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌，其中，滅菌溫度為115°C，滅菌實踐為30分鐘。在無菌操作臺上，用無菌移液管移取孢子懸液於滅菌冷卻後的錐形瓶中，配製成每毫升液體培養基含黴菌DH-1孢子濃度約106個。將錐形瓶用無菌紗布封口後置於空氣浴振蕩器中進行振蕩培養，振蕩器轉速為130轉/分鐘，培養溫度為30°C。培養3天待形成大小均勻且較為密實的菌絲球後，取出過濾，收集菌絲球，保存在無菌生理鹽水中備用。三、光合細菌細胞懸液的製備 1.配製光合細菌液體培養基
稱取葡萄糖2克，酵母膏0.2克，KH2P04 0.6克，K2HP04 0.4克，CaS04 0.2克，MgS04.7Η20 0.3克加入到1000毫升蒸餾水中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 7.0，攪拌均勻，即為光合細菌液體培養基。2.光合細菌的富集培養
配製100毫升光合細菌液體培養基，倒入250毫升錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌，其中，滅菌溫度為115°C，滅菌時間為30分鐘。取出錐形瓶冷卻至室溫。用接種環移取3環固體培養基中保存的光合細菌PSB-1D至錐形瓶內，用無菌玻璃球將光合細菌打散、混勻。取出玻璃球，用黑布將錐形瓶周圍包好，置於空氣浴振蕩器中進行黑暗好氧培養，培養溫度為30°C，搖床轉速為150轉/分鐘。培養4天後取出備用，即得光合細菌PSB-1D富集培養液。3.光合細菌細胞懸液的製備
將光合細菌PSB-1D富集培養 液於培養溫度4°C，轉速6 000轉/分鐘的條件下高速離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體。將菌體細胞重新懸浮於無菌生理鹽水中，使每毫升生理鹽水含有PSB-1D細胞約106個，即配得光合細菌細胞懸液。四、吸附法製備「混合菌絲球」
用無菌生理鹽水將備用的菌絲球衝洗乾淨，然後按照10%的體積比加入裝有100毫升光合細菌細胞懸液的錐形瓶中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 7.0。用黑布將錐形瓶周圍包好，置於空氣浴振蕩器中黑暗好氧培養24 h，培養溫度為30°C，振蕩器轉速為130轉/分鐘，即獲得黴菌與光合細菌所形成的「混合菌絲球」。對「混合菌絲球」採用「顏色浸潤法」測其傳質性能，與海藻酸鈉固定化細胞PSB-1D製得的顆粒進行比較。結果表明，本實施方式製得的「混合菌絲球」其傳質性能好於海藻酸鈉固定化顆粒的傳質性能。通過測量吸附反應前後光合細菌細胞懸液吸光度0D490，計算菌絲球對光合細菌PSB-1D的吸附率E:
權利要求
1.菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，所述方法包括孢子懸液的製備、菌絲球的製備、光合細菌細胞懸液的製備及吸附法混合菌絲球的製備，其特徵在於，所述孢子懸液的製備是在生長的黴菌孢子使孢子脫落並懸浮於生理鹽水中，置空氣浴振蕩器中震蕩，使孢子呈均勻分散狀態，即得孢子懸液；菌絲球製備，首先配製菌絲球液體培養基，取葡萄糖，KH2P04, MgS04 · 7H20加入無菌去離子水中，用NaOH和HCl調節pH，攪拌均勻，即為菌絲球液體培養基；培養菌絲球，取培養基滅菌，配製、培養基含黴菌孢子振蕩培養，成菌絲球後，保存在無菌生理鹽水中備用；製備光合細菌細胞懸液，配製光合細菌液體培養基取葡萄糖，酵母膏、尿素、2S04、蛋白腖，KH2P04, K2HP04, CaS04, MgS04 · 7H20加入蒸餾水中，NaOH和HCl調節pH，攪拌均勻，即為光合細菌液體培養基；光合細菌的富集培養，配製細菌液體培養基，將光合細菌打散、混勻，進行黑暗好氧培養，培養後取出備用；光合細菌細胞懸液的製備，將培養液於培養棄去上清液，收集菌體，將菌體重新懸浮於無菌生理鹽水中，配得光合細菌細胞懸液；吸附法製備混合菌絲球，將備用的菌絲球衝洗乾淨，裝光合細菌細胞懸液的錐形瓶中，用NaOH和HCl調節pH，黑暗好氧培養即獲得黴菌與光合細菌所形成的混合菌絲球。
2.根據權利要求I所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述孢子懸液的製備在無菌操作臺上，用接種環輕刮斜面固體培養基上生長的黴菌孢子，使孢子脫落，用10毫升無菌生理鹽水反覆衝洗固體斜面，直至孢子懸浮於生理鹽水中，用移液管將衝洗後的含有黴菌孢子的生理鹽水移至100毫升錐形瓶中，添加無菌去離子水，使每毫升去離子水中含有孢子約108個，然後置於空氣浴振蕩器中震蕩I小時，使孢子呈均勻分散狀態，即得孢子懸液。
3.根據權利要求I所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述菌絲球的製備配製菌絲球液體培養基，稱取葡萄糖O. f 20克，蛋白腖O.廣20克，KH2P04 O. Γ10克，MgS04 ·7Η20 O. ΟΓ Ο克加入到1000毫升無菌去離子水中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 5. (TlO. 0，攪拌均勻，即為菌絲球液體培養基。
4.根據權利要求3所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述菌絲球的製備培養菌絲球，取100毫升菌絲球液體培養基，倒入250毫升錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為115 1或121 °C，滅菌時間為30分鐘，在無菌操作臺上，用無菌移液管移取孢子懸液於滅菌冷卻後的錐形瓶中，配製成每毫升液體培養基含黴菌孢子濃度約103 106個，將錐形瓶用無菌紗布封口後置於空氣浴振蕩器中進行振蕩培養，其中振蕩器轉速為100 200轉/分鐘，培養溫度為2(T35°C，培養2飛天待形成大小均勻且較為密實的菌絲球後，取出過濾，收集菌絲球，保存在無菌生理鹽水中備用。
5.根據權利要求3所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述葡萄糖為蔗糖，可溶性澱粉；蛋白腖為牛肉膏、酵母膏，馬鈴薯，NaN03、尿素。
6.根據權利要求I所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述光合細菌細胞懸液的製備配製光合細菌液體培養基，稱取葡萄糖O. f 10克，酵母膏O.Γ20 克，KH2P04 O. Γ10 克，Κ2ΗΡ04 O. I 5 克，CaS04 O. I 5 克，MgS04 · 7H20 O. 01 10 克加入到1000毫升蒸餾水中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 5. (TlO. 0，攪拌均勻，即為光合細菌液體培養基。
7.根據權利要求6所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述葡萄糖為丙酸鈉、乙酸鈉、可溶性澱粉，酵母膏為牛肉膏，NaN03、尿素、(NH4)2S04、蛋白腖。
8.根據權利要求6所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述光合細菌細胞懸液的製備光合細菌的富集培養，配製100毫升光合細菌液體培養基，倒入250毫升錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為115 1或121 °C，滅菌時間為30分鐘，取出錐形瓶冷卻至室溫；用接種環移取I飛環固體培養基中保存的光合細菌至錐形瓶內，用無菌玻璃球將光合細菌打散、混勻，取出玻璃球，用黑布將錐形瓶周圍包好，置於空氣浴振蕩器中進行黑暗好氧培養，其中振蕩器轉速為6(Γ200轉/分鐘，培養溫度為1(Γ60V ;培養2飛天后取出備用，即得光合細菌富集培養液。
9.根據權利要求6所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述光合細菌細胞懸液的製備將光合細菌富集培養液於培養溫度為4°C,振蕩器轉速為6000轉/分鐘的條件下高速離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體，將菌體細胞重新懸浮於無菌生理鹽水中，使每毫升生理鹽水含有光合細菌細胞約103 108個，即配得光合細菌細胞懸液。
10.根據權利要求I所述的菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，其特徵在於，所述吸附法製備混合菌絲球用無菌生理鹽水將備用的菌絲球衝洗乾淨，然後按照廣30%的體積比加入裝有100毫升光合細菌細胞懸液的錐形瓶中，用質量分數為10%的NaOH和10%的HCl調節pH 5. (TlO. 0，用黑布將錐形瓶周圍包好，置於空氣浴振蕩器中黑暗好氧培養18 48小時，培養溫度為1(T60°C，振蕩器轉速為6(Γ200轉/分鐘，即獲得黴菌與光合細菌所形成的混合菌絲球。
全文摘要
菌絲球吸附光合細菌形成混合菌絲球的方法，涉及一種環境生物工程混合菌絲球的方法，包括孢子懸液的製備、菌絲球的製備、光合細菌細胞懸液的製備及吸附法混合菌絲球的製備，得孢子懸液後進行菌絲球製備菌絲球液體培養基，培養菌絲球，成菌絲球後，製備光合細菌細胞懸液，光合細菌的富集培養，配製細菌液體培養基，將光合細菌打散、混勻，進行黑暗好氧培養；光合細菌細胞懸液的製備，將培養液於培養棄去上清液，配得光合細菌細胞懸液；將備用的菌絲球衝洗乾淨，用NaOH和HCl調節pH，黑暗好氧培養即得混合菌絲球。本發明提高了對有機廢水的處理效果，對大規模利用光合細菌處理有機廢水具有重要意義。
文檔編號C02F3/34GK103255123SQ20131015170
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月27日 優先權日2013年4月27日
發明者董怡華, 馮治宇, 張玉革, 林靜雯 申請人:瀋陽大學