抗胞內病原體的疫苗的製作方法

2023-06-05 04:40:36

專利名稱：抗胞內病原體的疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗和一種生產疫苗的方法。更特別的，本發明涉及從胞內病原體感染的細胞中生產應激誘導的蛋白質的疫苗的方法，及由此獲得的組合物。
熱激蛋白(HSPs)形成一個高保守蛋白質家族，其廣泛分布於植物和動物王國。基於其分子量，將HSPs分為6個不同家族小型(hsp20-30kDa)；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90；和hsp100。儘管HSPs最初是在進行熱應激的細胞中鑑別的，但已經發現它們與其它形式的應激如感染相關，且因此更通常的已知為應激蛋白(SPs)。為方便起見，本文中縮寫SP用於表示任何方法所產生的所有形式的應激蛋白，而縮寫HSP用於表示那些通過熱應激特異性誘導的蛋白質。
哺乳動物hsp90家族的成員包括胞質hsp90(hsp83)，和內質網相應物hsp90(hsp83)，hsp87，Grp94(Erp99)和gp97，見例如Gething等，(1992)，自然35533-45。hsp70家族的成員包括胞質hsp70(p73)和hsp70(p72)，內質網相應物BiP(Grp78)，和線粒體相應物hsp70(Grp75)。hsp60家族成員只在線粒體中鑑別。
SPs在細胞內是普遍存在的，SPs的一個作用是陪伴肽從一個細胞區室至另一個區室，並將肽呈遞給MHC分子，以實現細胞表面呈遞至免疫系統。在疾病細胞的情況下，SPs還陪伴病毒或腫瘤相關的肽至細胞表面，見Li和Sirivastave(1994)，Behring Inst.Mitt，9437-47，及Suzue等(1997)，美國科學院院報9413146-51。陪伴功能是通過在ATP依賴型反應中，SPs與抗原性肽片段之間，及SPs和病毒或腫瘤相關的肽片段之間形成複合物而完成的。SPs以ATP依賴型形式與廣譜肽片段結合或複合。在這種複合物中的肽是肽片段的隨機混合物。此種肽片段的混合物和精確性質還未確定。SPs與各種肽片段形成複合物已在正常組織中觀測到，其不是腫瘤特異性現象，見Srivastava(1994)，Experimentia 501054-60。
在治療方面，已經將哺乳動物HSPs用作疫苗。WO97/10000和WO97/10001揭示了分離自癌細胞或病毒感染的細胞的HSPs混合物，能激發對同類腫瘤或病毒抗原的保護性免疫或胞毒性T淋巴細胞。然而相反，分離自正常細胞的HSPs不能激發這種免疫性。目前認為HSPs沒有免疫原性，但由於其與在抗原加工期間產生的腫瘤或病毒特異性抗原性肽片段結合而能激發免疫性。具體地，與HSPs結合的肽片段是免疫原性的，並被呈遞給T細胞。與肽片段剝離的HSPs喪失其免疫原性，見Udono，H.和Srivastava，P.K.，實驗醫學雜誌，178，p1391，1993。到目前為止，還未確定這些肽片段的性質。
目前認為SPs的免疫原性不是得自SP本身，而是得自與SP結合的肽片段的複合物，此論點是基於複合物的一些特性。從正常和腫瘤細胞衍生的SPs的結構沒有差別。某些SP與肽片段的複合物用ATP處理後喪失其免疫原性，Udono等，(1993)，實驗醫學雜誌1781391-96。免疫原性的這種喪失是由於複合物解離為其SP和肽組分所致。SP製備物的免疫原性依賴於吞噬細胞的存在，如巨噬細胞和其它APCs。目前認為SPs由巨噬細胞攝入，然後將那些與SPs結合的肽片段通過巨噬細胞的MHC I類分子呈遞。以此方式，起始T細胞應答。
使用哺乳動物HSP/抗原性肽片段複合物作為抗胞內病原體的疫苗見於WO95/24923揭示。已經提示將分離自病毒感染的細胞的HSPs作為抗原性肽的來源，其然後可被呈遞給T細胞。這必須從這種細胞中生產和純化HSPs。通過熱激刺激細胞通常使熱激蛋白的水平提高。
然而，尚未提示通過熱激或其它應激處理細胞，以提高HSPs的胞內水平。這也許是因為其需要只刺激產生HSPs的一亞型，尤其是免疫原性亞型，目前沒有特異性刺激細胞產生這種具有增強的免疫原性的HSPs亞型的方式。
令人驚奇的是用熱或腫瘤壞死因子處理胞內病原體感染的細胞，產生的SPs比衍生自未誘導的細胞或已經通過其它刺激應激的細胞的SPs具有更強的免疫原性。通過這些誘導的SPs激發的免疫性的一個令人注目的方面是，與通過其它SP亞型免疫誘導的免疫性相比具有長期記憶。對細菌病原體的最佳記憶應答在用熱誘導的應激蛋白中觀測到，對原生動物和寄生蟲病原體的最佳記憶應答在用腫瘤壞死因子誘導的應激蛋白中觀測到。
本文所用術語「疫苗」是指刺激免疫系統使得其能更好地應答隨後的感染的含有免疫原性決定簇的任何組合物。應意識到疫苗通常含有一免疫原性決定簇和一佐劑，該佐劑非特異性地增強對該決定簇的應答。
優選地，本發明的免疫原性決定簇與佐劑組合輸送。本領域技術人員已知適當的佐劑，如Freund’s完全佐劑，Freund’s不完全佐劑，Quil A，Detox，ISCOMs或鯊烯。然而應意識到本發明的疫苗不用佐劑也是有效的。這種疫苗可通過任何適當方式施用，如口服，或通過注射。
術語「應激蛋白」和「熱激蛋白」，包括那些包含細菌HSPs的GroEL，GroES和DnaK和DnaJ家族，和其它胞外病原體中的相關家族的蛋白質。這些家族是基於它們編碼的肽的大小而命名的。這些家族在物種之間是高度保守的。另外，許多細菌也表達真核蛋白的同源物。優選地，本發明疫苗含有多個衍生自應激的病原體的SP/抗原性肽片段複合物。我們特別優選將GroEL，GroES，DnaK和DnaJ家族的蛋白質在本發明中用作免疫原性決定簇，最優選的是DnaJ和GroEL。優選地，SP複合物與熱誘導的HSP蛋白家族在胺基酸水平具有高於25％的同源性和/或20％的相同性。
本發明要求所用的應激處理能刺激感染的細胞中存在SPs。針對由原生動物和寄生蟲病原體感染的細胞而言，我們優選應激是通過腫瘤壞死因子尤其腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的。對由細菌病原體感染的細胞而言，我們優選應激是通過在未感染的細胞正常生長溫度之上的5-10℃，對感染的細胞進行熱處理誘導的。不拘泥於理論，據認為對胞內病原體感染的細胞進行處理特異性誘導與來自病原體的抗原性肽最大程度相互作用的HSPs，或誘導最易於被APCs吞噬的HSPs，或兩者均誘導。
誘導SPs的最佳條件可易於通過簡便的反覆試驗確定，以及通過用常規技術評價的刺激物的變化的作用而確定，如對動物進行體內實驗，或通過其它方法例如「免疫學通用方法」，Wiley Interscience，1997所述方法確定。
當用TNF處理而應激細胞時，適當使用的TNF為0.5-1000國際單位(i.u)/ml，優選為大約1-500i.u/ml。特別地，就TNF-α而言，我們優選細胞是用10-500i.u/ml處理的，然後培養10-16小時。或者，可將細胞在產生細胞因子的飼養單層上生長，或誘導產生內源性TNF。另外，用應激刺激溫育細胞的時間也是可變的。我們優選使用10-16小時的暴露時間，但此時間在一些情況中可降低至2-4小時，並仍是有效的。
本領域技術人員已知測試最佳熱或TNF水平和溫育時間的方法。然而，應意識到精確處理對本發明不是關鍵的，只要此處理刺激所需免疫原性產物尤其SP/抗原性肽片段複合物在處理的細胞內產生即可。相似地，處理的其它條件如暴露時間長短和細胞溫育培養基不是本發明的關鍵特徵，且可以根據所用細胞群的實際性質而變化。本領域技術人員已知改變和最佳化這些參數的方法。
優選地，TNF是分離自與處理的細胞相同的生物體。用來自相同生物體的TNF處理細胞，可最佳刺激SP複合物的形成。然而，來自其它物種和個體的TNF也可用於在細胞中正向調節SP水平，以提供適當的SP複合物用於本發明中。
本發明可使用任何適當的病原體感染的細胞或細胞系，以提供SP複合物的來源。感染的細胞是通過用所需的病原體在體外感染適當的細胞系，或通過在體內分離病原體感染的細胞而獲得的。以此方式感染的細胞然後可在體外進行適當應激，以產生抗此病原體的適於接種的免疫原性SP複合物。這包括表達來自所需胞內病原體的異源抗原的重組細胞。這些也包括用於產生重組疫苗的所有類型的轉染的重組細胞，如通過本領域標準方法如電穿孔法，脂質體融合和磷酸鈣，用重組載體轉染的哺乳動物細胞系。本發明還包括從真核細胞中形成所需的SP複合物，該真核細胞表達對熱或TNF處理應答的異源胞內病原體抗原。儘管抗原性片段主要是蛋白質或肽，它們也可包括碳水化合物，核酸和結合SPs的脂質組分。
應意識到對目前使用的胞內病原體感染的細胞可進行修飾，以使它們組成型地合成正常情況下通過適當的胞外應激刺激物即熱或TNF處理誘導的SPs，所述修飾是通過用任何適當重組DNA方法修飾其遺傳結構，例如「分子生物學當前方案」，Wiley Interscience，1997所述。
可用任何適當的方法提取和純化從施加應激的細胞材料中誘導的蛋白質物質，尤其SP/抗原性肽片段複合物，使之與剩餘的細胞材料分離。例如，可將應激處理的材料通過均質化或超聲片段化而破壞，隨後離心在上清中獲得粗製SP製備物。粗製的內源性SP製備物可直接用作本發明的疫苗。任選地，SP製備物可通過使用ADP結合柱或本領域技術人員已知的其它適當方法進一步純化，見例如WO97/10000和WO97/10001所述。
應意識到特異性免疫原性SP/抗原性肽片段複合物可從細胞材料的應激產生的複合物混合物中分離，以產生病原體特異性的疫苗。然而，通常不需要這樣，且複合物混合物可用於誘導廣譜免疫。如果需要，特異性抗原性肽片段可從複合物中回收，例如通過用常規方法經ATP處理而回收。
本發明疫苗的SP/抗原性肽片段複合物可與佐劑組合在水性載體中輸送。本領域技術人員已知適當的佐劑，如Freund’s完全佐劑，Freund’s不完全佐劑，Quil A，Detox，ISCOMs或鯊烯。然而，本發明的疫苗組合物沒有佐劑也可以是有效的。
本發明還提供了一種用本發明疫苗處理動物的方法，包括任選地與佐劑組合施用藥物學可接受量的本發明疫苗，該量足以激發動物體內免疫應答。此動物典型地是人。然而，本發明還可用於處理其它動物，如馬，牛，山羊，綿羊或豬，及可用於處理鳥類，尤其家禽如雞或火雞。
本發明的疫苗組合物可通過任何適當方法施用，如口服，吸入，經皮或通過注射和在任何適當載體介質中施用。然而，優選將疫苗以水性組合物形式通過用任何適當針頭或無針方法注射。
本發明的疫苗可含有任何適當濃度的SP/抗原性肽片段複合物。我們優選是每kg經處理的動物體重施用10-600μg，更優選10-100μg，最優選25μg的SP複合物。應意識到本發明的疫苗可用作初始處理，隨後進行一或多次相同或不同劑量處理，每次處理間隔1-26周，以提供對病原體的延長免疫作用。
以下實施例例證但非限制本發明。

圖1-3是通過各種應激方法獲得的SP複合物的毛細管區帶電泳(CZE)圖。圖1是分離自結核分枝桿菌感染的小鼠腹膜巨噬細胞的組成型SPs的肽/多肽的CZE圖；圖2是分離自結核分枝桿菌感染的小鼠腹膜巨噬細胞的熱誘導的SPs的肽/多肽的CZE圖；圖3是分離自結核分枝桿菌感染的小鼠腹膜巨噬細胞的TNF誘導的SPs的肽/多肽的CZE圖。
實施例1製備熱誘導的SPs將用牛分枝桿菌感染的細胞在無血清的培養基如RPMI(Sigma)清洗，然後在45℃熱激0.5小時，或在42℃熱激5小時，並培養過夜。然後將細胞在無血清培養基中清洗，隨後在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中清洗。將細胞再懸浮於均質化緩衝液中。此均質化緩衝液可以是低滲緩衝液，如含有2mM MgCl2的10mM磷酸鹽，pH7.4。然後將細胞用細胞同質器(例如Dounce或Potter同質器，Ultraturrax或Waring攪拌機)破壞。或者，均質化緩衝液可含有去汙劑，如具有0.5％Tween的PBS，去汙劑的濃度在0.1-1％之間，並適於使細胞膜增溶。然後將細胞裂解物通過離心處理，典型的在3-5000g離心5分鐘，以除去細胞核和細胞碎片，隨後在100000g高速離心15-30分鐘。將這樣獲得的上清加工以提供適用於疫苗中的SP/抗原性肽片段複合物。這可通過硫酸銨沉澱進一步加工，使用20-70％的硫酸銨。特別地，在4℃加入20％(w/w)硫酸銨，棄去沉澱，隨後加入更多的硫酸銨使濃度達到70％w/w。通過離心收集蛋白質沉澱，然後用適當的生理學可注射的緩衝液如鹽水透析，以在使用之前除去硫酸銨。應意識到以此方式分離的HSPs不是純化為同質的，但仍然適用作疫苗成分。
如果需要更純化的HSP製備物，然後可將HSP通過在攜帶腺苷二磷酸的基質如ADP-瓊脂糖或ADP-瓊脂糖凝膠上進行親和層析從上清中純化，這些方法例如WO97/10000，WO97/10001，WO97/10002所述。
SP複合物可在任何適當濃度使用，以提供疫苗組合物中的免疫原性決定簇。我們優選每kg動物體重施用的誘導的SP複合物的量在10-600μg範圍內，優選10-100μg，更優選25μg。
為確定SP複合物的免疫原性，可使用T細胞增殖分析。適當的分析包括混合淋巴細胞反應(MLR)，通過含氚胸苷吸收分析；和胞毒性分析以確定從靶細胞中釋放的51Cr，見「免疫學當前方案」，Wiley Interscience，1997。或者，可用標準免疫分析或噬斑裂解分析測試抗體產生，或通過胎兒子宮內保護確定，見「免疫學當前方案」。實施例2製備TNF誘導的SPs將用瘧原蟲感染的細胞系在無血清培養基如RPMI(Sigma)中溫育，並與TNF-α溫育過夜。典型地，將通過膠原酶處理大鼠肝組織製備的大鼠肝細胞用Plasmodium Berghei感染，其是將大鼠肝細胞與3倍數目的寄生蟲細胞在35℃溫育5小時而進行。然後將細胞與或不與TNF-α溫育過夜。將TNF誘導的和對照細胞在無血清培養基中清洗，隨後在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中清洗。實施例3用誘導的HSPs免疫；在疫苗受體內的免疫性含有HSP複合物的疫苗組合物是如實施例1所述製備的，並將小鼠和兔通過注射1-10μg在磷酸鹽緩衝液中的含應激蛋白的提取物進行接種，在初始注射一個月後用相同劑量的疫苗加強。由病原體誘導的免疫性用總瘧原蟲或牛分枝桿菌蛋白通過Western印跡分析。通常獲得1∶1-10000的抗體效價，抗病原體感染的細胞的胞毒性T細胞活性也可在免疫的小鼠中檢測。用固定的瘧原蟲或牛分枝桿菌在初次免疫後6，12和18個月攻擊，導致效價為1∶1-10000的良好抗體應答，表明在免疫的動物體內良好的記憶應答。實施例4對比在組成型和誘導的SP複合物中結合的肽及其作為疫苗的應用用結核分枝桿菌感染經腹腔灌洗液分離的小鼠腹膜巨噬細胞(3×106細胞用107細菌細胞在35℃溫育6小時)。感染的細胞培養物在存在1μg/ml TNF-α或不存在時在37℃培養過夜，以分離組成型或TNF誘導的SPs，或者通過在42℃保溫2小時而熱激以分離熱誘導的SPs(HSPs)。通過在3000g離心5分鐘沉澱處理的細胞並重懸於在100mM Tris-HCl，pH8中的1％Tween的裂解溶液中。細胞裂解物在5000g離心5分鐘以除去細胞核和細胞碎片，隨後在100000g高速離心15-30分鐘。如實施例1所述經硫酸銨沉澱從澄清的裂解物中製備SPs和HSPs。
通過將沉澱的複合物重懸於10％乙酸中，並煮沸15分鐘解離複合物而將結合的肽從純化的HSPs和SPs中洗脫。將變性的HSPs和SPs在冷室中在Beckman airfuge中沉澱30分鐘，並通過凍幹收集含有肽的上清，用Beckman CZE系統通過毛細管區帶電泳分析。洗脫自組成型和TNF誘導的結核分枝桿菌SPs和HSPs的肽的CZE圖明顯不同，如圖1-3所示，表明這三種類型的SPs攜帶不同家族的結合肽。用三種類型的SPs接種兔顯示，在用組成型和TNF誘導的SPs免疫的動物中抗體效價類似，而在用熱誘導的細菌SPs免疫的動物中有明顯較高的抗體效價(10-50倍)。用洗脫的肽和分離該肽後的變性SPs或HSPs的混合物免疫產生的抗體應答較差，提示誘導免疫性需要天然完整的SP結合的肽複合物。實施例5組成型和誘導的SPs作為疫苗的比較將膠原酶消化的PVG大鼠肝通過細目篩並通過DMEM組織培養基離心清洗分離的細胞而製備大鼠肝細胞。將清洗的細胞以7×106細胞/ml的密度重懸並通過在37℃共培養4小時而用PlasmodiumBerghei感染。感染的細胞用於製備抗體效價分析所用的裂解物，或者在存在1μg/ml TNF-α或不存在時在37℃培養過夜，以分離組成型或TNF誘導的SPs。通過在3000g離心5分鐘沉澱細胞並重懸於在100mM Tris-HCl，pH8中的1％Tween的裂解溶液中。細胞裂解物在5000g離心5分鐘以除去細胞核和細胞碎片，隨後在100000g高速離心15-30分鐘。澄清的裂解物隨後用於抗體效價分析或分離用於接種的SPs。如實施例1所述經硫酸銨沉澱從澄清的裂解物中製備組成型和TNF誘導的SPs。
用重懸於磷酸鹽緩衝鹽水中的分離自組成型或TNF誘導的和熱誘導的細菌的SPs在不添加佐劑時初次或加強免疫兔。免疫動物中的抗體效價用10倍連續稀釋液經斑點印跡分析在如上所述製備自新鮮感染的肝細胞的總細胞裂解物上進行分析。用TNF誘導的SPs接種的動物的抗體效價比用組成型SPs接種的動物的抗體效價高10-100倍。
權利要求
1.一種生產含有免疫原性決定簇的疫苗的方法，其特徵在於包括以下步驟a)使得經胞內細菌病原體、原生動物病原體或寄生蟲病原體感染的細胞經歷熱或腫瘤壞死因子的應激；b)從應激的細胞中提取內源性應激誘導的產物；和c)使用提取的產物作為免疫原性決定簇，製備疫苗組合物。
2.權利要求1的方法，其特徵在於免疫原性決定簇的活性成分主要由一或多種休克蛋白/抗原性肽片段複合物組成。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於細胞用細菌病原體感染且所施加的應激是熱。
4.權利要求3的方法，其特徵在於熱應激通過在比細胞正常培養溫度高5-8℃下加熱而實現。
5.權利要求1的方法，其特徵在於細胞用寄生蟲病原體感染且應激由腫瘤壞死因子誘導。
6.前述任一項權利要求的方法，其特徵在於細胞已被修飾而誘導應激蛋白的合成。
7.前述任一項權利要求的方法，其特徵在於施加應激至細胞是體外進行的。
8.權利要求1的方法，其用於產生基本上如本文任一實施例所述的疫苗。
9.一種含有一種免疫原性決定簇的疫苗組合物，其特徵在於該免疫原性決定簇包含一種休克蛋白和一種抗原性肽片段之間的一或多種複合物，其衍生自用細菌胞內病原體、原生動物胞內病原體或寄生蟲胞內病原體感染的細胞的熱或腫瘤壞死因子應激。
10.一種含有一種免疫原性決定簇的疫苗組合物，其特徵在於該免疫原性決定簇用權利要求1-8任一項的方法產生。
11.權利要求9或10的疫苗組合物，其特徵在於所述組合物還含有該免疫原性決定簇的佐劑。
12.權利要求9-11任一項的疫苗組合物，其特徵在於所述組合物是水性組合物。
13.權利要求9或10的疫苗組合物，其基本上如本文任一實施例所述。
14.用疫苗處理動物的方法，其特徵在於包括將足以引發免疫應答的藥物學可接受量的權利要求9-13任一項的疫苗組合物給予動物。
15.權利要求15的方法，其特徵在於該疫苗組合物經注射給予。
全文摘要
本發明涉及產生和分離特異性免疫原性熱激蛋白的方法,該蛋白由經胞內病原體感染的細胞的熱或腫瘤壞死因子處理而誘導;本發明還涉及由這類蛋白製備的疫苗。
文檔編號A61P37/00GK1370077SQ0081174
公開日2002年9月18日 申請日期2000年8月18日 優先權日1999年8月19日
發明者卡米洛·安東尼·利奧·塞爾溫·科拉科 申請人:免疫生物學有限公司