通過施用組織因子通路抑制劑(tfpi)治療嚴重社區獲得性肺炎的製作方法

2023-06-05 19:06:16

專利名稱：：通過施用組織因子通路抑制劑(tfpi)治療嚴重社區獲得性肺炎的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種治療性治療嚴重社區獲得性肺炎的方法。更具體地，它涉及施用組織因子通路抑制劑蛋白質來削弱過強或過度的嚴重肺炎相關生理通路。
背景技術：
：肺炎是因肺的一個或多個功能性元件(包括肺泡腔和間質組織)急性感染所引起的疾病。美國每年約有200萬人患肺炎，他們中有40,000-70，000人死亡。肺炎在所有引起死亡的疾病分類中排名第6，是最常見的致死性醫院(醫院獲得性)感染。社區獲得性肺炎(CAP)對美國的衛生保健費用有顯著影響，每年的直接費用估計有140億美元，工資損失達90億美元。(LynchJP,MartinezFJ.Community-acquiredpneumonia(社區獲得性肺炎).CurrOpinPulmMed,1998;4:162-172)。在發展中國家，下呼吸道感染一般或是死亡的主要原因，或排名第2僅次於感染性腹瀉。(TheMerckManual,第73章，第6節,肺炎(Pneumonia),2000)。可按照各種組織包括美國胸科學會(AmericanThoracicSociety,ATS)所提出的指南來定義稱為"嚴重肺炎"的疾病。(AmJRespirCritCareMed2001;163:1730-1754)。例如，除了診斷嚴重肺炎的其它標準外，ATS還要求至少具有一條主要標準，例如需要機械換氣或有敗血休克。通常嚴重肺炎可由急性肺病、肺部炎症或由於例如炎症或凝血等因素引起的肺功能受到幹擾所致。嚴重CAP的診斷的依據是因肺炎而被icu專門收治的患者。流行病學統計發現，該患者群佔所有被icu收治患者的約ioy。。肺炎ICU患者在所有CAP患者中死亡率最高，為30%-40%，而與之相比普通CAP住院患者死亡率不到15%。美國每年診斷約4百萬成人患社區獲得性肺炎(CAP)，其中600,000人需要住院治療。Fine等，N.Engl丄Med.336,243-50,1997。大體來說，CAP的發生隨年齡而增加，最高流行率見於那些年齡65歲或更老的人群。Marston等,ArchInternMed:1997;157:1709-1718。在患有同類疾病(comorbidities)例如慢性阻塞性肺病、哮喘病、糖尿病、酒精中毒、免疫抑制、腎功能不全、慢性肝病和心臟病的患者中其發病率也增加。Marrie,CurrOpinPulmMed.l996;2:192-197;Niedermann等，AmRevRespirDis1993;148:1418-1426。在美國肺炎是感染引起死亡的主要原因，是所有死亡中排名第6的主要原因。肺炎相關死亡率從1979年到1992年增加了22%，1992年所有肺炎相關死亡中老年患者(65歲及以上)佔89%。參見肺炎和流感死亡率--美國，1979-1992[發表的勘誤見MMWR,1995;44:782中所示].MMWK1995;44:535-537。Fine和他的同事(1997)報導了某些共存疾病(腫瘤疾病、充血性心臟衰竭(CHF)、腦血管病、腎病和肝病)和某些體檢發現(精神狀態改變、心率加快、呼吸速率加快、收縮期血壓降低和體溫異常降低或升高)也與CAP相關死亡率的增加相關。此外，CAP對美國衛生保健費用具有顯著影響，每年的直接費用估計有140億美元，工資損失達90億美元。Lynch和Martinez,CurrOpinPulmMed.l998;4:162國172。組織因子通路抑制劑(TFPI)是一種存在於哺乳動物血漿中的蛋白質和絲氨酸蛋白酶抑帝lj齊U。Thomas,Bull.JohnsHopkinsHosp.81,26(1947);Schneider,Am丄Physiol.l49,123(1947);Broze和Miletich,Proc.Natl.Acad.Sd.USA84,1886(1987)。TFPI還稱為組織因子抑制劑、組織促凝血酶原激酶抑制劑、因子III抑制劑、外源性通路抑制劑(EPI)和脂蛋白相關凝血抑制劑(LACI)。1991年6月30日國際《血栓形成和止血》協會接受了其命名為"組織因子通路抑制劑"(TFPI)。血液凝固是液體血液轉變為固體凝膠或血塊。此外，凝血蛋白酶的消耗將導致過度出血。雖然纖維蛋白本身僅佔整個血凝塊的0.15%，但凝血主要是可溶性纖維蛋白原轉變為不溶性纖維蛋白。這種轉變是複雜的酶級聯反應的最後一步。所述組分(因子)以酶原、即蛋白水解酶的無活性前體存在，可在特定部位通過蛋白水解斷裂而轉變成活化酶。級聯反應時一種因子的少量活化可催化產生較多量的下一種因子，如此引起放大效應導致極迅速地形成纖維蛋白。認為凝血的啟動是由於血管損傷使因子Vila接觸內皮下細胞表達的組織因子(TF)所致。因子VIIa-TF複合物可切斷因子X形成因子Xa和切斷因子IX形成因子IXa。TFPI能結合因子VIIa和因子Xa。TFPI、因子VIIa(及其結合的TF)和因子Xa之間形成的複合物能抑制維持止血所需的因子Xa和IXa的進一步形成。Broze,Jr.,Ann.Rev.Med.46:103(1995)。直接進入血流的細菌產物包括內毒素活化凝血級聯反應可引起纖維蛋白廣泛沉積於動脈表面而致耗盡纖維蛋白原、凝血酶原、因子v、vin和血小板。此外，可激活纖維蛋白溶解系統，導致進一步形成纖維蛋白降解產物。看來與細菌產物(例如內毒素)啟動凝血的同時，名為纖維蛋白溶解系統的抵消機制看似也被血塊所活化。活化的因子vin可將纖維蛋白溶酶原活化劑前體轉變為纖維蛋白溶酶原活化劑，接著將纖維蛋白溶酶原轉變為纖維蛋白溶酶，從而介導血凝塊溶解。因此，血漿纖維蛋白溶解系統的活化也可導致出血傾向。內毒素血症與組織纖維蛋白溶酶原活化抑制劑(PAI)的血循環水平增加相關。此抑制劑能迅速滅活組織纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)，使其不能通過活化纖維蛋白溶酶原產生纖維蛋白溶酶促使纖維蛋白溶解。纖維蛋白溶解的削弱可引起纖維蛋白沉積於血管中，因此導致與敗血性休克相關的DIC。努力鑑定令人滿意的能預防或治療嚴重肺炎及其相關凝血病理的幹擾藥物仍在繼續。能阻斷凝血通路的製劑並不一定能有效治療或預防性治療嚴重肺炎。例如，肝素是一種常用的抗凝血劑。然而，由於肝素可引起過度出血和發現其雖可減弱凝血異常但不能挽留生命，因此對肝素進行可控制的應用很困難。參見例如Aoki等，"AHeparinintheTreatmentofDisseminatedIntravascularCoagulation,"(用活化的蛋白質C和未分級肝素治療彌散性血管內凝血的比較性雙盲隨機試驗)Int丄Hematol.75,540-47(2002)。幾次臨床試驗，主要是在爆發性DIC為主要特徵的腦膜炎球菌內毒素血症中，用肝素治療來降低敗血症死亡率證明已失敗。參見例如Corxigan等，"HeparinTherapyinSeptacemiawithDisseminatedIntravascularCoagulation.EffectonMortalityandonCorrectionofHemostaticDefects，"(肝素治療彌散性血管內凝血的敗血症。對死亡率和對糾正止血缺陷的影響)N.Engl丄Med.，283:778-782(1970);Lasch等，"HeparinTherapyofDifftiseIntravascularCoagulation(DIC)"(肝素治療彌散性血管內凝血(DIC))，Thrombos.Diathes.Haemorrh"33:105(1974);Straub，"ACaseAgainstHeparinTherapyofIntravascularCoagulation"(—個肝素治療血管內凝血的案例)，Thrombos.Diathes.Haemorrh.,33:107(1974)。易患嚴重社區獲得性肺炎的患者是那些需要被重症監護病房(ICU)收治的社區獲得性肺炎患者。社區獲得性肺炎患者是臨床上鑑定和/或經X光攝片和臨床症狀確認患有肺實質感染的患者。嚴重肺炎包括嚴重社區獲得性肺炎，通常具有已知的病原體，包括肺炎鏈球菌、軍團菌、流感嗜血桿菌(/^"/7wew^)或各種革蘭氏陰性菌。大部分嚴重社區獲得性肺炎患者在CAP急性發作前居住在社區中，僅有約20%是從醫院、私人醫院或長期護理院轉來而被ICU收治的。在美國嚴重CAP患者中男性約50%，女性約50%，但老齡居多。美國嚴重CAP患者中約17%年齡不到50歲；約24%年齡在50-64歲之間；約21%年齡在65-74歲之間和約38%年齡超過75歲。大多數嚴重CAP患者患有一種或多種顯著的同類疾病。2003年接收ICU護理治療的美國CAP患者中，通常患有相應的心臟病、COPD/囊性纖維化病、糖尿病、腎病、癌症、酒精中毒和/或藥物成癮。給予重組人ala-TFPI(—種TFPI類似物)已證明能夠改進敗血症動物模型的存活率。參見例如美國專利第6,063,764號。作為一種內源性蛋白質，TFPI耐受良好。靜脈輸注或皮下注射TFPI顯示能減少血凝塊形成，表現為凝血酶原時間(PT)延長而證明。在動物和人類研究中，PT的延長與血漿TFPI的增加呈線性相關。A.A.Creasey,Sepsis(敗血症)3:173(1999)。本領域仍然需要能夠抑制嚴重肺炎致死作用同時最大程度減少潛在嚴重副作用的治療方法。發明概述本發明的一實施方式是治療或預防嚴重肺炎的方法，包括給予患有或有患嚴重肺炎風險的患者TFPI或TFPI類似物。一些實施方式中，所述患者已被證明患有感染。本發明的另一實施方式是治療嚴重肺炎的方法，包括給患者連續靜脈輸注選自TFPI或TFPI類似物的製劑。一些實施方式中，所述患者已被證明患有感染。本發明的另一實施方式是治療或預防嚴重肺炎的方法，包括給予患有或有患嚴重肺炎風險的病人不會引起過度出血量的TFPI或TFPI類似物。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中所述TFPI或TFPI類似物通過連續靜脈輸注給藥，給藥速率相當於以低於約2.0毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。優選實施方式中，所述給藥速率相當於以約0.00025-2.0或約0.001-1.75毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。另一優選實施方式中，所述給藥速率相當於以約0.005-1.50毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。在一更優選實施方式中，所述給藥速率相當於以約0.010-0.75毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。在還要優選的實施方式中，給予所述TFPI或所述TFPI類似物的給藥速率相當於以約0.2-0.8毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。另一優選實施方式中，以所述給藥速率給藥所提供的總劑量相當於給予參照品ala-TFPI約0.024-4.8mg/kg的總劑量。另一優選實施方式中，以所述給藥速率給藥所提供的日劑量相當於給予參照品ala-TFPI約0.006-1.2mg/kg的日劑量。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中給予所述TFPI或TFPI類似物至少72小時。一優選實施方式中，給予所述TFPI或TFPI類似物至少96小時。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI.其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中所述TFPI類似物含有一由SEQIDNO:l的胺基酸19-89組成的第一Kunitz結構域。一優選實施方式中，所述TFPI類似物還含有由SEQIDNO:l的胺基酸90-160組成的第二Kunitz結構域。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中所述TFPI類似物含有SEQIDNO:l的胺基酸1-160，或所述TFPI類似物含有SEQIDNO:l的胺基酸90-160組成的第二Kunitz結構域。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中所述TFPI或TFPI類似物用含有TFPI或TFPI類似物的凍幹組合物製備。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中給予的所述TFPI或TFPI類似物為含精氨酸的製劑。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中給予的所述TFPI或TFPI類似物為含檸檬酸鹽的製劑。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，其中製劑中所述TFPI或TFPI類似物的濃度為約0.15mg/ml，含有約300mM的鹽酸精氨酸和約20mM檸檬酸鈉，pH約為5.5。其它實施方式包括任何一種上述實施方式，還包括在給予所述TFPI或TFPI類似物的24小時內同時給予一種選自抗生素、抗體、內毒素拮抗劑、具有抗凝血活性的組織因子類似物、免疫刺激劑、細胞粘附阻斷劑、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗劑、pafase(PAF酶抑制劑)、TNF抑制劑、IL-6抑制劑和補體的抑制劑的其它藥物。一優選實施方式中，所述其它藥物是能特異性結合選自TNF、IL-6和M-CSF的抗原的抗體。本發明的其它實施方式在觀看了以下參考附圖並結合詳細描述而可明白。發明詳述給予TFPI或TFPI類似物可有效預防和治療嚴重肺炎。連續低劑量給予TFPI或TFPI類似物(下文中以"給予低劑量TFPI"代替)也可有效預防和治療嚴重肺炎。給予TFPI或TFPI類似物，特別是以低劑量給予，可抑制或減輕急性或慢性炎症，具體是嚴重肺炎。當連續至少3天給予低劑量TFPI時，死於嚴重肺炎的風險降低，而不良副作用引起的併發症，特別是出血病症的發生率降到最低。低劑量給予TFPI的另一優點是可避免耐受作用，所述耐受作用在足夠高劑量時能降低TFPI的血漿濃度。在TFPI血漿濃度約為850ng/ml時激發的耐受效應可達半數最大值，而以低劑量給予TFPI時，其血漿水平通常維持在500ng/ml以下。低劑量給予TFPI常通過連續靜脈輸注TFPI或TFPI類似物來實現。TFPI和TFPI類似物本文使用的"TFPI"指具有如SEQIDN0:1所示276個胺基酸殘基序列分子量約為38,000道爾頓的成熟血清糖蛋白。它是組織因子活性和凝血活性的天然抑制劑。美國專利第5,110,730號描述了組織因子(TF)，美國專利第5,106,833號描述了TFPI。TFPIcDNA的克隆描述見Wun等，美國專利第4,966,852號。TFPI是一種蛋白酶抑制劑含有3個Kunitz結構域，己知其中的兩個能分別與因子VII和Xa相互作用。第三個結構域的功能仍然未知。認為TFPI在體內能通過形成無活性的四分之一因子Xa:TFPIa:組織因子複合物來抑制凝血的啟動。參見Rapaport,Blood73:359-365(1989)和Broze等,Biochemistry29:7539-7546(1990)的綜述。可從其與其它己有充分研究的蛋白酶抑制劑的同源性來推斷TFPI的許多結構特徵。TFPI不是一種酶，因此它可能以化學計量方式抑制其耙蛋白酶，即TFPI的一個Kunitz結構域抑制一個蛋白酶分子。優選本發明TFPI分子存在Kunitz結構域1和/或2。Kunitz結構域3的功能未知。"TFPI類似物"是含有一個或多個胺基酸添加或取代(通常為保守性取代)、一個或多個胺基酸缺失(如，TFPI片段)、或對一個或多個胺基酸中加入一個或多個化學基團的修飾的TFPI衍生物，只要這種修飾長度不破壞TFPI的生物學活性。製備多肽類似物的方法是本領域已知的，下面作進一步描述。優選的TFPI類似物是N-L-丙氨醯-TFPI(ala-TFPI)，其胺基酸序列見SEQIDNO:2所示。用下面描述的生物活性試驗測定，TFPI類似物具有TFPI的某些活性量。TFPI和類似物的優選生物活性試驗是凝血酶原時間(PT)試驗(見下)。TFPI和TFPI類似物可以是糖基化或非糖基化的。TFPI類似物的描述見美國專利第5,106,833號。Ala-TFPI是一種TFPI類似物，已知某國際藥物名為"替法可近(tifacogin)"。Ala-TFPI包括胺基酸末端有一個額外丙氨酸殘基的成熟、全長人TFPI完整胺基酸序列。將ala-TFPI胺基酸末端丙氨酸殘基經工程改造加入TFPI序列中以改進大腸桿菌表達同時有效切除了胺基酸末端的甲硫氨酸殘基。參見美國專利第5,212,091號。特別優選的TFPI類似物包含有保守性取代，即那些取代發生在同一胺基酸家族內的涉及側鏈的取代。具體地說，胺基酸通常可分成4個家族:(1)酸性一天冬氨酸、穀氨酸；(2)鹼性一賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性胺基酸一甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸類為芳族胺基酸。例如，可合理預測用異亮氨酸或纈氨酸分別取代亮氨酸、用穀氨醯胺取代天冬醯胺、用絲氨酸取代蘇氨酸、或用結構相關胺基酸類似保守性取代某胺基酸，對其生物學活性不會有重要影響。例如，只要該分子所需的功能保持完整，感興趣的多肽可包括約1-70個保守或非保守性胺基酸取代，例如l、2、3、4、5、6-50、15-25、5-10或1-70任何整數的取代。本領域技術人員不難確定感興趣分子中具有保持本文定義生物學活性的合理可能性的可被修飾區域。"同源性"指兩條多核苷酸或兩條多肽部分之間的相似性百分比。當兩條多肽序列的序列同源性或確定長度分子特定範圍內的相同性百分比顯示為至少約50%、優選至少約75%、更優選至少約80%-85%，優選至少約90%和最優選至少約95%-98%時,此二條多肽序列被此"基本同源"。本文採用的"基本同源"還指顯示與特定多肽序列完全相同的序列。總體上，"相同性"指兩條多肽序列的胺基酸與胺基酸分別精確相對應。相同性百分比可通過序列排列對比，計算兩個對比序列之間確切匹配數目,除以較短序列長度，結果再乘100而直接比較兩個分子之間的序列信息來定。優選天然或非天然產生的TFPI類似物的胺基酸序列與衍生自SEQIDNO:l的TFPI至少70%、80%、85%、卯％或95%或更高同源。更優選所述分子98%或99%同源。同源性百分比可採用Smith-Waterman同源性檢索算法測定，該算法採用缺口幵放罰分12，缺口延伸罰分2和BLOSUM距陣為62的仿射缺口檢索。SmUh-Waterman同源性檢索算法可參見Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-489(1981)。TFPI和TFPI類似物的生物學活性可用凝血酶原試驗測定。合適的凝血酶原試驗的描述見美國專利第5,888,968號和WO96/40784。簡單來說，凝血酶原時間可用血凝計(例如，OrganonTeknika的Coag-A-MateMTXII)測定。合適的試驗緩衝液含有lmg/ml牛血清白蛋白、100mM的NaCl、pH調節到7.5的50mM的Tris。需要的其它試劑是正常人血漿(例如，OrganonTeknika的"Verify1")、組織促凝血酶原激酶試劑(例如，OrganonTeknika的"SimplastinExcel")和TFPI標準溶液(例如，20ug/ml試驗緩衝液的100%純ala-TFPI)。通過分析(例如)終濃度為1-5yg/ml的TFPI標準溶液系列稀釋液的凝固時間獲得標準曲線。為了測定凝固時間，先將樣品或TFPI標準品用試驗緩衝液稀釋。然後加入正常人血漿。通過加入組織促凝血酶原激酶試劑啟動凝固反應。然後用儀器記錄凝固時間。以凝固時間對數與TFPI濃度對數作圖獲得線性TFPI標準曲線。根據TFPI標準品純度調整標準曲線使之對應於100%純度標準品的等價TFPI濃度。例如，如果標準品是97。/。生物化學純的ala-TFPI製品(即，含有3%重量的分子不具有TFPI生物學活性)，那麼此標準品各稀釋液的濃度要乘以0.97得到TFPI的真實濃度。因此，1.0ug/ml的97。/。純度的製品每mlTFPI標準品的真正重量等價於或視同於濃度1.0X0.97或0.97lig/ml。獲得TFPI和TFPI類似物可從細胞或組織中分離或純化、化學合成或用原核或真核細胞重組製備用於本發明方法的TFPI和TFPI類似物。分離TFPI有幾種方法。例如，分泌TFPI的細胞包括用TNF處理約3-4天的衰老的內皮細胞和年輕的內皮細胞、肝細胞和肝癌細胞。TFPI可用常規方法純化，包括層析方法，如Pedersen等，1990,/編.CA縫265,16786-93，Novotny等，1989,JCTze/w.264,18832-37,Novotny等，1991,78,394-400,Wun等，19卯，JC/zew.265,16096-101和Broze等，1987,屍rac.A^/.^c。d84,1886-90。TFPI出現在於血流中故可從血液中純化，參見Pedersen等，1990。製備TFPI或TFPI變體可用化學方法合成其胺基酸序列，如採用固相技術直接合成肽(Merrifield，J爿肌Soc.85，2149-2154,1963;Roberge等，Sc/e"ce269,202-204,1995)。可用手工技術或自動化合成蛋白質。自動化合成可採用例如AppliedBiosystems431A肽合成儀(PerkinElmer)來完成。任選採用化學方法分別合成TFPI或TFPI變體片段再組合產生全長分子。可按美國專利號4,966,852所述重組製備TFPI和TFPI類似物。例如，可將所需蛋白質的cDNA加入到質粒中在原核或真核細胞中表達。美國專利號4,847,201提供了用特定DNA序列轉化微生物和表達它們的細節。本領域普通技術人員知道有許多其它參考文獻提供了用微生物表達蛋白質的細節。它們中的許多被美國專利號4,847,201所引用，如Maniatas等，1982，《MolecuarCloning(分子克隆)》，ColdSpringHarborPress。可利用已有的各種技術轉化微生物用它們表達TFPI和TFPI類似物。以下僅是幾種可能採用的方式的例子。必須分離TFPIDNA序列將其與合適的調控序列相連接。TFPIDNA序列見美國專利號4,966,852，可將其加入到質粒，如pUNC13或pBR3822中，這些質粒可從例如Boehringer-Mannheim等公司商品化購得。一旦將TFPIDNA插入載體中，可將載體克隆入合適的宿主細胞中。可通過授於Mullis的美國專利號4,683,202和Mullis等的美國專利號4,683,195中所述的技術擴增此DNA。TFPIcDNA可通過以下步驟獲得誘導細胞如肝癌細胞(如H印G2和SKHep)製備TFPImRNA，然後鑑定和分離此mRNA並將其反轉錄以獲得TFPI的cDNA。將此表達載體轉化入宿主細胞如大腸桿菌後，可發酵細菌表達此蛋白質。細菌優選原核微生物尤其優選大腸桿菌。優選的可用於本發明的微生物是根據布達佩斯條約的規定，於1984年2月14日保存於ATCC的大腸桿菌K12、菌株MM294(登錄號為39607)。當然，也可在衍生自多細胞生物的真核宿主細胞培養中表達編碼多肽的基因。參見如《TissueCulture(組織培養)》，1973，Cruz和Patterson編,AcademicPress。可用的哺乳動物細胞系包括鼠骨髓瘤N51、VERO、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS、C127、HepG2和SKHep。還可在杆狀病毒感染的昆蟲細胞中表達TFPI和TFPI類似物(也參見上述美國專利號4,847,201)。也參見Pedersen等，1990,J.ofBiologicalChemistry,265:16786-16793。真核細胞表達載體一般包括啟動子和與哺乳動物細胞相容的調控序列，例如常用的仙臺病毒40(SV40)(Fiers等，1978,Nature,273:113)的早期和晚期啟動子或其它病毒啟動子如源自多瘤病毒、腺病毒2、牛乳頭瘤病毒、或禽肉瘤病毒的啟動子、或免疫球蛋白啟動子和熱激(蛋白)啟動子的那些啟動子。Axel的美國專利號4,399,216對哺乳動物細胞宿主系統的轉化作了全面描述。現在看來"增強子"區域對優化表達也很重要，它們一般是見於啟動子區域上遊的序列。如果需要，可從病毒中獲得複製起點。然而，整合入染色體是真核生物中DNA複製的普遍機制。目前也已採用植物細胞作為宿主，並已有與植物細胞相容的調控序列，如胭脂氨酸合酶啟動子和聚腺苷酸化信號序列(Depicker，A等，1982,J.MoI.Appl.Gen.,1:561)。轉化植物細胞的方法和載體公開於WO85/04899。可用於純化哺乳動物細胞表達的TFPI和TFPI類似物的方法包括依次應用肝素瓊脂糖、MonoQ、MonoS和反相HPLC層析。參見Pedersen等，同上；Novotny等，1989,J.Biol.Chem.264:18832-18837;Novotny等，1991,Blood,78:394-400;Wun等，1990,J.Biol.Chem.265:16096-16101;Broze等，1987,PNAS(USA),84:1886-1890;美國專利號5,106,833;和美國專利號5,466,783。這些參考文獻描述了純化哺乳動物產生的TFPI的各種方法。TFPI還可用哺乳動物細胞宿主表達為重組糖基化蛋白質，如用小鼠C127細胞(Day等，Blood76,1538-45，1990)、乳倉鼠腎細胞(Pedersen等，1990)、中國倉鼠卵巢細胞和人SK肝癌細胞。C127細胞已用於動物研究顯示在家兔中能有效抑制組織因子誘導的血管內凝血(Day等,同上)、能有效預防狗溶栓後動脈的重阻塞(Haskd等,Circulation84:821-827(1991))、能有效降低狒狒大腸桿菌敗血症模型的死亡率(Creasey等，J.Clin.Invest.91:2850(1993))。ala-TFPI還可用大腸桿菌宿主細胞表達為重組非糖基化蛋白質。通過體外重摺疊大腸桿菌產生的所述重組蛋白質得到高活性ala-TFPI的方法已有報導。參見例如WO96/40784。還可在細菌和酵母中製備TFPI和TFPI類似物然後純化。一般可採用美國專利號5,212,091;6,063,764和6，103，500或WO96/40784中所示的方法。ala-TFPI和其它TFPI類似物可按照WO96/40784和Gustafson等，Prot.Express.Pur.5:233(1994)所述進行純化、溶解和重摺疊，這些文獻納入本文作為參考。例如，當按照WO96/40784的實施例9製備時，可獲得佔總蛋白質重量約85%-90%的成熟的、正確摺疊的、具有生物學活性的ala-TFPI製品，其中約10%-15%為含有一個或多個氧化甲硫氨酸殘基的ala-TFPI。用凝血酶原試驗檢測這些氧化形式的生物學活性與未衍生的ala-TFPI相當，並預計在本文公開的本發明製品中具有活性。其餘物質含有各種修飾形式的ala-TFPI，包括二聚體、凝聚和乙醯化形式。TFPI和TFPI類似物可含有顯著數目的半胱氨酸殘基，美國專利號4,929,700顯示了關於TFPI重摺疊的方法。可用各種層析方法(如上面提到的那些)從緩衝溶液中純化得到TFPI和類似物。如果需要，可採用美國專利號4,929,700所示的方法。可用任何方法來純化得到純度和活性水平適合給予人的TFPI和TFPI類似物。治療方法和組合物一般採用TFPI和TFPI類似物來治療或預防因組織因子表達上調，因此TNF、IL-1或其它細胞因子激發TF活性而發生的那些疾病。TFPI的給藥，具體是TFPI的低劑量給藥，可降低患者體內細胞因子例如IL-6的濃度。一般低劑量TFPI給藥可用於治療炎症和凝血異常，包括急性和慢性炎症例如嚴重肺炎。"嚴重肺炎"按美國胸科學會(AmericanThoracicSociety)的指南定義。具體說，嚴重肺炎需要診斷為肺炎並存在a)兩條主要標準之一；或b)三條次要標準中的兩條；或c)英國胸科學會的4條標準中的兩條(Thorax2001;56[增刊FV]:1-64)。主要標準為l)需要機械換氣和2)敗血性性休克或需要升壓劑>4小時。次要標準為l)收縮壓《90mmHg，2)多葉性肺炎，和3)低血氧標準(Pa02/Fi02)〈250。英國胸科學會的標準為1)呼吸頻率》30次呼吸/分鐘，2)舒張壓《60mmHg，3)血尿素氮(BUN)〉7.0mM(〉19.6mg/dL)和4)意識紊亂。如本領域所知，低血氧標準(Pa02/Fi02)指動脈氧分壓與吸入氧分壓之比表示氣體交換損傷的水平。嚴重肺炎患者宜具有可用本領域已知任何方法證明的感染。這些方法包括但不限於在血液或其它正常的無菌體液或組織培養中通過(例如)GRAM染色、培養、組織化學染色、免疫化學試驗或核酸試驗檢測到致病性微生物。也可通過胸部X光攝片提供的肺炎診斷證據、以及感染的臨床症狀，包括但不限於呼吸頻率>/=30次/分鐘或PaC(VFi02〈250、血壓下降和體溫升高證明感染，從而構成全身抗感染治療的理由。TFPI和TFPI類似物的製劑優選通過靜脈輸注給予TFPI和TFPI類似物的製劑。優選基本上連續的靜脈輸注。實現所述給藥的方法是本領域技術人員已知的。輸注可通過中線或外周線進行。雖然能避免給藥速率的大波動，但給予TFPI後產生的血漿水平只要按本發明優選實施方式的恆速給藥連續輸注預期水平的20%以內，本發明給藥速率的短時偏差可以接受。在給予患者之前，可將配製材料加入到TFPI和TFPI類似物中。優選液體配製材料。可採用不同配方將TFPI和TFPI類似物配成不同濃度和與給藥途徑、溶解性和TFPI蛋白質穩定性相容的任何生理上適合的pH值。優選的靜脈輸注製劑包括約0.6mg/ml的ala-TFPI、300mM的鹽酸精氨酸、和pH5.0-6.0的檸檬酸鈉緩衝液。某些溶質如精氨酸、NaCl、蔗糖和甘露醇起著增溶和/或穩定ala-TFPI的作用。參見WO96/40784。尤其優選的靜脈輸注製劑包含約0.15mg/ml的ala-TFPI、300mM的鹽酸精氨酸和pH5.5的20mM檸檬酸鈉。也可用150mMNaCl和pH為5.5-7.2的20mM磷酸鈉或其它緩衝液將TFPI和TFPI類似物配製成濃度約0.15mg/ml的溶液，任選含有0.005。/o或0.01。/。(w/v)的聚山梨酯80(吐溫80)。其它製劑含有約0.5mg/ml的TFPI或TFPI類似物和含有150mMNaCl、8。/。(w/v)蔗糖或4.5%甘露醇的pH為5.5的lOmM醋酸鈉溶液。TFPI和TFPI類似物還可用高鹽配製成高達每毫升幾毫克更高濃度的製劑。例如一種製劑包含有約6.7mg/ml的ala-TFPI、500mMNaCl和pH7.0的20mM磷酸鈉。此外，TFPI製劑可包含甲硫氨酸，優選濃度範圍在l-10mM的甲硫氨酸。TFPI製劑的優選實施方式是約0.1-0.7mg/ml的ala-TFPI、200-500mM的L精氨酸、l-7mM的甲硫氨酸、pH5.0-6.0的5-50mM檸檬酸鈉緩衝液，。TFPI製劑的優選實施方式是約0.1-0.5mg/ml的ala-TFPI、250-400mM的L-精氨酸、3-6.5mM的甲硫氨酸、pH5.0-6.0的15-30mM檸檬酸鈉緩衝液。TFPI製劑的優選實施例中含有約0.15mg/ml的ala-TFPI、約300mM的L-精氨酸氫氧化物、5mM的甲硫氨酸、pH5.5的20mM擰檬酸鈉緩衝液。TFPI製劑的另一優選實施方式包含約0.45mg/ml的ala-TFPI、約300mM的L-精氨酸氫氧化物、5mM的甲硫氨酸、pH5.5的20mM檸檬酸鈉緩衝溶液。TFPI和TFPI類似物配製材料的其它例子包括油、聚合物、維生素、碳水化合物、胺基酸、鹽類、緩衝劑、白蛋白、表面活性劑或膨鬆劑。優選的碳水化合物包括糖或糖醇如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈澱粉、糊精、a和e環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉、和羧甲基纖維素、或其混合物。最優選蔗糖。糖醇定義為含-OH基團的CrC8烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。最優選甘露糖醇。上述這些糖或糖醇可單獨或組合施用。只要這種糖或糖醇可溶於水相製備物，其用量沒有固定限制。優選糖或糖醇的濃度在1.0w/v。/o和7.0w/v。/o之間，更優選在2.0和6.0w/v。/o之間。優選的胺基酸包括左旋(L)形式的肉鹼、精氨酸和甜菜鹼；然而，可加入其它胺基酸。優選的聚合物包括平均分子量2000-3000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或平均分子量3000-5000的聚乙二醇(PEG)。還優選在凍幹前或重建後在該組合物中使用緩衝劑以最大程度減小溶液pH變化。可採用大多數的生理緩衝液，但優選檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽和穀氨酸鹽緩衝液或其混合物。優選緩衝液濃度為0.01-0.3摩爾。可在該製劑中加入表面活性劑如歐洲專利號270,799和268,110所示。此外，TFPI和TFPI類似物可(例如)通過共價偶聯於聚合物進行化學修飾來延長其循環半衰期。優選的聚合物和將它們連接於肽的方法見美國專利第4,766，106、4,179,337、4,495,285和4,609,546號中所述。優選聚合物為聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG室溫可溶於水具有通式R(0-CH2-CH2)n-0-R，其中R可以是氫或保護性基團例如烷基或烷醇基團。優選保護性基團具有l-8個碳原子，更優選為甲基。符號n為正整數，優選為1-1,000，更優選為2-500。PEG的優選平均分子量為1000-40,000，更優選為2000-20，000，最優選為3,000-12,000。優選PEG具有至少一個羥基，更優選為末端羥基。優選活化所述羥基與抑制劑上的游離氨基基團反應。然而，應該理解為了獲得本發明的共價偶聯PEG/TFPI，可以改變反應基團的類型和數水溶性聚氧乙烯多元醇也可用於本發明。它們包括聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖、聚氧乙烯甘油(POG)等。優選為POG。理由之一是聚氧乙烯甘油的甘油骨架與(例如)動物和人中天然產生的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯的骨架相同。因此，在體內這種分支化合物並不必然會被視作外來物質。POG的優選分子量範圍與PEG相同。POG的結構見Knauf等,1988,J.Bio.Chem.263:15064-15070所述，有關POG蛋白偶聯物的論述參見美國專利第4,766,106號。TFPI或TFPI類似物的液態藥物組合物製備好後，可凍幹以防降解並無菌保存。凍幹液態組合物的方法是本領域普通技術人員已知的。臨用前，可用包含加入成分的無菌稀釋液(如Ringer溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建所述組合物。重建後，所述組合物優選通過連續靜脈輸注施用到對象。TFPI和TFPI類似物的劑量TFPI或TFPI類似物的給藥濃度應能有效治療或預防嚴重肺炎。此劑量對其它急性或慢性炎症和細胞因子上調組織因子表達所致的的常見疾病也有效。為實現此目的，TFPI或TFPI類似物宜通過靜脈給藥。給藥方法是本領域普通技術人員已知的。一般，TFPI或TFPI類似物優選以1Pg/kg和30mg/kg之間的劑量給予，更優選劑量在20g/kg和25mg/kg之間，最優選在1和15mg/kg之間。上述劑量給藥通常持續一段時間，至少約150小時，優選持續至少約100小時。一實施方式中，連續施用TFPI約99-90小時，優選為約97-94小時，更優選為約96小時。以單劑或分次劑量給予宿主的每日總劑量為例如約2-20毫克/千克體重，優選約2-15毫克/千克體重，約4-10mg/kg。組合物的劑量單位可包含所述量或構成日劑量的分劑量。較低的日劑量可用於預防或其它目的，例如，1txg/kg-2mg/kg。可與運載體材料結合產生單劑量的活性成分的量隨治療患者和施用的具體模式而不同。劑量方案應依據不同因素選擇，包括藥物類型、患者的年齡、體重、性別、飲食和醫療條件、疾病的嚴重性、給藥途徑、藥理學的考慮如活性、效力、藥物代謝動力學和毒性、是否採用藥物遞送系統以及化合物是否作為藥物組合物的一部分施用。因此，實際採用的劑量方案可有很大不同並可偏離上述的優選劑量方案。優選TFPI或TFPI類似物的給藥速率不應超過相當於ala-TFPI約0.66毫克/千克/小時的給藥速率。低劑量施用當TFPI或TFPI類似物的給藥速率相當於以約0.00025-2.00毫克/千克/小時(0.00417-0.833lig/kg/min)的給藥速率施用ala-TFPI時，可維持治療嚴重肺炎和最低的不良副作用如出血。一優選實施方式中，ala-TFPI以約0.02-1.0毫克/千克/小時的給藥速率施用，更優選為約0.24-0.8毫克/千克/小時。為了改進組合效力和安全性，給藥速率優選相當於約0.010-0.045毫克/千克/小時(0.167-0.833ng/kg/min)的ala-TFPI的給藥速率，或相當於約0.020-0.040毫克/千克/小時的ala-TFPI的給藥速率，最優選相當於約0.025毫克/千克/小時(0.417ug/kg/min)的ala-TFPI的給藥速率。給藥途徑通常為靜脈施用，優選通過連續靜脈輸注。可給予輸注至少約72、96、100、120或240小時。優選給予連續輸注3-8天，更優選3-6天，最優選約4天。"連續輸注"施用意味著以處方規定的大致速率連續輸注，在大部分處方規定的時間內基本不中斷。或者，可採用間歇性靜脈輸注。如果釆用間歇性輸注，那麼應所述採用與上述連續輸注給藥速率相當的平均時間給藥速率。此外，間歇性輸注程序產生的最大血清濃度必須不超過採用持續輸注所獲得的最大濃度的約20%。為了避免給患者帶來不良副作用(具體的副作用包括出血)，給藥速率應低於與持續靜脈輸注約為0.050毫克/千克/小時的ala-TFPI相當的給藥速率。由於用凝血酶原試驗測定蛋白質濃度和生物學活性具有誤差，本文中描述的所有劑量，包括給藥速率和總劑量在實施中均可有10%的差異。因此，實際的施用劑量相比本文所述的劑量高10%或低10%均認為與所述劑量相當。由於所述原因，所有劑量均被稱為"約"某一特定量。例如，稱為"約0.025毫克斤克/小時"的劑量認為與範圍在0.0225-0.0275毫克/千克/小時的任何實際劑量相當。如果低劑量TFPI給藥後，在實施中本發明還可採用TFPI或TFPI類似物的推注或簡單講更快輸注速率。例如，推注或更快輸注速率可用來縮短患者循環系統內施用TFPI或TFPI類似物的平衡時間。這麼做，可更快速地達到TFPI的最終穩態血漿水平且能更快飽和TFPI受體。以約0.025毫克/千克/小時速度給予人2小時ala-TFPI能將TFPI(加ala-TFPI)的血漿水平從約80ng/ml增加到約125ng/ml、或增加約50%。如果加快輸注速率或採用推注能更快到達相同水平。如果持續輸注直到獲得穩態，那麼更快輸注速率將引起更高水平。在患有嚴重細菌感染的患者中，已發現以約0.050毫克/千克/小時施用ala-TFPI所達到的穩態水平為約300ng/ml，而且已發現以約0.33或約0.66毫克/千克/小時施用ala-TFPI為約至少2ug/ml。以單次連續輸注或分多次輸注劑量給予宿主的總日劑量可以如相當於每天施用約0.006mg/kg-1.2mg/kg的ala-TFPI，更常相當於每天施用約0.24mg/kg-1.2mg/kg的ala-TFPI，優選相當於每天約0.6mg/kg的ala-TFPI。這個範圍內的較低量可用於預防或其它目的。超過所述範圍的較高劑量可用於治療嚴重CAP。本發明的劑量方案也可表示為給予患者的總劑量。總劑量是輸注速率和輸注總時間通過數學運算得到的產物。例如，ala-TFPI的優選給藥速率為約0.025毫克/千克/小時，優選輸注時間為96小時，總劑量是約2.4mgala-TFPI/千克體重。一實施方式中，ala-TFPI的優選給克/小時，優選的輸注時間為96小時，總劑量時約24mgala-TFPI/kg體重。一優選實施方式中，ala-TFPI的優選給藥速率為約0.75毫克/千克/小時，優選輸注時間為96小時，總劑量是約72mgala-TFPI/千克體重。另一優選實施方式中，本發明的TFPI給藥總劑量相當於約0.75ug/kg-4.8mg/kg的ala-TFPI。優選總劑量相當於約lmg/kg-4.8mg/kg的ala-TFPI。更優選總劑量相當於約2.4mg/kg的ala-TFPI。一種可用於調節所述劑量方案的因素是各個患者的凝血功能，通常採用凝血酶原時間(PT)試驗或國際標準化比率(INR)進行檢測。INR是標準化的PT試驗，它利用國際參照品促凝血酶原激酶試劑校準所述試驗。參見例如R.S.Riley等,J.Clin丄ab.Anal.l4:101-114(2000)。如圖3所示，健康獻血者對ala-TFPI的INR反應與血漿濃度範圍大致呈線性關係。大體上，血漿ala-TFPI濃度每增加1ug/ml，INR就改變1.2單位。在藥效模型中，INR對ala-TFPI的反應用log線性模型描述最好，其中logINR與ala-TFPI血漿濃度線性相關。所述反應的log線性性質意味著在循環ala-TFPI水平類似的情況下，基線INR高的對象相比低基線值的對象可能發生更高的抗凝血反應。上述包括基於毫克/千克/小時的給藥速率和總日劑量的劑量方案被表示為"相當於參照品ala-TFPI"的劑量。這意味著是通過歸一化為"參照品ala-TFPI"劑量來定量定義它們，所述"參照品ala-TFPI"定義為成熟的、100%純的(基於蛋白質)、正常摺疊的、具生物學活性的、非糖基化的ala-TFPI。Ala-TFPI是其胺基酸序列為SEQIDNO:2所示的TFPI的一種類似物。TFPI的其它形式也可用於本發明，包括成熟的、全長TFPI和其類似物。可通過根據特定形式TFPI的固有生物學活性調整並且基於所述製備物的生物化學純度進一步調整本發明所述的參照品ala-TFPI的劑量範圍來確定用TFPI形式而非ala-TFPI，以及用不到100%純的ala-TFPI或另一種TFPI類似物的製備物來實施本發明所需的合適劑量範圍。一優選實施方式中，患者在接受第一次TFPI施用的IO天內不接受抗凝血劑。優選實施方式中，患者在接受第一次TFPI施用的7天內不接受抗凝血劑。優選患者在接受第一次TFPI施用的24小時內不接受任何形式的肝素。一實施方式中，患者在10小時內，優選在接受第一次TFPI施用的12小時內未接受過未分級的肝素。一實施方式中，患者在20小時內，優選在接受第一次TFPI施用的24小時內未接受過低分子量的肝素。一實施方式中，患者在10小時內，優選在接受第一次TFPI施用的12小時內未接受過drotrecogin-a。TFPI或TFPI類似物的固有生物學活性指成熟的、100%純的、正確摺疊的TFPI或TFPI類似物用凝血酶原實驗確定的特定活性。因此，相當劑量計算如下(參照品ala-TFPI劑量)/((相對固有活性)x(生物化學純度))，其中相對固有活性指(類似物的固有活性)/(參照品ala-TFPI的固有活性)。例如，如果某特定TFPI類似物的固有生物學活性為參照品ala-TFPI的80%，那麼通過用0.8除參照品ala-TFPI的劑量值得到針對特定TFPI類似物的相當劑量。而且，如果施用到患者的製劑例如僅為90%生物化學純，即所含的10%的分子種類缺乏TFPI生物學活性，可用0.9除劑量值對ala-TFPI的參照品劑量值作附加修正。因此，對於具有ala-TFPI80W的固有活性並以90%生物化學純給藥的假定的TFPI類似物而言，其相當於以0.025毫克/千克/小時給藥速度施用參照品ala-TFPI的給藥速率則為0.0347毫克/千克/小時(即0.025/(0.8x0.9))。在不知道固有活性或生物化學純度的情況下也可通過測定相對生物學活性來確定等當量劑量。相對生物學活性可通過用凝血酶原時間試驗比較某特定TFPI類似物與TFPI標準的生物學活性來測定。例如，根據WO96/40784的實施例9方法產生約85%生物學活性TFPI分子種類的ala-TFPI，可用作TFPI生物學活性的標準。根據WO96/40784的實施例9的方法產生的ala-TFPI在凝血酶原實驗中具有85%的參照品ala-TFPI活性。在繪製凝血酶原時間標準曲線時，以log血凝時間對logTFPI濃度繪圖。如果TFPI生物學活性標準具有85%的參照品ala-TFPI活性，那麼如果TFPI生物學活性標準的濃度在製圖前先乘以0.85製備的標準曲線即相當於參照品ala-TFPI的活性曲線，因此所述活性曲線與100%純參照品ala-TFPI的活性相當。當將某特定TFPI類似物的血凝時間與該標準曲線相比較時，可從曲線上讀出參照品ala-TFPI的等當量濃度。或者，如果標準曲線線性部分的斜率是由線性回歸分析得到的，可根據與參照品ala-TFPI相比的TFPI生物學活性標準的活性來修正此斜率。某特定TFPI類似物的相對生物學活性因此等於參照品ala-TFPI活性與該類似物活性之比。例如，如果某特定類似物需要1.43ug才能產生與1.00yg參照品ala-TFPI相同的凝血酶原時間活性，那麼所述類似物的相對生物學活性為1.00/1.43，或0.7。對所述類似物而言，與參照品ala-TFPI劑量等當量的劑量可用該類似物的相對生物學活性除參照品ala-TFPI劑量而得到。例如，參照品ala-TFPI的0.025毫克/千克/小時劑量與該類似物的0.0357毫克/千克/小時(即0.025/0.7)等當量。儘管TFPI或TFPI類似物可作為唯一的活性抗凝藥物施用，但這些分子也可與一種或多種輔助治療劑聯用以提供治療嚴重肺炎的聯合治療。此類輔助治療劑包括抗體如抗內毒素的單克隆抗體(如內毒素結合Mab)和抗TNF產品如抗TNF鼠Mab。TFPI和TFPI類似物還可與白介素1受體拮抗劑、殺菌/通透率增強(BPI)蛋白、免疫刺激劑、具有消炎活性的化合物如PAF拮抗劑和細胞黏附阻斷劑(如抗血小板劑如GPIIb/IIIa抑制齊U)聯用。當聯合施用時，所述治療藥物可配製成同時或不同時間給予的分離組合物。優選輔助治療劑在相同時間(即在TFPI或TFPI類似物給藥期間)或在TFPI或TFPI類似物給藥期間的24小時內(即在TFPI或TFPI類似物的給藥期間開始前24小時內、或結束後24小時內)給予。輔助治療劑也可作為單一組合物與TFPI或TFPI類似物一起給予。TFPI或TFPI類似物還可與對治療嚴重細菌感染尤其是肺炎有效的其它試劑組合給予。例如，以下物質可與TFPI或TFPI類似物聯用能治療基礎性細菌感染的抗生素、針對細菌細胞壁組分的單克隆抗體、能參與嚴重肺炎通路的細胞因子形成複合體的受體、和通常能與細胞因子或其它活化的或放大的生理(反應)通路相互作用的任何藥物或蛋白質，包括能緩解嚴重肺炎和/或其症狀的補體蛋白。有用的抗生素包括以下通用類型中的那些e內醯胺環(盤尼西林)、糖苷鍵連接的氨基糖(氨基葡糖苷)、大環內酯環(大環內酯類)、亞萘基氨甲醯的多環衍生物(四環素)、二氯醋酸的硝基苯衍生物、肽(桿菌肽、短桿菌肽和多粘菌素)、含有共軛雙鍵系統的大環(聚烯)、衍生自磺胺的磺胺藥(氨苯磺胺)、5-硝基-2-呋喃組(硝基呋喃)、喹諾酮羧酸(萘啶酸)等。其它抗生素和上述特定抗生素的更多類型可在《化學技術百禾鬥全書》(EncyclopediaofChemicalTechnology),第3版，Kirk-Othymer(編)，第3巻，第1-78頁，Zinsser;《微生物學》(MicroBiology)，第17版，W.Joldik等(編)，第235-277頁(1980);或Dorland的《醫學字典圖解》(IllustratedMedicalDictionary),27版，W.B.SaundersCompany(1988)中找到。可以與TFPI或TFPI類似物聯用的其它藥物包括內毒素拮抗劑如E5531(—種脂質A類似物，參見Asai等，Biol.Pharm.Bull.22:432(1999))、具有抗凝血活性的TF類似物(參見Kelley等，Blood89:3219(1997)和Lee和Kelley,J.Biol.Chem.273:4149(1998))、針對細胞因子的單克隆抗體如針對IL-6或M-CSF的那些單克隆抗體、參見於1989年12月15日遞交的美國序列號07/451,218、和針對TNF的單克隆抗體(參見Cerami等，美國專利號4,603,106)、能將成熟的TNF激素原從產生它的細胞切下的蛋白質抑制劑(參見1989年8月16日遞交的美國序列號07/395,253)、IL-1拮抗劑(參見1990年5月1日遞交的美國序列號07/517,276)、IL-6細胞因子表達抑制劑如抑制素(參見美國專利5,942,220)和各種細胞因子如IL-1的基於受體的抑制劑。還可採用補體的抗體或補體的蛋白質抑制劑，如CR卜DAF和MCP。本公開說明書中所引用的所有專利、專利申請和參考文獻均以其全文納入本文中作為參考。現在，將通過參閱特別優選實施方式的以下實施例闡述本發明。然而，應注意這些實施方式的目的是說明，不以任何方式解釋為限制本發明。實施例實施例1用ala-TFPI治療嚴重肺炎患者在相對同種組中通過評價患有嚴重肺炎的患者來研究ala-TFPI的潛在作用。如果研究者記錄的一種敗血症來源是肺炎，就可確定肺炎患者。還可能出現其它部位的感染。由於根據化學後遺症來區分感染的困難性，不包括患有吸入性肺炎的患者。然後將確定患有肺炎的患者分成培養陽性(任何感染證據例如培養或Gram染色)或培養陰性(陰性培養或未進行培養)。通過連續靜脈輸注配製於含有300mM的L-精氨酸、20mM的擰檬酸鈉、pH5.5、重量克分子滲透濃度560+/-110mOsm的緩衝液中劑量為0.025mg/kg/h的大腸桿菌表達的非糖基化ala-TFPI來治療患者。相同緩衝液組成的不含ala-TFPI的安慰劑以與研究藥物相同速率輸注。這些分析結果證明ala-TFPI對治療那些培養陽性肺炎患者(表l)有陽性影響。證明對那些沒有感染源證據的患者有陰性影響。表l.各肺炎狀態的死亡率tableseeoriginaldocumentpage23表2.低INR肺炎狀況的死亡率tableseeoriginaldocumentpage23complextableseeoriginaldocumentpage24高INR培養陰性組的死亡率增高看來發生在加有或沒有添加施用肝素的患者群中，儘管應該注意到肺炎培養陰性、無肝素組的對象數目相對少(表3)。在培養陽性/無肝素組中觀察到強陽性治療效果。表3.各肺炎狀態和肝素的死亡率complextableseeoriginaldocumentpage24實施例2研究疾病變量的基線嚴重性評估一定數量疾病變量的基線嚴重性以判斷是否存在組間不平衡可能解釋觀察到的結果。這些數據表明培養狀態相關的結果間的差異不是由於基線不平衡。因此，看來所述結果代表感染或未感染患者生物學差異引起TFPI治療的效果差異。儘管事實是嚴重性指標(例如，APACHEII評分或器官功能障礙評分)要麼在安慰劑時相等或在TFPI治療肺炎培養陰性組中較低，仍然證明培養陰性組的總死亡率最高(表4)。表4complextableseeoriginaldocumentpage24IL-6是一種炎性細胞因子，在敗血症早期即升高，反應炎性應答的強度並且與結果相關。基線時，IL-6水平在臨床診斷患有肺炎但沒有感染證據的患者中較低(表5)。這提示證明有肺炎感染源和無明顯感染源的患者間存在生物學差異。矛盾的是，培養陰性TFPI組的基線IL-6水平最低而死亡率最高。敗血症群中IL-6水平隨時間下降。IL-6的下降速率在TFPI治療的肺炎培養陰性對象中減緩(表5)。這提示TFPI的生物學影響在那些有或沒有感染的患者中不同。表5.各肺炎狀態的IL-6tableseeoriginaldocumentpage25為了進一步限制異質性，對社區獲得性肺炎(CAP)也進行試驗。在醫院患上肺炎的患者(醫院性肺炎)更可能受病原性微生物的侵害並患上其它肺部疾病使得診斷感染行肺炎更困難。而且，CAP患者比醫院性肺炎患者更不可能接受過肝素。當在治療前先對其停留醫院的時間長度進行分析時，注意到住院《天(社區獲得性)的培養陽性患者和住院時間超過2天(醫院性)的患者獲益類似。主要在醫院性組中可看到培養陰性患者中的陰性影響(表8)。表8.肺炎狀態和住院時間的死亡率tableseeoriginaldocumentpage26實施例4肺泡血纖維蛋白沉澱和血纖維蛋白溶液活性的改變是肺炎和急性肺損傷的標誌。組織因子被認為是這個系統中的一種重要的凝固引發劑，組織因子通路抑制劑(TFPI)在動物模型中已被證明能防止或減少肺損傷。重組組織因子通路抑制劑(替法可近)已在多種敗血症中進行過研究並已完成了III期雙盲的安慰劑-對照的隨機試驗(TFP007)。該項研究沒有能夠證明它可顯著減少28天各種原因導致的死亡率。進行後續分析來評價由CAP引起的嚴重敗血症患者是否能用替法可近治癒。同樣，研究了可能的肝素相互作用和微生物證據的重要性。材料和方法TFP007採用的CAP為主要敗血症誘因的患者(pts)被留來進行後續分析。確定所有CAP患者群的28天各種原因導致的死亡率和安全性。進一步分析協同施用肝素對深部靜脈血栓形成預防的影響和微生物證據的重要性。結果TFP007包括1955位患者，其中435位患有CAP(TFPI217，安慰劑218)。TFPI和安慰劑兩組各自的基線特徵類似(平均年齡是62.3比62;平均APACHEII是24.9比24;平均OD是3比3)(NS)。28天各種原因導致的死亡率數據如表9所示。特別是當沒有協同施用肝素並有微生物證據存在時，用替法可近比用安慰劑治療的患者死亡率降低。嚴重出血時間發生在12位治療患者(5.5%)比5位安慰劑患者(2.2。/。)中(NS)。第一個28天周期中，CNS出血在6位替法可近治療患者(2.7%)比2位安慰劑治療患者(1。/0)(NS)出現。表9:協同肝素施用和微生物證據的CAP中28天各種原因導致的死亡率tableseeoriginaldocumentpage27*卡方檢驗；+醫院3存N-對象數；n(%)=〖H尋性肺炎H血(比率)數表9B:TFP007群的TFP007嚴重出血(所有對象)tableseeoriginaldocumentpage27*卡方檢驗；+醫院獲得性肺炎弁N二對象數；11(%)=出血(比率)數表9C:CAP/HAP亞群的TFP007出血(所有對象)tableseeoriginaldocumentpage27*卡方檢驗；+醫院獲得性肺炎弁N-對象數；11(%)=出血(比率)數tableseeoriginaldocumentpage28*卡方檢驗；十醫院獲得性肺炎弁N二對象數；11(%)=出血(比率)數表9E:ME證據的CAP/HAP亞群的TFP007嚴重出血(所有對象)tableseeoriginaldocumentpage284Fisher精確檢驗；十醫院獲得性肺炎弁N二對象數；11(%)=出血(比率)數tableseeoriginaldocumentpage28fFisher精確檢驗；+醫院獲得性肺炎弁N二對象數；11(%)=出血(比率)數tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31tableseeoriginaldocumentpage32tableseeoriginaldocumentpage33tableseeoriginaldocumentpage34tableseeoriginaldocumentpage35tableseeoriginaldocumentpage36tableseeoriginaldocumentpage37tableseeoriginaldocumentpage38表12tableseeoriginaldocumentpage39已經通過參考特定實施方式描述了本發明。然而，在不背離隨附權利要求的精神和範圍時，這一應用包括本領域那些技術人員可進行的那些改變和替換。序列CWU121276PRTHomosapiens1AspSerGluGluAspGluGluHisThrlielieThrAspThrGluLeu151015ProProLeuLysLeuMetHisSerPheCysAlaPheLysAlaAspAsp202530GlyProCysLysAlalieMetLysArgPhePhePheAsnHePheThr354045ArgGinCysGluGluPheHeTyrGlyGlyCysGluGlyAsnGinAsn505560ArgPheGluSerLeuGluGluCysLysLysMetCysThrArgAspAsn65707580AlaAsnArglielieLysThrThrLeuGinGinGluLysProAspPhe859095CysPheLeuGluGluAspProGlylieCysArgGlyTyrHeThrArg100105110TyrPheTyrAsnAsnGinThrLysGinCysGluArgPheLysTyrGly115120125GlyCysLeuGlyAsnMetAsnAsnPheGluThrLeuGluGluCysLys130135140AsnlieCysGluAspGlyProAsnGlyPheGinValAspAsnTyr165170175ValProSerLeuPheGluPheHisGlyProSerTrpCysLeuThrPro180185190AlaAspArgGlyLeuCysArgAlaAsnGluAsnArgPheTyrTyrAsn195200205SerVallieGlyLysCysArgProPheLysTyrSerGlyCysGlyGly210215220AsnGluAsnAsnPheThrSerLysGinGluCysLeuArgAlaCysLys225230235240LysGlyPhelieGinArglieSerLysGlyGlyLeulieLysThrLys245250255ArgLysArgLysLysGinArgValLysHeAlaTyrGluGluliePhe260265270ValLysAsnMet2752277PRTHomosapiens2AlaAspSerGluGluAspGluGluHisThrlielieThrAspiThrGlu151015LeuProProLeuLysLeuMetHisSerPheCysAlaPheLysAlaAsp202530AspGlyProCysLysAlalieMetLysArgPhePhePheAsnliePhe354045ThrArgGinCysGluGluPhelieTyrGlyGlyCysGluGlyAsnGin505560AsnArgPheGluSerLeuGluGluCysLysLysMetCysThrArgAsp65707580AsnAlaAsnArglielieLysThrThrLeuGinGinGluLysProAsp85卯95PheCysPheLeuGluGluAspProGlyHeCysArgGlyTyrlieThr100105110ArgTyrPheTyrAsnAsnGinThrLysGinCysGluArgPheLysTyr115120125GlyGlyCysLeuGlyAsnMetAsnAsnPheGluThrLeuGluGluCys130135140LysAsnlieCysGluAspGlyProAsnGlyPheGinValAspAsnTyr145150155160GlyThrGinLeuAsnAlaValAsnAsnSerLeuThrProGinSerThr165170175LysValProSerLeuPheGluPheHisGlyProSerT卬CysLeuThr180185190ProAlaAspArgGlyLeuCysArgAlaAsnGluAsnArgPheTyrTyr195200205AsnSerVallieGlyLysCysArgProPheLysTyrSerGlyCysGly210215220GlyAsnGluAsnAsnPheThrSerLysGinGluCysLeuArgAlaCys225230235240LysLysGlyPheHeGinArglieSerLysGlyGlyLeuHeLysThr245250255LysArgLysArgLysLysGinArgValLysHeAlaTyrGluGlulie260265270PheValLysAsnMet27權利要求1.一種治療或預防嚴重肺炎的方法，包括通過連續靜脈輸注給予患有或有患嚴重肺炎風險的患者TFPI或TFPI類似物，給藥速率等效於以小於約1.0毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI，並且所述患者在給予TFPI或TFPI類似物的24小時內未接受過抗凝血藥物。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述患者已被證明有感染。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物通過連續靜脈輸注給藥，給藥速率等效於以小於約0.80毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.025-0.10毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI，並且給予所述TFPI或TFPI類似物至少約72小時。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.010-0.10毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.020-0.08毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，給予所述TFPI或所述TFPI類似物至少96小時。11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。12.如權利要求IO所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物通過連續靜脈輸注給予以提供一總劑量，所述總劑量等效於以約0.025-2.5mg/kg的總劑量給予參照品ala-TFPI。13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。14.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物通過連續靜脈輸注給予，給藥速率等效於以約0.02-0.09毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物通過連續靜脈輸注給予以提供一日劑量，所述日劑量等效於以約0.06-4mg/kg的日劑量給予參照品ala-TFPI。17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-丁FPI。18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物包含由SEQIDN0:1的胺基酸19-89組成的第一Kunitz結構域。19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物還包含由SEQIDN0:1的胺基酸90-160組成的第二Kunitz結構域。'20.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物包含SEQIDN0:1的胺基酸1-160。21.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物包含由SEQIDNO:l的胺基酸90-160組成的第二Kunitz結構域。22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。23.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物是由含有TFPI或TFPI類似物的凍幹組合物製備出的。24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。25.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物作為含有'精氨酸的製劑給藥。26.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-丁FPI。27.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物作為含有檸檬酸鹽的製劑給藥。28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。29.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物在包含約300mM精氨酸鹽酸化物和約20mM擰檬酸鈉並具有約5.5的pH的製劑中的濃度約'為0.15mg/ml。30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。31.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，還包括在給予所述TFPI或TFPI類似物同時或24小時內給予以下另外的物質抗生素、抗體、內毒素拮抗劑、具有抗凝血活性的組織因子類似物、免疫興奮劑、細胞粘附細胞粘附阻斷劑、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗劑、pafase(PAF酶抑制劑)、TNF抑制劑、IL-6抑制劑和補體的抑制劑。32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala國TFPI。33.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述另外的物質是抗體，所述抗體特異性結合抗原TNF、IL-6和M-CSF。34.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。35.—種治療嚴重肺炎的方法，包括給予患者(i)TFPI或TFPI類似物和(ii)選自抗生素、單克隆抗體、細胞因子抑制劑和補體抑制劑的另外的物質。36.如權利要求35所述的方法，其特徵在於，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。37.如權利要求35所述的方法，其特徵在於，所述患者已被證明有感染。38.如權利要求35所述的方法，其特徵在於，所述TFPI或TFPI類似物通過連續靜脈輸注給藥，給藥速率等效於以小於約1.0毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。39.如權利要求38所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.001-0.090毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.002-0.050毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。41.如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.002-0.010毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。42.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述給藥速率等效於以約0.0025-0.075毫克/千克/小時的給藥速率給予參照品ala-TFPI。43.—種治療或預防嚴重肺炎的方法，包括給予患有或有患嚴重肺炎風險的人類患者不會誘發過量出血的量的TFPI或TFPI類似物。全文摘要預防性或治療性治療嚴重肺炎的方法，包括給予患有或有患所述疾病風險的患者組織因子通路抑制劑(TFPI)或TFPI類似物。所述方法包括利用TFPI或TFPI類似物連續靜脈輸注，優選以低劑量輸注以避免不良副作用。文檔編號A61K38/57GK101180074SQ200680017339公開日2008年5月14日申請日期2006年4月14日優先權日2005年4月15日發明者A·克裡西申請人:諾華疫苗和診斷公司