神經營養因子的製作方法

2023-06-05 19:13:26 1

專利名稱：神經營養因子的製作方法
背景技術：
本發明涉及神經營養因子多肽，編碼神經營養因子多肽的核酸和特異性結合神經營養因子的抗體。
背景技術：
神經營養因子是天然蛋白質，它可促使神經元細胞和組織的存活，維持其表型分化，防止其退化並增強其活性。神經營養因子分離自神經組織和由神經系統支配的非-神經組織，並被分為功能和結構相關的組，也稱家族，超家族或亞族。神經營養因子超家族包括成纖維細胞生長因子，神經營養蛋白和轉化生長因子-β(TGF-β)超家族。可根據其物理結構，與其複合受體的相互作用及其對多種類型神經細胞的影響來區分各種神經營養因子。被分在TGF-β超家族(Massague等，Trends in Cell Biology,1994,4 172-178)的是得自膠質細胞系的神經營養因子配體(「GDNF」；WO93/06116，列入本文作為參考)，其包括GDNF,persephin(「PSP」；Milbrandt等，神經元，1998 20 245-253，列入本文作為參考)和neurturin(「NTN」；WO97/08196，列入本文作為參考)。GDNF亞族的配體都能通過RET受體酪氨酸激酶誘導信號傳遞。GDNF亞族的這三種配體對神經營養受體家族，GFR受體的相對親和性有所不同。
鑑於神經營養因子對神經元組織的影響，仍需要鑑定和表徵其它神經營養因子以用於診斷和治療神經系統疾病。
發明簡述本發明涉及新的神經營養因子，本文稱之為「neublastin」，或「NBN」。neublastin屬於GDNF亞族的成員，因為它與其它GDNF配體共享同源性區域(見下文表3和4)，並能與RET相互作用(例見Airaksinen等，Mol.Cell.Neuroscience,1999 13 313-325),neublastin是新的，獨特的神經營養因子。與其它GDNF配體不同的是，neublastin表現出與GFRα3-RET受體複合物的高親和性，而且，其胺基酸序列中具有獨特的亞區。
本文所用「neublastin多肽」是具有神經營養活性的多肽(如實施例6,7,8和9所述)，其包括具有與人「neublastin」多肽的同源性至少為70％的胺基酸序列的多肽及其變體和衍生物，所述人「neublastin」多肽示於SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ ID NO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140(pro),SEQID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(「野生型」prepro),SEQ ID NO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ ID NO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ IDNO:12的AA1-AA113(成熟的113AA)。另外，本發明還包括具有與鼠「neublastin」多肽的同源性至少為70％的胺基酸序列的多肽，所述鼠「neublastin」多肽示於SEQ ID NO:16的AA1-AA224。
上文所鑑定的neublastin多肽的C-末端序列優選具有SEQ IDNO:2的AA72-AA105(即SEQ ID NO:9的AA107-AA140)所示的胺基酸序列，更優選具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105(即SEQ ID NO:9的AA76-AA140)所示的胺基酸序列，或SEQ ID NO:16的AA191-AA224所示的胺基酸序列。
另外，優選neublastin多肽保留7個保守的Cys殘基，所述殘基是GDNF家族和TGF-β超家族所特有的殘基。
優選neublastin多肽具有與上述序列和SEQ ID NO:16的AA1-AA224的同源性大於85％，最優選大於95％的胺基酸序列，上述序列即為SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ IDNO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140,SEQ ID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(「野生型」prepro),SEQ IDNO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ ID NO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:12的AA1-AA113(成熟的113AA)。
本文所用「neublastin核酸」是編碼neublastin多肽的多核苷酸。因此，分離的neublastin核酸是具有核苷酸密碼子開放閱讀框的多核苷酸分子，當其暴露於翻譯所需的適當組分中時可編碼neublastin多肽。本發明的neublastin核酸可以是RNA或DNA，例如基因組DNA，或與neublastin mRNA互補和/或由其轉錄的DNA(「cDNA」)。因此，本發明的neublastin核酸還包括在高度嚴緊的雜交條件下與編碼neublastin多肽的多核苷酸特異性雜交的多核苷酸分子。本發明還涉及核酸引物或其片段，所述引物可用於鑑定，分離和擴增編碼neublastin多肽的多核苷酸。在本發明的某些實施方案中，某些引物是neublastin-特異性的探針，所述探針可用於與neublastin核酸雜交，而不與編碼GDNF家族其它成員的核酸雜交。「特異的」，「特異性」或「特異地」指的是能與neublastin核酸雜交，而不能與非-neublastin核酸雜交，包括不能與編碼GDNF配體(例如GDNF,persephin和neurturin)的獨特核酸雜交。
在另一個實施方案中，通過具有互補核酸序列，或闡明它能在高度嚴緊的雜交條件下與編碼neublastin的多核苷酸特異性雜交，而將本發明的neublastin核酸鑑定為與編碼neublastin多肽的多核苷酸互補的核酸。特定的neublastin核酸包括但不限於本文所示的核酸序列和SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30以及引物SEQID NO:17-28,31和32所示的核酸序列。本發明的neublastin核酸還包括neublastin核酸獨特的亞區域或片段，包括但不限於圖8所示的核酸片段。
可使用本發明的neublastin核酸表達neublastin多肽，例如通過體外表達neublastin多肽，或通過給動物施用neublastin核酸以在體內表達。neublastin核酸可包含在諸如表達載體或克隆載體的核酸載體中。neublastin核酸可以，但不是必須作為核酸載體的一部分被維持，複製，轉移或表達。可將含有neublastin多核苷酸序列的重組表達載體導入細胞和/或在所述細胞中維持。neublastin載體的宿主細胞可以是原核細胞。或者，可將neublastin核酸導入真核細胞，例如含有適當元件的真核細胞，所述元件負責在翻譯後將多肽加工成成熟的蛋白質和/或負責將多肽分泌至細胞的胞外環境中。
本發明還涉及neublastin類神經營養因子「neublastin」。neublastin可以是多肽的形式，也可以是兩個或多個neublastin多肽的多聚體，例如neublastin二聚體。neublastin多肽通過本領域技術人員公知的分子間結構連鍵連接成多聚體，所述連鍵包括但不限於半胱氨酸-半胱氨酸相互作用，sulmydryl鍵和非-共價相互作用。特定neublastin多肽包括但不限於本文所公開的胺基酸序列和SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列。
本發明的neublastin多肽可用於治療神經元缺陷，包括但不限於受損害的神經元和受外傷的神經元。受外傷的外周神經包括但不限於髓神經或脊髓神經。neublastin多肽可用於治療神經變性疾病，例如大腦局部缺血性神經元損傷；神經病，例如外周神經病，阿爾茨海默氏病，亨廷頓氏病，帕金森氏病，肌萎縮性側索硬化(ALS)。neublastin多肽還可用於治療記憶減退，例如與痴呆有關的記憶減退。
附圖簡述

圖1是與32P-標記的neublastin cDNA雜交的2個Northern印跡的照片，照片中比較了neublastin基因在多種成人組織類型(A系列)和多個成人腦區(B系列)中的相對表達水平。
圖2是與32P-標記的neublastin cDNA雜交的Northern印跡照片，照片中比較了neublastin cDNA在未經轉染的細胞系HiB5，經neublastin cDNA轉染的細胞系和經GDNF-cDNA轉染的細胞系中的表達量。
圖3是與neublastin-特異性抗體Ab-2(左印跡；A序列)或與neublastin-特異性抗體Ab-1(右印跡；B序列)雜交的2個Western印跡的照片，照片中比較了neublastin蛋白在未經轉染的HiB5細胞(泳道1)和經neublastin cDNA穩定轉染的HiB5細胞系(泳道2)中的表達水平。
圖4圖示了neublastin在無血清培養基中對經培養的大鼠胚胎神經元，多巴胺能神經元，前側中腦神經元的存活，和對膽鹼能顱神經運動神經元的ChAT活性的影響。尤其是，圖4A闡明了重組GDNF對ChAT活性(dpm/小時)之影響的劑量-反應曲線。圖4B使用經稀釋的得自生產neublastin或生產GDNF之細胞的條件培養基闡明了ChAT活性(dpm/小時)。圖4C闡明了每孔中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數目。
圖5闡明了HiB5pUbi1zNBN22細胞分泌的neublastin對與HiB5pUbi1zNBN22細胞(neublastin)或HiB5細胞(對照)共培養的豬胚胎多巴胺能前側中腦神經元之切片培養物的功能和存活的影響。圖5A和圖5B分別闡明了於DIV12[多巴胺(pmol/ml)-第12天]和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天]釋放至培養基中的多巴胺。圖5C闡明了於DIV21切片培養物中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數目[TH-ir細胞/培養物]。
圖6闡明了由慢病毒產生的neublastin在體內對黑質多巴胺神經元的影響。
圖7圖示了neublastin基因的基因組結構，包括可用於鑑定全長neublastin基因的核酸引物及其相對於編碼neublastin的基因組序列(即基因)的空間定向。
圖8闡明了用於鑑定編碼人neublastin多肽之cDNA克隆的neublastin特異性引物，該引物能與編碼neublastin多肽的核酸雜交，但不能與編碼其它已知的GDNF家族成員(即GDNF,persephin和neurturin)的核酸雜交。
圖9闡明了與已知神經營養因子相比，本發明的多肽對得自不同發育階段的經解離的大鼠側根神經節細胞培養物的神經營養活性
。
圖10顯示了CHO細胞系的neublastin生產情況。
圖11比較了neublastin和GDNF與GFRα-1和GFRα-3受體的結合。
圖12是Western印跡照片，顯示出R30抗-肽抗體和R31抗-肽抗體與neublastin的結合。
圖13是凝膠照片，顯示出通過親和結合於RETL3-Ig來提取neublastin。
圖14是pET19b-Neublastin的質粒圖譜以及Neublastin合成基因的序列。
圖15是pMJB164-HisNeublastin的質粒圖譜以及HisNeublastin合成基因的序列。
發明詳述申請人已鑑定出編碼新的神經營養因子(本文稱之為「neublastin」或「NBN」)的核酸。neublastin屬於神經營養因子的轉化生長因子-β(TGF-p)超家族，並且是其中得自膠質細胞系的神經營養因子(GDNF)亞類的成員。
編碼neublastin的cDNA最初是按下述鑑定的。使用TBLASTN1.4.11算法規則(Atschul等，核酸研究，1997,25 3389-3402)，對人persephin(GenBank登記號AF040962)表示懷疑，首先在2個人細菌人工染色體(BAC)的高通量基因組序列(HGTS)中鑑定出290bp的片段，這2個BAC的GenBank登記號為AC005038和AC005051。 AC005038由約190,000bp的5個非順序序列重疊群組成，AC005051由約132,000bp的12個非順序序列重疊群組成。經證實，在2個BAC克隆中鑑定的290bp片段具有與神經營養因子，人persephin的cDNA編碼區同源但不相同的區域。
由該290bp序列合成2個Neublastin-特異性PCR引物(上鏈引物[SEQ ID NO:17]和下鏈引物[SEQ ID NO:18])。篩選人胎腦cDNA文庫，最初的篩選包括使用2個PCR引物[SEQ ID NO:17和18]，基於96孔PCR篩選cDNA文庫「主平板」，所述主平板由含有約5,000個克隆/孔的500,000個cDNA克隆組成。對人胎腦cDNA文庫「次平板」進行第二次基於PCR的篩選，所述「次平板」每孔含有約5,000個克隆的大腸桿菌甘油原種。
在基於PCR篩選主平板和次平板時鑑定出102bp的片段[SEQ IDNO:13]，選擇陽性cDNA克隆(具有102bp片段)，鋪於2個含有LB/抗生素的平板，培養過夜。從這些平板中總共選擇出96個細菌菌落，將它們各自置於新的96孔PCR板的孔中，每個孔中含有兩種PCR引物[SEQ ID NO:17和18]和必需的PCR擴增試劑。然後進行PCR擴增，通過2％瓊脂糖凝膠電泳分析96個獨立的PCR反應。然後鑑定具有含102bp片段之克隆的陽性菌落。由含有102bp片段的陽性菌落得到質粒DNA並測序。隨後的測序分析揭示出861bp的全長cDNA[SEQ IDNO:8]的存在。在SEQ ID NO:8中鑑定的663bp開放閱讀框(ORF)或編碼區(CDS)編碼前-多肽原(稱為「前-Neublastin原」)，其示於SEQ IDNO:9。根據SEQ ID NO:9，鑑定出3個Neublastin多肽變體，這些變體包括(ⅰ)本文稱之為NBN140的140AA多肽，其具有SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列；(ⅱ)本文稱之為NBN116的116AA多肽，其具有SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列；和(ⅲ)本文稱之為NBN113的113AA多肽，其具有SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
含有782bp 5』非翻譯DNA,663bp編碼DNA和447bp 3』非翻譯DNA(總共為19926p)的完整cDNA序列已被呈送至GenBank，登記號為AF120274。
按下述鑑定基因組中的Neublastin編碼序列為了克隆基因組中的neublastin編碼序列，製備了另一套引物，具體包括1號引物對[有義=SEQ ID NO:23，反義=SEQ ID NO:24]和2號引物對[有義=SEQ ID NO:25，反義=SEQ ID NO:26]。
使用2號引物對，通過PCR由人基因組DNA製品擴增887bp DNA片段，並克隆至pCRⅡ載體(Invitrogen)，然後轉化至大腸桿菌。對所得質粒進行測序，推測出861bp的推定cDNA序列(編碼在本文中被稱為neublastin的蛋白質)(如SEQ ID NO:3所示)。類似地，使用1號引物對，通過對人基因組DNA進行PCR而得到870bp的DNA片段。在此片段中發現了位於開放閱讀框(ORF)3』末端的42bp區域，相對於887bp序列而言，該區域是額外的。通過將neublastin基因與其它神經營養因子的核酸序列相比較，並作圖外顯子-內含子邊界序列即可推測出該基因的基因組結構。此分析闡明neublastin基因具有至少兩個被70bp內含子分開的外顯子。
另外，使用此序列篩選GenBank中的neublastin EST序列。鑑定出3個這樣的序列，它們的GenBank登記號為AA844072,AA931637和AA533512，這表明neublastin核酸被轉錄成mRNA。
將所得的完整cDNA序列(AF120274)和GenBank登記號為AC005038和AC005051的基因組序列相比較，結果表明neublastin基因由至少5個被4個內含子分開的外顯子(包括3個編碼外顯子)組成(例見圖8)。總之，外顯子具有全長Neublastin多肽的推測胺基酸序列。還應說明的是，我們發現887bp的片段含有完整的neublastin原編碼區。推測的cDNA[SEQ ID NO:3]含有編碼neublastin原的開放閱讀框(ORF)(181個胺基酸殘基)，其顯示出與3個已知的人蛋白質-Persephin,Neurturin和GDNF的同源性。本發明的neublastin核酸另一方面，本發明提供了能表達本發明多肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸包括DNA,cDNA和RNA序列以及反義序列，並包括天然的，合成的和經人為改造的多核苷酸。本發明的多核苷酸還包括因遺傳密碼所致的簡併序列，但該序列仍編碼neublastin多肽。
本文所定義的術語「多核苷酸」指的是長度至少為10個鹼基，優選長度至少為15個鹼基的核苷酸聚合物形式。「分離的多核苷酸」指的是不與兩個編碼序列緊鄰的多核苷酸，而在分離得到該多核苷酸之生物體的天然基因組中，該多核苷酸與上述兩個編碼序列(一個在5』端，一個在3』端)緊鄰。因此，該術語包括重組DNA，它可摻入表達載體，自我複製的質粒或病毒，或原核生物或真核生物的基因組DNA中，它也可以是獨立的分子，例如不依賴於其它序列的cDNA。
本發明的多核苷酸還包括等位基因變體和「突變的多核苷酸」，其具有的核苷酸序列與本文所提供的核苷酸序列在一個或多個核苷酸位置處有所不同。
在優選的實施方案中，本發明的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列能在如下文詳述的至少中度，中度/高度，或高度嚴緊的條件下，與SEQID NO:1所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，或SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞序列雜交。
在另一個優選的實施方案中，本發明的分離的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列與SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，或SEQ IDNO:15所示的多核苷酸序列至少70％，優選至少80％，更優選至少90％，最優選至少95％同源。
在最優選的實施方案中，多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的DNA序列，SEQ ID NO:3所示的DNA序列，SEQ ID NO:8所示的DNA序列，或SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列。
本發明還提供了新的引物和DNA序列，它們可用於鑑定，分離和擴增編碼neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。所述引物包括SEQ ID NO:17-28和31-32所示的多核苷酸。另外，本發明還提供了由這些引物產生的neublastin DNA序列，包括SEQ ID NO:13和14所示的序列。另外，本發明還提供了得自基因組DNA中的3』或5』非翻譯區域(「UTR」)的DNA序列，該序列側翼於neublastin外顯子；該序列可用於鑑定，分離和擴增編碼neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。
本發明的3』UTR序列包括下列序列:
SEQ ID NO:1的核苷酸721-865，SEQ ID NO:3的核苷酸718-861，SEQ ID NO:8的核苷酸718-861，SEQ ID NO:15的核苷酸1647-2136，和得自(即包含於)上述序列中的長度為10至25個核苷酸的鄰接序列(可用作引物)。
本發明的5』UTR序列包括下列序列SEO ID NO:1的核苷酸1-10，SEQ ID NO:8的核苷酸1-57，SEQ ID NO:15的核苷酸1-974，和得自(即包含於)上述序列中的長度為10至25個核苷酸的鄰接序列(可用作引物)。
優選通過克隆方法得到本發明的多核苷酸，所述方法例見「最新分子生物學方法」[John Wiley Sons公司]。在優選的實施方案中，可由人腦的人基因組DNA或cDNA文庫克隆多核苷酸，或者在所述文庫的基礎上產生多核苷酸。DNA序列的同源性可將上文所提及的DNA序列同源性測定為兩個序列之間的同一性程度，示出第一個序列與第二個序列的差異。利用本領域已知的電腦程式可適當地測定同源性，所述程序包括例如GCG程序包中提供的GAP[Needleman,S.B和Wunsch C.D.,分子生物學雜誌1970,48:443-453]。使用具有下列設置的GAP進行DNA序列比較GAP產生罰分為5.0,GAP延伸罰分為0.3，上文所提及的類似DNA序列編碼區與SEQ ID NO:1所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQ IDNO:3所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQ ID NO:8所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQ ID NO:15所示DNA序列的CDS(編碼)部分的同一性程度優選至少為70％，更優選至少為80％，更優選至少為90％，更優選至少為95％。
術語「序列同一性」指的是在特定的比較區域內，兩個多核苷酸序列在核苷酸-緊接著-核苷酸的基礎上的相同程度。術語「序列同一性的百分比」是通過下列方法計算的，即比較兩個在比較區域內排列得最令人滿意的序列，測定在兩個序列中出現相同核酸鹼基(例如A,T,C,G,U或I)的位置數以產生匹配位置數，用匹配位置數除以比較區域內的位置總數(即窗口大小)，將結果乘以100即產生序列同一性的百分比。本文所用術語「基本上相同」表示多核苷酸序列的特徵，其中，多核苷酸含有的序列在比較區域內與參照序列相比具有至少80％的序列同一性，優選為至少85％的同一性，經常為90至95％的序列同一性，更通常為至少99％的序列同一性。雜交方法本發明的多核苷酸所具有的核酸序列能在如下文詳述的至少中度，中度/高度，或高度嚴緊的條件下，與SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，或SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，或SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，或其互補鏈，或其亞序列雜交。
測定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的適當實驗條件包括預先在5×SSC[氯化鈉/檸檬酸鈉；參見Sambrook等；分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約1989]中將含有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜浸泡10分鐘，在5×SSC,5×Denhardt’s溶液[參見Sambrook等，文獻同上],0.5％SDS和100μg/ml變性的經超聲處理的鮭精DNA[參見Sambrook等，文獻同上]中預雜交濾膜，接著於約45℃，在含有10ng/ml探針的相同溶液中雜交12小時，所述探針為隨機-引發的[Feinberg A P Vogelstein B；分析生物化學，1983,132,6-13]，並經32P-dCTP-標記(比活＞1×109cpm/μg)的探針。然後在溫度至少為60℃(中度嚴緊條件)，優選至少為65℃(中度/高度嚴緊條件)，更優選至少為70℃(高度嚴緊條件)，甚至更優選至少為75℃(很高的嚴緊條件)時，在0.1×SSC,0.5％SDS中將濾膜洗滌2次，時間長達30分鐘。使用X-射線膠片可檢測到在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。克隆的多核苷酸尤其是，本發明的分離的多核苷酸可以為克隆的多核苷酸。本文所定義的術語「克隆的多核苷酸」指的是根據基因工程領域最新使用的標準克隆方法克隆的多核苷酸或DNA序列，所述克隆方法可以將DNA區段，尤其是cDNA，即通過酶的作用由RNA產生的cDNA從其天然位置移位至不同位點，在所述位點處，該DNA區段可以再生。
通過任何適當的途徑都可以完成克隆，包括例如逆轉錄酶技術，PCR技術等，以及切下和分離所需的DNA區段。
本發明的克隆的多核苷酸也可被稱為「DNA構建體」或「分離的DNA序列」，尤其可以是互補DNA(cDNA)。生物來源本發明的分離的多核苷酸可以得自任何適當的來源。
在優選的實施方案中，本發明的多核苷酸克隆自下列cDNA文庫，或在這些文庫的基礎上產生，所述文庫包括得自下列的cDNA文庫，例如胎兒或成人腦，尤其是前腦，後腦，皮質，紋狀體，扁桃體，小腦，尾狀核，胼胝體，海馬，丘腦核，丘腦下核，溴核，豆狀核，黑質，側根神經節，三叉神經神經節，腸繫膜上動脈或丘腦；脊髓；心臟；胎盤；肺；肝臟；骨骼肌；腎臟；胰腺；腸；眼；視網膜；牙髓；毛囊；前列腺；垂體；或氣管。
可商購的多種人和非人組織的cDNA文庫得自例如Stratagene和Clontech。可通過標準方法，例如工作實施例中所述的那些方法得到本發明的分離的多核苷酸。本發明的neublastin多肽如上文所述，本文所用「neublastin多肽」是具有神經營養活性的多肽(如實施例6,7,8和9所述)，其包括具有與「neublastin」多肽的同源性至少為70％的胺基酸序列的多肽及其變體和衍生物，所述「neublastin」多肽示於SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ ID NO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140,SEQ ID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(「野生型」prepro),SEQ ID NO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ ID NO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:12的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:16的AA1-AA224(鼠prepro)。
上文所鑑定的neublastin多肽的C-末端序列優選具有SEQ IDNO:2的AA72-AA105(即SEQ ID NO:9的AA107-AA140)所示的胺基酸序列，更優選具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105(即SEQ ID NO:9的AA76-AA140)所示的胺基酸序列。
另外，優選neublastin多肽保留7個保守的Cys殘基，所述殘基是GDNF家族和TGF-β超家族所特有的殘基。
優選neublastin多肽具有與上述序列的同源性大於85％，最優選大於95％的胺基酸序列，上述序列即為SEQ ID NO:2的AA-95-AA105,SEQ ID NO:2的AA1-AA105,SEQ ID NO:4的AA-97-AA140,SEQ ID NO:4的AA-41-AA140,SEQ ID NO:4的AA1-AA140,SEQ ID NO:9的AA-80-AA140(「野生型」prepro),SEQ ID NO:9的AA-41-AA140(pro),SEQ IDNO:5的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:6的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:7的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:10的AA1-AA140(成熟的140AA),SEQ ID NO:11的AA1-AA116(成熟的116AA),SEQ ID NO:12的AA1-AA113(成熟的113AA),SEQ ID NO:16的AA1-AA224(鼠prepro),具有上文所鑑定的neublastin多肽之C-末端序列的上述任一多肽優選具有SEQ ID NO:2的AA72-AA105(即SEQ IDNO:9的AA107-AA140)所示的胺基酸序列，更優選具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105(即SEQ ID NO:9的AA76-AA140)或SEQ ID NO:16的AA191-AA224所示的胺基酸序列。
另外，本發明包括具有與鼠「neublastin」多肽的同源性至少為70％的胺基酸序列的多肽，所述鼠「neublastin」多肽示於SEQ ID NO:16的AA1-AA224。
在一個實施方案中，本發明優選的多肽為neublastin的前序列原(分別示於SEQ ID NO:2,4,9和16)，序列原(分別示於SEQ ID NO:2的AA-75-AA105，或SEQ ID NO:4和9的AA-41-AA140)和成熟序列(示於SEQ ID NO:5,6,7,10,11或12，優選為SEQ ID NO:10,11,12)。
本發明的多肽包括變體多肽。在本發明的上下文中，術語「變體多肽」指的是多肽(或蛋白質)具有的胺基酸序列與SEQ ID NO:2,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16所示的序列在一個或多個胺基酸位置處有所不同。這種變體多肽包括上文所述的經修飾多肽，以及保守取代，剪接變體，同種型，得自其它物種的同系物和多態性。
本文所定義的術語「保守取代」表示某個胺基酸殘基被另一個生物特性相似的殘基所取代。例如，人們希望保守的胺基酸取代僅對生物活性有很小的影響或沒有影響，當保守取代佔多肽或蛋白質殘基總數的10％以下時，更希望如此。保守的胺基酸取代優選為低於5％的多肽或蛋白質中的變化，最優選為低於2％的多肽或蛋白質中的變化(例如當根據NBN113進行計算時，最優選的保守取代為野生型成熟胺基酸序列中少於3個的胺基酸取代)。在特別優選的實施方案中，成熟序列中僅有單個胺基酸取代，其中被取代的和取代的胺基酸都是非-環形的。
其它特別保守的取代例子包括用一個諸如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸的疏水殘基取代另一個疏水殘基，或用一個極性殘基取代另一個極性殘基，如用精氨酸取代賴氨酸，用穀氨酸取代天冬氨酸，或用穀氨醯胺取代天冬醯胺等。
術語保守取代也包括使用經取代的胺基酸殘基取代未經取代的親代胺基酸殘基，只要針對經取代多肽而產生的抗體也能與未經取代的多肽發生免疫反應即可。
修飾該原始胺基酸序列可產生活性與未經修飾的相應多肽基本上相同的蛋白質，因此，可認為該蛋白質是親代蛋白質的功能類似物。所述修飾可以是有意的，例如通過定點誘變，或者可以自發產生，所述修飾包括剪接變體，同種型，得自其它物種的同系物和多態性。本發明還包括上述功能類似物。
此外，修飾原始胺基酸序列可產生未保留親代蛋白質之生物活性的蛋白質，包括顯性失活形式等。顯性失活蛋白質通過結合，或要不然螯合通常與多肽發生功能性相互作用的調節劑(如上遊或下遊組分)來幹擾野生型蛋白質。本發明也包括這種顯性失活形式。
「信號肽」是肽序列，它可使新合成的與信號肽結合的多肽定位於內質網(ER)以進行進一步的翻譯後加工和分布。
對neublastin而言，本文所用「異源信號肽」指的是非人neublastin信號肽，一般指的是一些除neublastin之外的哺乳動物蛋白質的信號肽。
熟練技術人員會認為可使用人neublastin DNA序列(cDNA或基因組DNA)，或使用因沉默密碼子變化或產生保守胺基酸取代的密碼子變化而與人neublastin DNA有所不同的序列對經培養的人細胞進行基因修飾，以使所述細胞能過量表達和分泌酶。
本發明的多肽還包括嵌合多肽或可裂解的融合多肽，所述融合多肽中的另一種多肽與多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發明的核酸序列(或其部分)融合即可產生嵌合多肽。
產生嵌合多肽的技術是標準技術。所述技術通常需要以一定的方式連接序列以使兩個序列位於相同的閱讀框中，並且，融合多肽的表達處於相同啟動子和終止子的控制之下。
本發明的多肽還包括全長neublastin分子的截短形式。在該截短分子中，一個或多個胺基酸從N末端或C末端，優選從N末端缺失。胺基酸序列同源性候選多肽與本發明的neublastin多肽的同源性程度被測定為兩個胺基酸序列之間的同一性程度。高水平的序列同一性表示第一個序列很可能得自第二個序列。
通過計算機分析可測定同源性，所述程序例如但不限於ClustalX計算機序列對比程序[Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,Jeanmougin F, Higgins DG:ClustalX windows界面藉助於質量分析工具進行多個序列對比的靈活策略；核酸研究，1997,25(24):4876-82],本文建議了其預設參數值。使用該程序，由本發明的類似DNA序列所編碼多肽的成熟部分與本文SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16所示胺基酸序列的同一性程度至少為90％,更優選至少為95％，最優選至少為98％。
根據同源性的檢測結果，證實屬於TGF-β超家族的本發明多肽與GDNF亞族相關，但本發明的多肽是該亞族中的一個與眾不同的成員。生物活性多肽可以任何生物活性形式提供本發明的多肽，包括前-蛋白質原，蛋白質原，成熟蛋白質，糖基化蛋白質，磷酸化蛋白質或任何其它經翻譯後修飾的蛋白質。
本發明的多肽尤其可以是N-糖基化多肽，優選該多肽在序列表所示的N-殘基處糖基化。
在優選的實施方案中，本發明的多肽具有SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬醯胺殘基；SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬醯胺殘基；SEQ IDNO:11所示的胺基酸序列，在第98位具有糖基化的天冬醯胺殘基；或SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列，在第95位具有糖基化的天冬醯胺殘基。
本發明還包括neublastin融合蛋白，例如Ig-融合蛋白，例見美國專利5,434,131(列入本文作為參考)。
在一個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:2所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:2所示序列至少約85％，優選至少約90％，更優選至少約98％，最優選至少約99％同源之胺基酸序列的多肽。
在另一個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:4所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:4所示序列至少約90％，優選至少約95％，更優選至少約98％，最優選至少約99％同源之胺基酸序列的多肽。
在第三個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:5所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:5所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
在第四個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:6所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:6所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
在第五個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:7所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:7所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
本發明的neublastin多肽包括等位基因變體，例如SEQ ID NO:5-7的多肽胺基酸序列，其中Xaa表示Asn或Thr,Yaa表示Ala或Pro。
在第六個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:9所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:9所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
在第七個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:10所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:10所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
在第八個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:11所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:11所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
在第九個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:12所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:12所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽。
在第十個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO:16所示胺基酸序列的多肽，或具有與SEQ ID NO:16所示序列至少約90％，更優選至少約95％，最優選至少約98％同源之胺基酸序列的多肽，所述多肽是鼠源前-neublastin原。
在另一個實施方案中，本發明的多肽具有GDNF亞族指紋，即表3中的下劃線胺基酸殘基。
在另一個實施方案中，本發明提供了由下述多核苷酸序列編碼的多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優選的實施方案中，本發明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQID NO:1所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最優選的實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列所編碼。
在另一個實施方案中，本發明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優選的實施方案中，本發明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最優選的實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列所編碼。
在另一個實施方案中，本發明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優選的實施方案中，本發明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最優選的實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列所編碼。
在另一個實施方案中，本發明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優選的實施方案中，本發明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列至少70％同源。在最優選的實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO:15所示的多核苷酸序列所編碼。生物來源本發明的多肽可分離自哺乳動物細胞，優選分離自人細胞或鼠源細胞。
在最優選的實施方案中，本發明的多肽可分離自人的心臟組織，人骨骼肌，人胰腺，人腦組織，尤其可分離自尾狀核或丘腦，或者可得自哺乳動物源的DNA，這一點將在下文詳細討論。神經營養活性本發明的neublastin多肽可用於緩和神經或神經元細胞的代謝，生長，分化或存活。特別是，neublastin多肽可用於治療或緩解活動物，例如人的失調或疾病，所述失調或疾病對神經營養劑的活性有反應。下文將更詳細地描述這種治療和方法。抗體可使用本發明的neublastin多肽或多肽片段產生neublastin-特異性抗體。本文所用「neublastin-特異性抗體」是抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體，所述抗體能與neublastin多肽或多肽片段發生免疫反應，或者與neublastin多肽的表位特異性結合。
多克隆和單克隆抗體的製備是本領域眾所周知的。尤其是，可按以下文獻所述得到多克隆抗體例如Green等「產生多克隆的抗血清」，免疫化學方法(Manson編)；Humana出版社，1992,p1-5；Coligan等「在兔，大鼠，小鼠和倉鼠中產生多克隆抗血清」，最新免疫學方法，1992，第2.4.1節；Ed Harlow和David Lane(編)「抗體實驗室手冊」，冷泉港實驗室出版社，1988；這些方法都列入本文作為參考。尤其是，可按以下文獻所述得到單克隆抗體Kohler Milstein，自然，1975,256:495；Coligan等，最新免疫學方法，1992，第2.5.1-2.6.7節；和Harlow等，「抗體實驗室手冊」，冷泉港實驗室出版社，1988,p726；這些方法都列入本文作為參考。
簡單地說，可通過下述方法得到單克隆抗體，即用含有抗原的組合物注射例如小鼠，通過取出血清樣品證實抗體的產生，取出脾臟，得到B淋巴細胞，使B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產生針對抗原之抗體的陽性克隆，從雜交瘤培養物中分離抗體。
可通過多種已成熟建立的技術從雜交瘤培養物中分離和純化單克隆抗體，所述技術包括用A蛋白Sepharose進行親和層析，大小排阻層析和離子交換層析，例見Coligan等，最新免疫學方法，1992，第2.7.1-2.7.12節和第2.9.1-2.9.3節；和Barnes等「免疫球蛋白G(IgG)的純化」，分子生物學方法；Humana出版社，1992,Vol.10,p79-104。任選通過與基質結合併從基質上洗脫下來以進一步純化多克隆或單克隆抗體，所述基質上結合有產生抗體的多肽。
使用含有所需小肽(作為免疫抗原)的完整多肽或片段可製備出與本發明的neublastin多肽結合的抗體。通過重組DNA技術或通過化學合成可得到用於免疫動物的多肽，任選將所述多肽與載體蛋白綴合。常用的與肽化學偶聯的載體蛋白包括匙孔嘁血藍蛋白(KLH)，甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)和破傷風類毒素。然後可使用偶聯的肽免疫動物，所述動物尤其可以是小鼠，大鼠，倉鼠或兔。
在一個實施方案中，可使用下列肽產生抗體肽1:CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO:9的胺基酸108-124)；或肽2:ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的胺基酸93-107)。實施例10中描述了使用這些多肽產生抗體的方法。
我們還針對下列肽產生了兔多克隆抗體肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO:9的胺基酸30-43)；肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的胺基酸57-70)；肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO:9的胺基酸74-85)；肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的胺基酸94-107)；肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO:9的胺基酸123-136)。
在該組肽中，只有相對靠近於C末端的肽R30和R31才能識別Western印跡上的在還原條件下變性的蛋白質。
如下文所詳述，我們還鑑定了其它得自成熟蛋白質的neublastin-衍生肽，根據已知的GDNF結構(Eigenbrot和Gerber,Nat.Struct.Biol.,1997 4 435-438)，推測它們是暴露於表面的環，因此可用於產生抗體區域1:CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的AA43-70)；區域2:CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQID NO:9的AA74-107)；區域3:CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC(SEQ IDNO:9的AA108-136)。
在本發明的另一方面，與neublastin或neublastin-衍生肽特異性結合的抗體可用於檢測多種介質中所述neublastin神經營養因子的存在，尤其可用於診斷與本發明的neublastin分子相關的病症或疾病。包括ELISA,RIA和FACS的多種檢測方法是本領域已知的。
本發明的抗體也可用於阻斷神經營養因子的作用，尤其可以是中和抗體。產生本發明多肽的方法如下文所詳述，在允許產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞含有編碼本發明neublastin多肽的DNA序列，接著從培養基中回收多肽。當為了產生neublastin多肽需要對細胞進行基因修飾時，可通過常規方法或通過基因激活修飾細胞。
根據常規方法，可將含有neublastin cDNA或基因組DNA序列的DNA分子包含在表達構建體中，並通過標準方法轉染至細胞中，所述轉染方法包括但不限於脂質體-,Polybrene-或DEAE葡聚糖-介導的轉染，電穿孔，磷酸鈣沉澱，微量注射或速度驅動的微粒轟擊(「biolistics」)。或者，也可使用通過病毒載體傳遞DNA的系統。已知可用於基因轉移的病毒包括腺病毒，腺-相關病毒，慢病毒，皰疹病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰質炎病毒，逆轉錄病毒，新培斯病毒和痘苗病毒，如金絲雀痘病毒，以及昆蟲細胞(尤其是SfP9昆蟲細胞)的杆狀病毒感染。
或者，可使用基因激活(「GA」)法修飾細胞，所述方法描述於例如美國專利5,733,761和5,750,376(皆列入本文作為參考)。
因此，本文所用術語「經基因修飾的細胞」包括在導入DNA分子之後能表達特定基因產物的細胞，所述DNA分子編碼所述基因產物和/或控制該基因產物編碼序列之表達的調節元件。可通過基因靶嚮導入DNA分子，使DNA分子摻入特定的基因組位點。重組表達載體在本發明的另一方面，提供了含有本發明的多核苷酸的重組表達載體。本發明的重組表達載體可以是任何適當的真核表達載體。優選的重組表達載體是含有遍在蛋白啟動子的載體pTEJ-8(Johansen TE,Schoeller MS,Tolstoy S,Schwartz T；FEBS Lett.1990 267 289-294)，及其衍生物，例如pUbi1Z。優選的商購真核表達載體是例如含有病毒啟動子的載體pcDNA-3(可得自Invitrogen)。另一個優選的表達載體使用SV40早期啟動子和腺病毒主要晚期啟動子(衍生自質粒pAD2β；Norton和Coffin，分子細胞生物學，1985,5,281)。
本發明還提供了原核表達載體和合成基因(syngene)，所述合成基因的密碼子經最優化後適於原核表達。用較低的GC含量和偏好的細菌(例如大腸桿菌)密碼子構建合成基因。將合成基因克隆至兩個載體，pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的構建示於圖14。在此構建體中，編碼neublastin成熟結構域的序列直接與起始甲硫氨酸融合。pMJB164的構建示於圖15。生產細胞在本發明的另一方面，提供了生產細胞，所述細胞經基因操作後含有本發明的分離的多核苷酸序列，和/或本發明的重組表達載體。特別是，可對本發明的細胞進行基因操作以瞬時或穩定表達，過量表達或共表達本發明的多肽。產生瞬時和穩定表達的方法是本領域已知的。
可將本發明的多核苷酸插入表達載體，例如質粒，病毒或其它表達載體，所述多核苷酸與表達控制序列以特定的連接方式可操作相連，從而使編碼序列能在與表達控制序列相容的條件下進行表達。適當的表達控制序列包括啟動子，增強子，轉錄終止子，起始密碼子，內含子的剪接信號和終止密碼子，它們都維持於本發明的多核苷酸的正確讀碼框內，從而能適當翻譯mRNA。表達控制序列還包括其它組分，例如前導序列和融合配對物序列。
啟動子尤其可以是組成型或誘導型啟動子。當克隆至細菌系統時，可使用誘導型啟動子，例如噬菌體λ的pL,plac,ptrp,ptac(ptrp-lac雜合啟動子)。當克隆至哺乳動物系統時，可使用得自哺乳動物細胞基因組的啟動子，例如遍在蛋白啟動子，TK啟動子，或金屬硫蛋白啟動子，或得自哺乳動物病毒的啟動子，例如逆轉錄病毒長的末端重複，腺病毒晚期啟動子或痘苗病毒7.5K啟動子。也可使用通過重組DNA或合成技術得到的啟動子以提供本發明多核苷酸的轉錄。
適當的表達載體一般含有表達起點，啟動子以及能用表型選擇轉化細胞的特定基因，所述載體包括在細菌中表達的基於T7的表達載體[Rosenberg等，基因，1987,56,125]，在哺乳動物細胞中表達的pTEJ-8,pUbi1Z,pcDNA-3和pMSXND表達載體[Lee和Nathans，生物化學雜誌，1988 263 3521]，在昆蟲細胞中表達的衍生自杆狀病毒的載體，和卵母細胞表達載體PTLN[Lorenz C,Pusch M Jentsch T J具有新特性的異多亞基CLC氯通道；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 9313362-13366]。
在優選的實施方案中，本發明的細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞，如人細胞，卵母細胞或酵母細胞。本發明的細胞包括但不限於人胚腎(HEK)細胞，例如HEK293細胞，BHK21細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，Xenopus laevis卵母細胞(XLO)。在另一個實施方案中，本發明的細胞是真菌細胞，例如絲狀真菌細胞。在另一個優選的實施方案中，細胞是昆蟲細胞，最優選為Sf9細胞。本發明另一個優選的哺乳動物細胞是PC12,HiB5,RN33b細胞系和人神經祖細胞。最優選的是人細胞。
原代或繼代細胞的例子包括成纖維細胞，上皮細胞(包括乳房和腸上皮細胞)，內皮細胞，血液的組成成分(包括淋巴細胞和骨髓細胞)，膠質細胞，肝細胞，角質形成細胞，肌細胞，神經細胞或這些細胞類型的前體細胞。用於本發明方法的無限增殖化人細胞系的例子包括但不限於Bowes黑素瘤細胞(ATCC登記號為CRL9607),Daudi細胞(ATCC登記號為CCL213),HeLa細胞和HeLa細胞的衍生物(ATCC登記號為CCL2,CCL2.1和CCL2.2),HL-60細胞(ATCC登記號為CCL240),HT-1080細胞(ATCC登記號為CCL121),Jurkat細胞(ATCC登記號為TIB152),KB癌細胞(ATCC登記號為CCL17),K-562白血病細胞(ATCC登記號為CCL243),MCF-7乳腺癌細胞(ATCC登記號為BTH22),MOLT-4細胞(ATCC登記號為1582),Namalwa細胞(ATCC登記號為CRL1432),Raji細胞(ATCC登記號為CCL86),RPMI 8226細胞(ATCC登記號為CCL155),U-937細胞(ATCC登記號為CRL1593),WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC登記號為CLL75.1)和2780AD卵巢癌細胞(Van der Blick等，癌症研究，1988,48,5927-5932)，以及通過融合人細胞和另一物種的細胞而產生的異雜交瘤細胞。也可使用繼代人成纖維細胞系，如WI-38(ATCC登記號為CCL75)和MRC-5(ATCC登記號為CCL171)。
當本發明的細胞是真核細胞時，本發明的異源多核苷酸的摻入可特別地通過以下方法來實現，即感染(利用病毒載體)，轉染(利用質粒載體)，使用磷酸鈣沉澱，微量注射，電穿孔，脂轉染法，或其它本領域已知的物理-化學方法。
在更優選的實施方案中，可將本發明的分離的多核苷酸序列和/或本發明的重組表達載體轉染至哺乳動物宿主細胞，神經祖細胞，星形細胞，T-細胞，造血幹細胞，非-分裂細胞，或腦內皮細胞，所述細胞含有至少一種能介導細胞無限增殖化和/或轉化的DNA分子。
通過導入調節元件，尤其是導入啟動子可以激活宿主細胞中的內源性基因，所述啟動子能導致編碼本發明之neublastin多肽的內源性基因的轉錄。藥物組合物在本發明的另一方面，提供了新的藥物組合物，其含有治療有效量的本發明多肽。
為了用於治療，可以任何方便的形式施用本發明的多肽。在優選的實施方案中，本發明的多肽與一種或多種佐劑，賦形劑，載體和/或稀釋劑混合於藥物組合物中，本領域技術人員使用本領域已知的常規方法即可製備藥物組合物。
這種藥物組合物可含有本發明的多肽或其抗體。可以單獨施用該組合物，也可與一種或多種其它藥劑，藥物或激素一起施用該組合物。
可通過任何適當的途徑施用本發明的藥物組合物，包括但不限於口服，靜脈內，肌內，動脈間，髓內，鞘內，室內，經皮，皮下，腹膜內，鼻內，anteral，局部，舌下或直腸給藥，頰內，陰道內，眶內，腦內，顱內，脊柱內，室內，池內，囊內，肺內，經黏膜，或經由吸入。
肺內傳遞方法，裝置和藥物製品描述於例如美國專利5,785,049,5,780,019和5,775,320(皆列入本文作為參考)。可通過周期性注射藥物製品的巨丸劑進行給藥；也可通過靜脈內或腹膜內途徑更連續地給藥，所述藥物得自外部(例如Ⅳ袋)或內部(例如生物可腐蝕的植入物，生物人工器官，或植入的neublastin生產細胞集落)藥物庫。例見美國專利4,407,957,5,798,113和5,800,828(皆列入本文作為參考)。肺內傳遞方法和裝置描述於例如美國專利5,654,007,5,780,014和5,814,607(皆列入本文作為參考)。
尤其是，使用任何適當的傳遞方式都可施用本發明的neublastin,所述方式包括(a)泵(例見藥物治療年鑑，27:912(1993)；癌症，41:1270(1993)；癌症研究，44:1698(1984)，列入本文作為參考)，(b)微囊化(例見美國專利4,352,883；4,353,888和5,084,350，列入本文作為參考)，(c)持續釋放的聚合植入物(例見Sabel，美國專利4,883,666，列入本文作為參考)，(d)巨囊化(例見美國專利5,284,761,5,158,881,4,976,859和4,968,733和公開的PCT專利申請WO92/19195,WO95/05452，皆列入本文作為參考)，(e)移植至CNS的裸露的或未囊化的細胞移植物(例見美國專利5,082,670和5,618,531，皆列入本文作為參考)，(d)皮下，靜脈內，動脈內，肌內注射或注射至其它適當的位點；和(g)以膠囊，液體，片劑，丸劑或延長釋放的製劑口服給藥。
在本發明的一個實施方案中，直接將neublastin傳遞至CNS，優選傳遞至腦室，腦實質，鞘內間隙或其它適當的CNS位置，最優選傳遞至鞘內。
在另一個優選的實施方案中，我們希望通過皮下注射，靜脈內給藥或靜脈內灌注全身性傳遞給藥。
其它有用的非腸道傳遞系統包括乙烯-乙烯基醋酸酯共聚物顆粒，滲透泵，可植入的灌注系統，泵傳遞，膠囊化細胞傳遞，脂質體傳遞，針頭-傳遞的注射，無針頭注射，噴霧器，煙霧劑，電穿孔和經皮貼片。
有關配製和給藥技術的其它詳情可參見Remington’s藥物科學(Maack出版公司，Easton,PA)的最新版本。
每天以一個或幾個劑量施用活性成分。本發明所希望的適當劑量為每次給藥0.5ng neublastin/kg體重至約50μg/kg，每天給藥約1.0ng/kg至約100μg/kg。neublastin藥物組合物應該提供局部濃度為約5ng/ml腦脊髓液(「CSF」)至25ng/ml CSF的神經營養因子。
當然，應當根據年齡，體重和接受治療的個體的身體狀況以及給藥途徑，劑量形式和制度，所需結果小心地調整給藥的劑量，醫生應當可以確定精確的劑量。
在其它實施方案中，可使用下文「治療方法」一節中所述的細胞系和載體，通過基因傳遞施用本發明的neublastin多肽。為了產生這種治療性的細胞系，可將本發明的多核苷酸插入表達載體，例如質粒，病毒或其它表達載體，所述多核苷酸與表達控制序列以特定的連接方式可操作相連，從而使編碼序列能在與表達控制序列相容的條件下進行表達。適當的表達控制序列包括啟動子，增強子，轉錄終止子，起始密碼子，內含子的剪接信號和終止密碼子，它們都維持於本發明的多核苷酸的正確讀碼框內，從而能適當翻譯mRNA。表達控制序列還包括其它組分，例如前導序列和融合配對物序列。
啟動子尤其可以是組成型或誘導型啟動子。組成型啟動子可以是合成的，病毒的或得自哺乳動物細胞基因組的啟動子，例如人遍在蛋白啟動子。在優選的實施方案中，治療性的細胞系是表達本發明多肽的人無限增殖化神經細胞系。為了進行植入，我們希望植入約105至1010個細胞，更優選植入106至約108個細胞。治療方法本發明涉及多核苷酸和蛋白質，多肽，肽片段或由它們產生的衍生物，以及針對所述蛋白質，肽或衍生物的抗體，本發明可用於治療或緩解活動物體，包括人的失調或疾病，所述失調或疾病對神經營養劑的活性有反應。
可經由例如注射入，植入或食入的藥物組合物，直接使用本發明的多肽來治療對neublastin多肽有所反應的病理過程。
可使用本發明的多核苷酸，包括其互補序列來表達本發明的神經營養因子。通過表達本發明的這種蛋白質，肽或衍生物的細胞系，或通過編碼本發明的這種蛋白質，肽或衍生物的病毒載體，或通過表達這種蛋白質，肽或衍生物的宿主細胞可實現這一目的。可在治療的靶區域施用這些細胞，載體和組合物以影響對neublastin多肽有所反應的疾病過程。
適當的表達載體可衍生自慢病毒，逆轉錄病毒，腺病毒，皰疹病毒或痘苗病毒，或衍生自多種由細菌產生的質粒，可在體內使用這些表達載體將核苷酸序列傳遞至整個生物體或靶器官，組織或細胞群體。其它方法包括但不限於脂質體轉染，電穿孔，用含有核或其它定位信號的載體肽轉染，和經由緩釋系統進行基因傳遞。在本發明的另一方面，可使用與neublastin基因或其部分互補的「反義」核苷酸序列抑制或增強neublastin表達。
本發明的另一方面涉及治療或緩解活動物體，包括人的失調或疾病的方法，所述失調或疾病對神經營養劑的活性有反應。
失調或疾病尤其可以是由創傷，外科手術，局部缺血，感染，代謝疾病，營養缺陷，惡性腫瘤或毒性劑和遺傳或自發過程導致的神經系統損傷。
損傷尤其可發生在感覺神經元或視網膜神經節細胞，包括側根神經節中的神經元或下列任何組織中的神經元膝狀，巖部和結節狀神經節；第Ⅷ根顱神經的耳前庭複合體；三叉神經神經節之上下頜葉的腹外側極；和中腦三叉神經核。
在本發明方法的優選實施方案中，疾病或失調是涉及受損和受傷的神經元的神經變性疾病，例如外周神經，髓質和/或脊髓的外傷性損害，大腦局部缺血性神經元損害，神經病(尤其是外周神經病)，外周神經創傷或外傷，局部缺血性中風，急性腦損傷，急性脊髓損傷，神經系統腫瘤，多發性硬化，暴露於神經毒素，代謝疾病(例如糖尿病或腎功能異常)和由感染因子導致的損傷，神經變性失調，包括早老性痴呆，杭廷頓氏病，帕金森氏病，Parkinson-Plus症候群，進行性核上麻痺(Steele-Richardson-Olszewski症候群)，橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA),Shy-Drager症候群(多系統萎縮)，Guamanian帕金森氏症候群痴呆復徵，肌萎縮性側硬化，或任何其它先天的或神經變性疾病，和與痴呆相關聯的記憶損傷。
在優選的實施方案中，我們希望治療感覺和/或自主系統的神經元。在另一個優選的實施方案中，我們希望治療運動神經元疾病，例如肌萎縮性側硬化(「ALS」)和脊柱肌萎縮。在另一個優選的實施方案中，我們希望使用本發明的neublastin分子增強外傷後的神經恢復。在一個實施方案中，我們希望使用神經引導通道，該通道具有含neublastin多肽的基質。這種神經引導通道公開於例如美國專利5,834,029(列入本文作為參考)。
在優選的實施方案中，可使用本發明的多肽和核酸(和含有它們的藥物組合物)治療外周神經病。在外周神經病中，有望用本發明的分子進行治療的是外傷-誘導的神經病，例如由物理損傷或疾病狀態，對腦的物理損傷，對脊髓的物理損傷，與腦損傷相關的中風和與神經變性相關的神經失調所致的神經病。
我們還希望治療由化學治療誘導的神經病(例如由諸如紅豆杉醇或順式鉑氨的化學治療劑的傳遞所導致的神經病)；毒素-誘導的神經病，藥物-誘導的神經病，維生素-缺乏-誘導的神經病；自發性的神經病和糖尿病性神經病，例見美國專利5,496,804和5,916,555(皆列入本文作為參考)。
我們還希望使用本發明的neublastin核苷酸和多肽治療非-神經病，單-多重神經病和多-神經病，包括軸索和脫髓鞘神經病。
在另一個優選的實施方案中，本發明的多肽和核酸(和含有它們的藥物組合物)可用於治療多種眼病，包括受斑變性，色素性視網膜炎，青光眼和類似疾病困擾的患者的視網膜光受體損失。
本發明的另一個目的是提供預防與上述疾病和失調相關聯的變性變化的方法，所述方法包括將人載體或細胞植入哺乳動物的腦，所述載體或細胞能產生neublastin的生物活性形式或neublastin前體，即易於通過哺乳動物體轉變為neublastin的生物活性形式的分子，或者，另外可將分泌neublastin的細胞包裹於例如半透膜內。
可在體外培養細胞以用於移植至或植入哺乳動物(包括人)的腦。
在優選的實施方案中，可使用例如國際專利申請WO98/32869中所述的表達載體，將編碼本發明多肽的基因轉染至適當的細胞系，例如無限增殖化的大鼠神經幹細胞系，如HiB5和RN33b，或轉染至人無限增殖化的神經祖細胞系，再將所得的細胞系植入活體(包括人)的腦中，以在CNS中分泌本發明的治療性多肽。診斷和篩選方法可使用neublastin核酸測定個體是否因neublastin基因缺損，如neublastin等位基因的缺損而先傾向於患有神經失調症，所述缺損是通過例如基因遺傳，異常胚胎發育，或獲得性DNA損傷而獲得的。所述分析包括例如檢測neublastin基因內的缺損或點突變，或檢測具有特異性限制性片段長度多態性(RFLP)的基因缺損誘因的遺傳性，通過使患者的核酸樣品與neublastin基因特異性的核酸探針雜交來檢測是否存在正常的neublastin基因，並且測定探針與核酸雜交的能力。
可特別地將neublastin核酸用作雜交探針。可使用這種雜交分析檢測，預測，診斷或監測與編碼neublastin蛋白之mRNA的異常水平相關的病症，失調或疾病。可將neublastin核酸當作neublastin神經營養因子-依賴型生理過程的「標記」。這些過程包括但不限於「正常的」生理過程(如神經元功能)和病理過程(如神經變性疾病)。neublastin蛋白和/或編碼neublastin的mRNA水平異常(即升高或降低)的特定患者亞群的鑑定導致新的疾病分類。本文所定義的「異常水平」指的是經定量或定性方法測定，上述水平相對於對照樣品或未患病的個體而言有所增加或降低。
也可使用本發明的neublastin核酸和多肽篩選和鑑定neublastin類似物，包括neublastin的小分子模擬物。在一個經深思熟慮的實施方案中，本發明提供了鑑定候選化合物的方法，所述化合物可誘導neublastin-介導的生物學作用，所述方法包括以下步驟提供受試細胞，當其與neublastin接觸時可被誘導表達可測的產物，將細胞暴露於候選化合物，並檢測可測產物。可測產物的表達是候選化合物能誘導neublastin-介導的生物學作用的標誌。
此外，本發明的neublastin核酸和多肽可用於DNA晶片或蛋白質晶片，或用於電腦程式以鑑定相關的新基因序列和由其編碼的蛋白質，包括等位基因變體和單核苷酸多態性(「SNP」)。所述方法描述於例如美國專利5,795,716；5,754,524；5,733,729；5,800,992；5,445,934；5,525,464(皆列入本文作為參考)。實施例實施例1分離neublastin核酸的方法方法1快速篩選人胎腦cDNA中的neublastin基因通過與人persephin的同源性，在兩個提交至GenBank的高通量基因組序列(HGTS)(登記號為AC005038和AC005051)中鑑定出290bp片段。由290bp片段的核酸序列合成兩個neublastin特異性引物。neublastin上鏈引物(「NBNint.sence」)具有序列5』-CCTGGCCAGCCTACTGGG-3』[SEQ ID NO:17]。neublastin下鏈引物(「NBNint.antisence」)具有序列5』-AAGG AGACCGCTTCGTAGCG-3』[SEQ ID NO:18]。用這些引物進行96孔PCR反應。
96孔主平板含有500,000個cDNA克隆的質粒DNA，每孔上樣約5000個克隆。96孔次平板使用的是大腸桿菌DH10B甘油原種，每孔含有50個克隆。
使用聚合酶鏈反應(「PCR」)技術通過3輪擴增鑑定出neublastin核酸；擴增增加了樣品中的核酸拷貝數。
主平板篩選使用上述96-孔PCR篩選技術，用基因-特異性引物篩選人胎腦cDNA主平板以分離人neublastin cDNA。
從主平板的相應孔中得到30納克(30ng)人胎腦cDNA(6ng/μl；Origene Technologies)，將其置於總體積為25μl的溶液中，所述溶液含有下列試劑0.2mM上述兩種基因-特異性引物(即NBNint.sence和NBNint.antisence),1×標準的PCR緩衝液(Buffer V,Advanced Bio-technologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用下列方案和條件進行PCR熱循環反應。起初使DNA於94℃變性3分鐘，然後按下述進行35輪循環94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃第一次延伸90秒；72℃最終延伸5分鐘。使用含有溴化乙錠染料的2％瓊脂糖凝膠經凝膠電泳分析96個獨立的PCR反應產物。由一個孔中得到的102bp陽性PCR產物對應於獨特的96孔次平板。
102bp核酸片段具有下列序列[SEQ ID NO:13]5′-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3′次平板篩選將1μl得自相應次平板孔的甘油原種置於總體積為25μl的溶液中，經PCR-介導的擴增篩選96孔人胎腦次平板，所述溶液含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，1×標準的PCR緩衝液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用的PCR熱循環條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應，鑑定出給出102bp PCR片段的陽性孔。
菌落PCR用Luria肉湯(LB)將1ml得自陽性次平板孔的甘油原種稀釋100倍，然後將1ml和10ml上述稀釋液鋪於2個含有Luria肉湯(LB)和100μg/ml羧苄青黴素的獨立瓊脂平板上，於30℃將LB平板保溫過夜。從這些平板中挑選出96個菌落，置於新的96孔PCR板的孔中，每孔的終體積為25μl，其中含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，1×標準的PCR緩衝液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl；AdvancedBiotechnologies,UK)。
使用的PCR熱循環條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應，隨後鑑定出含有102bp片段的陽性菌落。
對由該陽性菌落製備的質粒DNA進行測序，顯示出861bp的全長cDNA[SEQ ID NO:8]。該cDNA編碼前-neublastin原[SEQ ID NO:9]。使用BigDye終止循環測序試劑盒(PE Applied Biosystems,USA)進行自動化的DNA測序。在ABI Prism 377(PE Applied Biosystems,USA)上電泳測序凝膠。方法2從人腦中克隆neublastin cDNA:
通過聯合使用RACE(快速擴增cDNA末端)，上文所述的neublastin-特異性引物NBNint.sence和NBNint.antisence，以及載體-特異性或銜接子-特異性引物，例如通過使用Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.K1802-1)，可實施擴增全長neublastin cDNA或cDNA片段的另一種方法。
使用整個人腦Marathon-Ready cDNA(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.7400-1)擴增全長neublastin cDNA。擴增所用的引物包括neublastin上鏈引物5』-ATGGAACTTGGACTT GG-3』[SEQ IDNO:19](「NBNext.sence」)，和neublastin下鏈引物5』-TCCATCACCCACCGG C-3』[SEQ ID NO:20](「NBNext.antisence」)，以及包含在Marathon-Ready cDNA中的銜接子引物AP1。也可使用另一種上鏈引物，5』-CTAGGAGCCCATGCCC-3』[SEQ ID NO:28]。也可使用另一種下鏈引物5』-GAGCGAGCCCTCAGCC-3』[SEQ ID NO:33]。類似地，也可使用另一種下鏈引物SEQ ID NO:24和26。方法3從人腦中克隆neublastin cDNA:
克隆neublastin cDNA的另一種方法是通過用本文所述的一種或多種neublastin探針篩選成人或胎兒的腦文庫(如圖1所例舉)。這些文庫包括λgt11人腦(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.HL3002b)；或λgt11人胎腦(Clontech Laboratories,USA,Cat.No.HL3002b)。方法4快速篩選小鼠胎cDNA中的neublastin基因按下述方法進行快速篩選neublastin基因的方案。96孔主平板含有500,000個cDNA克隆的質粒DNA，每孔上樣約5000個克隆。96孔次平板使用的是大腸桿菌甘油原種，每孔含有50個克隆。進行3輪PCR-介導的擴增以鑑定出感興趣的基因(即neublastin)。
主平板篩選使用基因-特異性引物，通過96-孔PCR篩選小鼠胎cDNA主平板以分離小鼠neublastin cDNA。合成下列兩個引物(1)neublastin C2引物(NBNint.sence):5』-GGCCACCGCTCCGACGAG-3』[SEQ ID NO:21]；和(2)neublastin C2as引物(NBNint.antisence):5』-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3』[SEQID NO:22]。通過使用這兩個基因-特異性引物，鑑定出220bp的陽性PCR產物。220bp核酸具有下列序列[SEQ ID NO:14]:5′-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAGCCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGCCGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCTCCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3′然後按下列方法進行96孔PCR反應。從主平板的相應孔中得到30納克小鼠胎腦cDNA(6gng/l；Origene Technologies)，將其置於總體積為25μl的溶液中，所述溶液含有下列試劑0.2mM上述兩種基因-特異性引物(即C2引物(NBNint.sence)和neublastin C2as引物(NBNint.antisence)),1×標準的PCR緩衝液(Buffer V,Advanced Bio-technologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用下列PCR熱循環條件起初使DNA於94℃變性3分鐘，然後按下述進行35輪循環94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸90秒；72℃最終延伸5分鐘。在含有溴化乙錠染料的2％瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應。由一個孔中得到的220bp陽性PCR產物對應於獨特的96孔次平板。在含有溴化乙錠染料的2％瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應。鑑定出的220bp陽性PCR產物對應於96孔次平板特有的孔。
次平板篩選將1μl得自相應次平板孔的甘油原種置於最終總體積為25μl的溶液中，經PCR-介導的擴增篩選96孔小鼠胎次平板，所述溶液含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，1×標準的PCR緩衝液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環條件與上文所述的主平板篩選所用的條件相同。
在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應，鑑定出產生220bp片段的陽性孔。
菌落PCR用Luria肉湯(LB)將1ml得自陽性次平板孔的甘油原種稀釋100倍，然後將1ml和10ml上述稀釋液鋪於2個含有100μg/ml羧苄青黴素的獨立LB平板上，於30℃保溫過夜。總共分離出96個菌落，將這些菌落轉移至96孔PCR板的孔中，每孔的終體積為25μl，其中含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，1×標準的PCR緩衝液(Buffer V,Advanced Biotechnologies,UK),0.2mM dNTP(Amersham-Pharmacia),0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories,USA)和0.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies,UK)。
使用的PCR熱循環條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分析96個獨立的PCR反應，通過220bp片段的存在鑑定出陽性菌落。由該陽性菌落製備質粒DNA，使用具有AmpliTaq DNA聚合酶的BigDye終止循環測序試劑盒對克隆進行自動化的DNA測序。在ABIPrism 377(PE Applied Biosystems,USA)上電泳測序凝膠。所得克隆序列顯示出2136bp的全長cDNA[SEQ ID NO:15]。此cDNA包括具有SEQID NO:16所示的推測胺基酸序列的開放閱讀框，其編碼小鼠前-neublastin原多肽。實施例2克隆基因組neublastin如上文所討論，申請人在兩個登錄至GenBank的人BAC克隆(登記號為AC005038和AC005051)中鑑定出290bp的核酸片段，該片段具有與persephin和persephin的側翼序列同源的區域。申請人使用上文所述的861bp推測序列設計出其它引物，目的是使用LasergeneSoftware(DNAStar公司)克隆出編碼其它neublastin核酸的核酸。通過對基因組DNA進行PCR反應，使用兩對引物克隆neublastin基因。這兩對引物如下。1號引物對5』CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3』(有義)[SEQ IDNO:23]5』CAT CAC CCA Ccg gCA ggg gCC TCT Cag 3』(反義)[SEQ IDNO:24]。2號引物對5』gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgAggACA 3』(有義)[SEQ IDNO:25]5』CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC 3』(反義)[SEQ IDNO:26]。
使用1號引物對，由購自Clontech Laboratories(Cat.No.6550-1)的人基因組DNA製品擴增887bp DNA片段。
PCR方案使用具有緩衝液1的ExpandTMHigh Fidelity PCR系統(Boehringer Mannheim)進行PCR。總體積為50μl的PCR反應混合物中添加有5％二甲基亞碸(DMSO)和17.5pmol各種dNTP。熱循環反應為94℃預-變性2分鐘，接著進行35輪94℃10秒和68℃1分鐘的兩-步循環。通過於68℃保溫5分鐘終止熱循環。在PTC-225 DNAEngine Tetrad熱循環儀(MJ Research,MA)中進行熱循環。通過在2％瓊脂糖(FMC)上進行凝膠電泳來分析PCR產物，然後進行照相。
將用1號引物對擴增自人基因組DNA的887bp片段克隆至pCRⅡ載體(Invitrogen)，並轉化至XL 1-Blue感受態大腸桿菌細胞(Stratagene)。所得質粒被稱為neublastin-2，使用熱測序酶(AmershamPharmacia Biotech)對該質粒測序。通過在ALFExpress自動測序儀(Amer-sham Pharmacia Biotech)上電泳來分析測序產物。
對用第二對引物(上述1號引物對)PCR擴增人基因組DNA得到的片段進行測序，顯示出位於開放閱讀框3』引物末端的額外的42bp區域。通過將此全長序列與其它神經營養因子的核酸序列相比較，以及使用尋找基因的軟體程序作圖外顯子-內含子邊界序列來分析此全長序列，所述程序可使用Netgene和Gene Mark軟體(Brunak等，分子生物學雜誌，1991,220 49-65；Borodovsky等，核酸研究，1995,23,3554-62)鑑定適當的剪接接頭和具有高編碼潛力的區域。通過得自上述快速篩選的cDNA進一步證實外顯子-內含子邊界序列。
如圖7所示，所得neublastin基因具有兩個被70bp內含子分開的外顯子。總之，外顯子具有全長Neublastin多肽的推測胺基酸序列。推測的cDNA[SEQ ID NO:3]含有編碼238個胺基酸殘基[SEQ ID NO:4]的開放閱讀框(ORF)。Neublastin-2克隆含有neublastin原的完整編碼序列。由此基因編碼的胺基酸序列顯示出與3個蛋白質，presephin,neublastin和GDNF具有高同源性。實施例3表達neublastin核酸使用下述技術檢測嚙齒類動物和人的神經和非-神經組織，以及多個發育不成熟和成年階段的neublastin RNA表達。
使用RT-PCR檢測Neublastin RNA表達的方法根據SEQ IDNO:1所鑑定的neublastin DNA序列，合成了下列引物(1)neublastinC2引物5』-GGCCACCGCTCCGACGAG-3』[SEQ ID NO:21]；和(2)neublastin C2as引物5』-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3』[SEQID NO:22]。使用該套引物由成人和胎兒全腦mRNA RT-PCR擴增DNA片段，通過此反應產生的DNA片段中有一個為220bp。鑑定該220bpDNA片段，結果表明成人和胎兒腦組織中表達了neublastin基因。使用這些引物從基因組DNA中也擴增到220bp DNA片段。通過Northern印跡雜交檢測Neublastin RNA表達的方法具有成人組織的polyA+RNA的Northern印跡購自廠商(ClontechLaboratories,USA)，並用32P-標記的neublastin cDNA作探針與其雜交。根據上文實施例1所述的方法製備經標記的neublastin cDNA。
製備探針按照廠商的說明，使用Rediprime Ⅱ標記試劑盒(Amersham；Cat.No.RPN1633)標記neublastin核酸DNA片段(SEQ IDNO:8的核苷酸296-819)以用作雜交探針。簡單地說，用10mM TE緩衝液(10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)稀釋DNA樣品至濃度為2.5-25ng/45μl。然後在開水浴中將樣品加熱至95-100℃達5分鐘，將其置於冰上放5分鐘以快速冷卻樣品，簡單離心使內容物沉至反應管底部，從而使DNA變性。在反應管中加入上述所有變性的DNA以及5μl Redivue[32P]dCTP(Amersham Pharmacia Biotech Ltd)，該反應管中還同時含有dATP,dGTP,dTTP的緩衝溶液，乾燥的穩定化形式的無外切核酸酶的Klenow酶和隨機引物。通過用移液管上下抽吸2次，用移液管攪動溶液以混合溶液，於37℃將反應混合物保溫10分鐘。通過加入5μl 0.2M EDTA終止標記反應。為了用作雜交探針，通過將DNA樣品加熱至95-100℃達5分鐘，然後將其置於冰上放5分鐘以快速冷卻DNA樣品，從而使經標記的DNA變性為單鏈。離心試管，充分混合其內容物。最後，使用Nucleotide Removal試劑盒(Qiagen)純化單鏈DNA探針。
雜交技術製備的Northern印跡購自廠商(「多組織Northern印跡」，Clontech Laboratories,USA,Cat.No.7760-1和7769-1)，根據廠商說明，使用上文所製備的neublastin32P-標記的探針與所述印跡雜交。為了進行雜交，使用了ExpressHyb溶液(Clontech Laboratories,USA)和濃度約為3ng/ml的經標記探針。將ExpressHyb溶液加熱至68℃，然後攪拌以溶解任何沉澱物。根據廠商說明，於68℃，在Hybaid雜交烘箱中的至少5ml ExpressHyb溶液中將每個Northern印跡膜(10×10cm)預-雜交30分鐘。於95-100℃放置2分鐘使neublastin32P-標記的探針變性，然後在冰上快速冷卻。在5ml新鮮的ExpressHyb中加入14μl經標記的探針並徹底混合。預-雜交中所用的ExpressHyb溶液被5ml均勻分布於印跡膜的含有經標記探針的新鮮ExpressHyb溶液所替代。於68℃，在Hybaid雜交烘箱中將印跡保溫1小時。保溫後，在低嚴緊度(含有0.05％SDS的2×SSC緩衝液，室溫)下將印跡衝洗和洗滌幾次，接著在高嚴緊度(含有0.1％SDS的0.1×SSC,50℃)[20×SSC是0.3M NaCl/0.3M檸檬酸鈉，pH7.0]下洗滌。於-80℃,使用增感屏將印跡暴露於Hyperfilm MP(Amersham PharmaciaBiotech Ltd.)。
Northern印跡雜交實驗的結果示於圖1。圖1A(左)和圖1B(右)是按實施例3所述與32P-標記的neublastin cDNA探針雜交的polyA+RNANorthern印跡。標記物表示大小為1.35千鹼基對(「kb」),2.4kb,4.4kb,7.5kb和9.5kb的多核苷酸。用提取自多種成人組織的mRNA製備圖1A的膜。由Northern印跡雜交分析的結果，申請人得出結論很多成人組織中都表達neublastin mRNA。在心臟，骨骼肌和胰腺中檢測到最高水平的neublastin表達。用提取自成人腦的多個區域的RNA製備圖1B的膜。在成人腦中，尾狀核和丘腦中的表達水平最高。在腦中，約5kb的mRNA轉錄物是主要表達的neublastin mRNA形式。使用原位雜交檢測組織中的neublastin RNA表達的方法使用以下技術，用neublastin反義探針測定動物組織，例如齧齒動物組織中的neublastin RNA表達。在小鼠中的表達製備組織樣品在懷孕第13.5或18.5天，通過頸脫位處死懷孕小鼠(BK Universal,Stockholm,Sweden)。在無菌條件下解剖，取出胚胎，立即浸入含有4％低聚甲醛(「PFA」)的0.1M磷酸鹽緩衝液(PB)中達24至30小時，然後從PFA中取出並儲存於PBS中。通過將組織浸入30％蔗糖溶液，然後在TissueTech(O.C.T.Compound,SakuraFinetek USA,Torrance,CA)中包埋該組織即可製備出切片用的組織。在低溫恆溫器上切下6個冠狀或矢狀切片(各為12μm)系列，並融化固定在帶正電的玻片上。在實施與胚胎階段相同的方案之後，固定新生兒的頭/腦(P1,P7)，解剖成年腦組織，立即在乾冰中凍幹，無需包埋即可在低溫恆溫器上進行切片。
製備neublastin Riboprobe按下述製備反義neublastin RNA探針(下文稱之為neublastin riboprobe)。將小鼠neublastin cDNA序列的核苷酸1109-1863[SEQ ID NO:15]亞克隆至BlueScript載體(Stratagene)。使用EcoRⅠ限制性內切核酸酶將所得質粒切割成線性DNA。根據廠商(Boehringer Mannheim)說明，使用T3 RNA聚合酶和地高辛配基(「DIG」)RNA標記試劑盒體外轉錄EcoRⅠ DNA片段。
雜交在4％PFA中將低溫恆溫器切片固定10分鐘，用10mg/ml蛋白酶K處理5分鐘，依次分別用70％和95％乙醇脫水5和2分鐘，然後風乾。將含有1μg/ml DIG-標記探針的雜交緩衝液(50％去離子化的甲醯胺，50％葡聚糖硫酸酯溶液中的10％,1％ Denhardt溶液，250μg/ml酵母tRNA,0.3M NaCl,20mM Tris-HCl(pH8),5mM EDTA,10mM NaPO4,1％十二烷基肌氨酸鈉)加熱至80℃達2分鐘，並應用於切片上，然後用石蠟膜覆蓋切片，於55℃保溫16至18小時。
第二天，於55℃，在高嚴緊度(含有50％甲醯胺的2×SSC)下洗滌切片30分鐘，然後用RNA酶緩衝液洗滌，並於37℃與20μg/ml RNA酶A保溫30分鐘。為了檢測DIG-標記的探針，在封閉溶液(含有0.1％吐溫-20和10％熱-滅活的山羊血清的PBS)中將切片預保溫1小時，然後於4℃與按1∶5000稀釋的鹼性磷酸酶-偶聯的抗-DIG抗體(Boehringer Mannheim)保溫過夜。第二天，用含有0.1％吐溫-20的PBS將每個切片洗滌4次，每次2小時，然後用NTMT緩衝液(100mM NaCl,100mM Tris-HCl(pH9.5),50mM MgCl2,0.1％吐溫-20)洗滌2次，每次10分鐘。然後在含有0.5mg/ml levamisole的BM-紫色底物中將切片保溫48小時。通過用PBS洗滌以終止顏色反應，風乾切片，用具有DPX的封套(KEBO-lab,Sweden)覆蓋切片。
原位雜交反應的結果示於表1。表1在小鼠中表達neublastin結構 E13.5 E18.5 P1 P7成年的前腦 ++前側中腦 -側根神經節 ++脊髓 +視網膜 +++ ++++嗅球 ++++ ++牙髓 ++++ +三叉神經的神經節 ++++ ++紋狀體 + + ++皮質 ++++ +++齒狀回 +++如表1所示，在第13.5天胚胎期(「E13.5」)，脊髓和後腦中表達了neublastin，前腦中僅有微弱表達。在發育中的視網膜和感覺神經節(側根神經節和三叉神經的神經節(V))中也檢測到neublastin表達。除神經系統外，在腎，肺和腸中發現了微弱信號，這表明這些組織中也表達neublastin。
在第18.5天胚胎期(「E18.5」)，三叉神經神經節(V)中的neublastin表達最為顯著，也在視網膜，紋狀體和皮質中檢測到neublastin表達。另外，還在牙髓中觀察到表達。
參照表1，在皮質，紋狀體和三叉神經神經節(V)中，由E18.5時間點至出生後第1和7天，neublastin的表達逐步增加。皮質外層的neublastin表達比皮質內層更加顯著。在P7天，有表達的結構與P1天的相同，但另外還在海馬，尤其是齒狀回和小腦中發現了neublastin表達。在成年的鼠腦中，neublastin在齒狀回中大量表達，而在受試的其它組織中僅檢測到很低或不可測水平的neublastin表達。在大鼠中表達下列實驗描述了大鼠組織與鹼性磷酸酶-標記的寡脫氧核苷酸neublastin反義探針的雜交。
製備組織樣品用戊巴比妥麻醉之後，由懷孕的Wistar大鼠(Mollegaard Breeding,Denmark)得到大鼠胚胎(E14)。通過斷頭殺死出生後的大鼠(P0,P7，成年)。立即將解剖的腦和整個頭浸入冷的0.9％NaCl中，新鮮冷凍並在低溫恆溫器上切片成20μm(冠狀或矢狀切片，10個系列)。
原位雜交使用反義鹼性磷酸酶(AP)綴合的寡脫氧核苷酸探針(5』-NCAGGTGGTCCG TGGGGGGCGCCAAGACCGG-3』[SEQ IDNO:27],Oligo.No.164675,DNA Technology,Denmark)雜交兩個切片系列。所述探針與SEQ ID NO:15所示小鼠neublastin cDNA的鹼基1140至1169互補。
在雜交之前，室溫風乾切片，加熱至55℃10分鐘，然後於4℃用96％乙醇處理過夜。然後風乾切片，於39℃在雜交介質(5.0pmol探針/m1)中保溫過夜(Finsen等，神經科學，1992,47,105-113；West等，J.Comp.Neurol,1996,370,11-22)。
雜交後的處理包括於55℃用1×SSC(0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉)衝洗4次，每次30分鐘，接著在室溫下用Tris-HCl,pH9.5衝洗3次，每次10分鐘，然後使用AP顯色劑。AP顯色劑即用即制，其含有氮藍四唑(NBT,Sigma),5-溴,4-氯,3-吲哚磷酸(BCIP,Sigma)和Tris-HCl-MgCl2緩衝液，pH9.5(Finsen等，神經科學，1992,47,105-113)。室溫下，在黑暗中進行AP顯色48小時。通過用蒸餾水衝洗切片來終止顏色反應。在梯度丙酮中使切片脫水，用二甲苯-苯酚木溜油(Allchem,UK)使其軟化，用二甲苯清洗，並使用Eukitt(Bie Berntsen,Denmark)覆蓋一層封套。
對照反應包括(1)在雜交前用RNA酶A(50μg/ml,Pharmacia,Sweden)預-處理切片；(2)用過量100倍的未經標記的探針與切片雜交；和(3)僅用雜交緩衝液與切片雜交。雜交反應的結果示於表2。表2在大鼠中表達neublastin結構 E14P0/P1P7成年的前腦 ++前側中腦 -側根神經節 ++脊髓 +視網膜 +嗅球(+) ++ ++小腦 + ++ +三叉神經的神經節 ++ ++紋狀體 + +(+)皮質(+) ++ ++ +海馬 (+) ++ ++在第14天胚胎期(E14),neublastin在大鼠胚胎的前腦，後腦和脊髓中微弱表達。在眼(視網膜)，側根神經節，三叉神經神經節(V)和腎，肺，心臟，肝臟和腸中也檢測到neublastin mRNA。在新生(P0)大鼠中，皮質和紋狀體中的neublastin表達顯著。在嗅球和海馬中也檢測到neublastin表達。在7天齡(P7)大鼠中，皮質，紋狀體，嗅球和小腦表達了neublastin。在海馬中發現了顯著的信號。在成年大鼠中，在腦的大多數區域檢測到很低或不可測的neublastin表達水平。在丘腦核中檢測到微弱信號，在海馬中檢測到顯著的neublastin表達。實施例4neublastin多肽在SEQ ID NO:8中鑑定的開放閱讀框或編碼區(CDS)編碼前-多肽原(稱為「前neublastin原」)。由此開放閱讀框推測的胺基酸序列示於SEQ ID NO:9，鑑定了3個neublastin多肽變體，這些變體包括(ⅰ)本文稱為NBN140的多肽，其具有SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列；(ⅱ)本文稱為NBN116的多肽，其具有SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列；和(ⅲ)本文稱為NBN113的多肽，其具有SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
類似地，根據SEQ ID NO:3中鑑定的編碼區(CDS)編碼具有SEQID NO:4所示胺基酸序列的前-多肽原，鑑定了3個neublastin變體，這些變體包括(ⅰ)具有SEQ ID NO:5所示胺基酸序列的多肽；(ⅱ)具有SEQ ID NO:6所示胺基酸序列的多肽；和(ⅲ)具有SEQ ID NO:7所示胺基酸序列的多肽。
根據基於Clustal W(1.75)的多序列對比，將SEQ ID NO:9與GDNF,persephin和neurturin的胺基酸序列相比較。對比結果示於表3。表3neublastin與persephin,neurturin和GDNF的胺基酸序列比較Neurturin-full --------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPANeublastin MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPersephin-full --------------------------------------------------------GDNF_HUMAN-full -----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNeurturin-full LVPLHPLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRFRNeublastin VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGPersephin-full -MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAJAGGTWLGTHRPLGDNF_HUMAN-full NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-full RARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEA-AARVYDLGLPRNeublastin SRARAAGARGCPLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLASPersephin-full ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAELGLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGLALARGDNF_HUMAN-full RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDKILKN* *: * ****: :.* : **:*:*:* * :. *Neurturin-full LRQRRRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACV-Neublastin LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGPersePhin-full LQGQGG------------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGGGDNF_HUMAN-full LSRNRRLVSD----KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI-.**** : ::*:* . :: : . ** *.**表示具有單個完全保守殘基的位置；表示下列「強(strong)」組之一是完全保守的-STA,NEQK,NHQK,NDEQ,QHRK,MILV,MILF,HY,FYW；·表示下列「較弱(weaker)」組之一是完全保守的-CSA,ATV,SAG,STNK,STPA,SGND,SNDEQK,NDEQHK,NEQHRK,VLIM,HFY。
由表3所示的胺基酸序列對比可以看出neublastin有7個保守的半胱氨酸殘基，它們位於TGF-β超家族保守的位置處。在一個實施方案中，優選的neublastin多肽含有(7個)保守的半胱氨酸，在SEQ IDNO:2中，保守位置為第8,35,39,72,73,101和103位，而在SEQ IDNO:4和9中，保守位置為第43,70,74,107,108,136和138。已知這7個保守的半胱氨酸殘基在TGF-β超家族形成3個單體內二硫鍵(例如，在SEQ ID NO:2中為半胱氨酸殘基8-73,35-101和39-103之間的二硫鍵，而在SEQ ID NO:4和9中為半胱氨酸殘基43-108,70-136和74-138之間的二硫鍵)和1個單體間二硫鍵(在SEQ ID NO:2中為半胱氨酸殘基72-72之間的二硫鍵，而在SEQ ID NO:4和9中為半胱氨酸殘基107-107之間的二硫鍵)，它們與延伸的β鏈區域一起構成了TGF-β超家族保守的結構基元，例見Daopin等，蛋白質，1993,17,176-192。
根據此序列對比，表明neublastin是神經營養因子GDNF亞族的成員(LGLG-FR(Y/F)CS GSC-QxCCRP-SAxxCGC，表3中下劃線的GDNF亞族指紋)。
計算neublastin與GDNF家族其它成員的同源性，結果示於下表4。
表4neublastin多肽與GDNF家族其它成員的同源性
GDNF=得自膠質細胞系的神經營養因子NTN=NeurturinPSP=PersephinIHA=抑制素-αTF-β2=轉化生長因子-β2強同源性表明下列「強(strong)」組之一是保守的STA,NEQK,NHQK,NDEQ,QHRK,MILV,MILF,HY,FYW。實施例5生產neublastin如下文所述，我們在真核和原核細胞中生產出neublastin。
表達載體將編碼neublastin的全長cDNA插入真核表達載體pUbi1Z。該載體是通過將人UbC啟動子克隆至pcDNA3.1/Zeo的經修飾形式而產生的。未經修飾的pcDNA3.1/Zeo可以商購(Invitrogen)。經修飾的pcDNA3.1/Zeo比原始載體小，因為除去了氨苄青黴素基因(第3933至5015位)和第2838至3134位的序列。在pcDNA3.1/Zeo的經修飾形式中，CMV啟動子被得自pTEJ-8的UbC啟動子(Johansen等，FEBS Lett,1990,267,289-294)取代，產生pUbi1Z。
哺乳動物細胞表達然後用含有neublastin編碼序列的pUbi1Z載體轉染哺乳動物細胞系HiB5，該細胞系是無限增殖化的大鼠神經細胞系(Renfranz等，細胞，1991,66,713-729)。已建立了幾株能穩定表達neublastin(通過RT-PCR測定)的HiB5細胞系。在一個這樣的穩定細胞系中，通過在Northern印跡上使總RNA與32P-標記的neublastin探針雜交，證實了HiB5pUbi1zNBN22的表達。這些研究的結果示於圖2。然後將HiB5pUbi1zNBN22用作neublastin的來源以研究neublastin的神經營養活性。
圖2顯示了HiB5pUbi1zNBN22克隆中的neublastin cDNA表達(即按上文所述用本發明的32P-標記的neublastin cDNA與Northern印跡雜交)。通過分別從未經轉染的HiB5細胞，HiB5pUbi1zNBN22細胞和HiB5pUbi1zGDNF14中提取總RNA來製備印跡。如印跡上所示，28S和18S rRNA帶的位置分別相當於4.1kb和1.9kb。
如圖3所示，針對neublastin-衍生多肽產生的抗體還識別HiB5pUbi1zNBN22克隆而不是未經轉染的HiB5細胞的條件培養基中約13kD的蛋白質(參見實施例6)。
經測定，未經修飾(即未經翻譯後修飾)的neublastin多肽NBN140[SEQ ID NO:10],NBN116[SEQ ID NO:11]和NBN113[SEQ IDNO:12]的推測分子量分別為14.7kD,12.4kD和12.1kD。
方法在0.8％甲醛瓊脂糖凝膠上電泳得自未經轉染的HiB5細胞和HiB5pUbi1zNBN22克隆的總RNA(10μg)，將其印跡至尼龍膜(Duralone,Stratagene)上，從而製備出Northern印跡。按實施例3所述，使印跡與1.3kb32P-標記的探針雜交並洗滌，所述探針是通過隨機標記覆蓋SEQ ID NO:8和得自neublastin cDNA之5』UTR和3』UTR的另一些核苷酸而製備的。於-80℃，使用增感屏將印跡暴露於Hyperfilm MP(Amersham)。
在添加有N2補充物(Life Technologies；Cat.No.17502-048)的無血清培養基中將得自HiB5pUbi1zNBN22或未經轉染的HiB5細胞的條件培養基保溫過夜，濃縮該條件培養基，在15％聚丙烯醯胺凝膠(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.80-1262-01)上進行分離。將蛋白質轉移至PVDF-膜(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.RPN-303F)上，用含有0.1％吐溫20和5％脫脂奶的PBS封閉非-特異性蛋白質-結合位點。將膜與多克隆的neublastin抗體(1∶1000)保溫過夜，接著與抗-兔IgG第二抗體(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.NA934)(1∶2000)保溫，所述第二抗體上綴合有辣根過氧化物酶。根據廠商說明(Amersham)，使用增強的化學發光(ECL)(Amersham PharmaciaBiotech；Cat.No.RPN2109)或ECL+(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.RPN2132)觀察免疫染色。
這些實驗的結果示於圖3。圖3A和3B顯示了經轉染的HiB5細胞中的neublastin蛋白表達。按上文所述濃縮得自未經轉染的HiB5細胞[泳道1]，或被neublastin cDNA穩定轉染的HiB5克隆[泳道2]的過夜培養基。然後使用實施例10中所述的兩個特異於neublastin的不同多克隆抗體Ab-1和Ab-2，經Western印跡分析培養基。在源自經轉染細胞的培養基中，這兩種抗體都能識別分子量約為15kDa的蛋白質，而在未經轉染的HiB5細胞中未發現這種蛋白質。
也可將編碼neublastin的克隆cDNA插入其它真核表達載體，例如真核表達載體TEJ-8(Johansen等，FEBS Lett.1990,267,289-294)或pcDNA-3(Invitrogen)，將所得表達質粒轉染至下述任一種哺乳動物細胞系，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HEK293,COS,PC12或RN33b細胞系或人神經幹細胞系。使用表達neublastin的穩定細胞系產生neublastin蛋白。在CHO細胞中表達構建質粒pJC070.14為了在中國倉鼠卵巢細胞中表達NeublastincDNA，將編碼人前Neublastin原形式的cDNA片段插入哺乳動物表達載體pEAG347以產生質粒pJC070.14。pEAG347含有串聯的SV40早期和腺病毒主要晚期啟動子(衍生自質粒pAD2β；Norton和Coffin，分子細胞生物學，1985,5,281)，唯一的NotⅠ克隆位點，緊接著的是SV40晚期轉錄終止子和polyA信號(得自質粒pCMVβ；MacGregor和Caskey，核酸研究，1989,17,2365)。另外，pEAG347含有源自pUC19的質粒骨架和源自pSV2dhfr的dhfr供MTX選擇和在經轉染的CHO細胞中擴增。
分兩步產生質粒pJC070.14。首先，用寡核苷酸KD2-8245』AAGGAAAAAAGCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3』[SEQ ID NO:31],KD2-8255』TTTTTTCCTT GGCGG CCGCTCAGCCCAGGC AGCCGCAGG3』[SEQ ID NO:32]和PFU聚合酶，經聚合酶鏈反應從質粒pUbi1Z-NBN中分離出編碼人前Neublastin原形式的片段。將該片段克隆至pPCR-Script Amp SK(+)的Srf-1位點以產生質粒pJC069。在第二步中，對質粒pJC069進行部分Not-Ⅰ消化，產生685bp片段(含有neublastin基因)，將其克隆至質粒pEAG347的Not-Ⅰ位點，產生質粒pJC070.14。質粒pJC070.14中的neublastin基因轉錄受腺病毒主要晚期啟動子的控制。
產生表達neublastin的CHO細胞系通過用限制性內切核酸酶Mlu-Ⅰ消化使200微克pJC070.14線性化。用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取DNA，並用乙醇沉澱。將線性化的DNA重新懸浮於20mM HepespH7.05,137mM NaCl,5mM KCl,0.7mM Na2HPO4,6mM葡萄糖(HEBS)中，通過電穿孔(280V和960μF)導入～4E7 CHO dukx B1(dhfr-)細胞(p23)。電穿孔之後，將細胞返回添加有10％胎牛血清(FBS)的α+經改良的Eagle氏培養基(MEM)中培養2天。然後用胰蛋白酶消化細胞，重新鋪於100mm平皿(100,000個細胞/皿)內的α-MEM(缺乏核糖和脫氧核糖核苷)中培養5天，所述培養基中添加有10％經透析的FBS。隨後，以100,000個細胞/100mm平皿的密度使細胞分開，並在200nM氨甲蝶呤中選擇。挑選抗性集落，刮至6孔培養板；使用下文所述的專用於neublastin的試驗篩選得自各個克隆的條件培養基。將neublastin表達水平最高的12個克隆刮至T162培養瓶中，隨後再進行分析。如圖10所示，CHO細胞系產生25至50ng/ml neublastin。
neublastin的三元複合物試驗我們使用Sanicola等(Proc NatlAcad Sci USA 1997 94 6238)所述的三元複合物試驗的經改良形式分析CHO細胞系培養物的上清液中是否存在neublastin。
在此試驗中，可評價GDNF-樣分子介導RET之胞外結構域與多個共同-受體，GFRα1,GFRα2和GFRα3之間的結合的能力。RET的可溶性形式和共同受體以融合蛋白的形式產生。已有人描述了大鼠RET之胞外結構域和胎盤鹼性磷酸酶(RET-AP)之間的融合蛋白，以及大鼠GFRα1(WO9744356；1997年11月27日，列入本文作為參考)的胞外結構域和人IgG1(rGFRα1-Ig)之Fc結構域之間的融合蛋白(Sanicola等，Proc NatlAcad Sci USA 1997 94 6238)。
為了產生鼠GFRα3之胞外結構域和人IgG1(mGFRα3-Ig)之Fc結構域之間的融合蛋白，將編碼鼠RETL3之胺基酸1-359的DNA片段與含有人IgG1之Fc結構域的片段連接，克隆至表達載體pEAG347以產生質粒pGJ144。將質粒pGJ144轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，產生能生產融合蛋白的穩定細胞系，使用標準方法在A蛋白Sepharose免疫親和柱上純化該融合蛋白。簡而言之，如果GDNF-樣分子能在此試驗中介導共同受體與RET的結合，那麼，RET-AP融合蛋白可保留在平板上，使用鹼性磷酸酶的化學發光底物可測定保留量。
用含有1μg/ml特異於人Fc的山羊抗體的50mM碳酸氫鹽/碳酸鹽，pH9.6將Dynex Microlite-1 ELISA板(Dynex Technologies)包被16小時。將ELISA板清空，加入300μl含有1％I-block(Tropix)的TBS/0.5％吐溫-20(TBST)放置1小時。用TBST洗滌3次之後，在孔中加入100μl用條件培養基稀釋過的1μg/ml rGFRα1-Ig或mGFRα3-Ig，所述條件培養基得自表達RET-AP融合基因的293 EBNA細胞。然後在豎行孔的上孔中加入100μl得自CHO neublastin克隆的條件培養基，每排孔往下進行2倍連續稀釋，室溫下保溫1.5小時。然後用TBST將ELISA板洗滌3次，用200mMTris pH9.8,10mM MgCl2(CSPD緩衝液)洗滌2次。然後用含有425μM CSPD(Tropix)和1mg/ml Sapphire化學發光增強劑(Tropix)的CSPD緩衝液替代洗滌溶液，室溫下保溫30分鐘。使用Dynatech發光計測定化學發光輸出量。
在最初的實驗中，我們研究了CHO細胞系所產生的neublastin是否能介導GFRα1或GFRα3與RET之胞外結構域的結合。如圖11所示，當包括mGFRα3-Ig融合蛋白時，得自CHO細胞克隆#53的條件培養基在三元複合物試驗中產生了強烈信號，但是，當包括rGFRα1-Ig融合蛋白時未觀察到信號，這表明neublastin與GFRα3而不是GFRα1結合。這一行為將neublastin與GDNF清楚地區分開來；如圖11所示，GDNF結合GFRα1而不是GFRα3。當檢測得自胎盤CHO細胞系的條件培養基或純粹的培養基時，用任一種共同受體融合蛋白都未觀察到信號。
為了定量CHO細胞系中的neublastin表達水平，使用rGFRα1-Ig和濃度始於1ng/ml的GDNF繪製標準曲線。然後使用該標準曲線計算不同CHO細胞系的neublastin濃度；由5個CHO細胞系產生的水平示於圖10。由於這一估計的根據是未經測試的假設，即GDNF和GFRα1之間的結合親和性類似於neublastin和GFRα3之間的結合親和性，因此這些水平僅是大致的數值。分析得自CHO細胞系上清液的neublastin為了進一步分析由CHO細胞系產生的neublastin，使用GFRα3-Ig融合蛋白從培養基中提取蛋白質，並通過用針對neublastin肽的多克隆抗體進行Western印跡以分析這些蛋白質。
在第一個實驗中，用結合於Sepharose珠上的mGFRα3-Ig提取neublastin。使用廠商(Pharmacia公司)建議的條件使mGFRα3-Ig與Sepharose珠結合。在1.0ml得自陰性對照CHO細胞系或得自生產neublastin的CHO細胞系#16的條件培養基樣品中加入100μlmGFRα3-Ig-Sepharose。在搖動的平臺上將懸浮液保溫2小時。離心各懸浮液，除去上清液，然後用1.0ml 10mM HEPES,100mM NaCl,pH7.5洗滌3次。將各樹脂重新懸浮於100μl 2×還原樣品緩衝液中，加熱至100℃達5分鐘。將20μl樣品緩衝液上清液和10μl分子量標準(FMC)上樣於10-20％SDS-PAGE預製凝膠(Owl Scientific)的各孔中。以40mA的恆電流電泳凝膠72分鐘。
為了進行Western印跡分析，在Hofer Scientific裝置中，在10mMCAPS,10％甲醇，0.05％SDS,pH11.2的緩衝液系統內將蛋白質電印跡至硝酸纖維素濾膜(Schleicher和Schuell)(400mA恆電流，45分鐘)。轉移之後，從盒中取出硝酸纖維素濾膜，通過用含有0.1％Ponceau S的1％醋酸溶液染色60秒以用內眼觀察分子量標記。將膜切成兩節，通過在蒸餾水中輕輕攪動以除去過量的染料。4℃，用含有2％脫脂奶的TBS將膜封閉過夜。將兩片膜各與兩個經親和純化的抗-neublastin肽抗體(R30和R31)保溫，所述抗體的濃度為1.0μg/ml，並且溶於含2％脫脂奶的TBS中。用TBS-吐溫將膜洗滌3次，每次10分鐘，然後與經1∶5000稀釋的山羊抗-兔IgG-HRP綴合物(Biorad)保溫30分鐘。用TBS-吐溫將膜洗滌3次，每次10分鐘，用ECL底物(Amersham)顯色。如圖12所示，相對於用上述兩種抗體在提取自陰性對照細胞系的蛋白質中所觀察到的帶(泳道1和3)而言，在提取自生產neublastin的CHO細胞系的蛋白質中檢測到特異性的帶(泳道2和4)。
較低的帶的分子量約為13kD，可能表示neublastin的成熟結構域，該結構域是在裂解原-結構域之後產生的。所述裂解可以在前neublastin原蛋白的3個Arg-＿(如-RXXR↓-)殘基中的任一個之後發生，從而分別產生SEQ ID NO:10,11或12所示的140AA,116AA或113AA形式。經測定，未經修飾(即未經翻譯後修飾)的neublastin多肽NBN140[SEQ ID NO:10],NBN116[SEQ ID NO:11]和NBN113[SEQ IDNO:12]的推測分子量分別為14.7kD,12.4kD和12.1kD。需要進一步的分析以證實這些帶的結構以及其它neublastin特異性帶。
在第二個實驗中，用ELISA板所捕獲的hGFRα3-Ig提取neublastin。為了產生人GFRα3(WO97/44356；1997年11月27日，列入本文作為參考)的胞外結構域和人IgG1(hGFRα3-Ig)之Fc結構域之間的融合蛋白，將編碼人GFRα3之胺基酸1-364的DNA片段與含有人IgG1之Fc結構域的片段連接，克隆至表達載體CH269 (Sanicola等，Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238)。由此質粒編碼的融合蛋白在293-Epstein-Barr病毒所編碼的核抗原(EBNA)細胞中瞬時表達，使用標準方法在A蛋白Sepharose免疫親和柱上純化該融合蛋白。
4℃，用含有25mg/ml山羊抗人IgG(Fcγ片段特異性的；JacksonImmunulogics)的PBS(300ml/孔)將96孔培養板的6個孔包被過夜。室溫下，用400ml含1％BSA的PBS將孔封閉1小時。用PBST(PBS+0.05％吐溫20)洗滌3次，在每孔中加入300ml hGFRα3-Ig(10mg/ml，溶於含0.1％BSA的PBS中)。室溫下將培養板保溫1小時，輕輕振蕩(每分鐘振蕩200下)以進行最大程度的結合。然後清空孔，用PBST再洗滌3次。在3個孔中各自加入250ml得自陰性對照CHO細胞系或得自生產neublastin的CHO細胞系#25的條件培養基。室溫下將培養板保溫3小時，輕輕振蕩(每分鐘振蕩300下)，用PBST將孔再洗滌2次。在第一個孔中加入25ml非-還原性的Laemli上樣緩衝液，將培養板快速振蕩5分鐘以洗脫結合的蛋白質(每分鐘振蕩1300下)。將內容物轉移至下一個孔中，重複上述方法以洗脫第二和第三個孔中結合的蛋白質。加入b-巰基乙醇(終濃度為5％)之後，將樣品煮沸5分鐘，在10-20％聚丙烯醯胺凝膠上通過SDS-PAGE分析樣品。
為了進行Western印跡，將蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上。用含有5％脫脂奶的PBST封閉和探測膜，並用PBST洗滌膜。與針對兩個neublastin肽產生的多克隆抗體(R30和R31)(1ug/ml)反應，接著與HRP-綴合的山羊抗兔抗體(BioRad)反應之後，通過電化學發光檢測neublastin。如圖13所示，在提取自生產neublastin的CHO細胞系的蛋白質中檢測到5條neublastin特異性帶(泳道2)。較下方的兩條帶與在圖12中所觀察到的帶非常相似；較下方的帶可能也表示neublastin的成熟結構域，該結構域是在裂解原-結構域之後產生的。
隨後，對圖13中的帶進行分析(數據未顯示)，結果表明用PGNaseF使約為18kD的帶去糖基化後，該帶的大小等同於圖13凝膠中最下HiB5pUbi1zNBN22細胞的條件培養基所發揮的作用。
製備培養物在冷的Hanks緩衝鹽溶液(HBSS)中，解剖得到大鼠E14胚胎的前側中腦或脊髓。於37℃，在含有經無菌過濾的0.1％胰蛋白酶(Worthington)和0.05％DNA酶(Sigma)的HBSS中將組織塊保溫20分鐘。然後用HBSS+0.05％DNA酶將組織塊衝洗4次，使用1ml自動移液管解離。將懸浮液以600rpm離心5分鐘，將沉澱物重新懸浮於血清條件培養基(SCM；含10％胎牛血清的DMEM)中。通過臺盼藍染料排除法評估細胞總數，以100,000個細胞/cm2的密度鋪於用聚-L-賴氨酸包被的8孔槽載玻片(Nunc)上，評估多巴胺能神經元的存活；或者以200,000個細胞/cm2的密度鋪於48孔培養板(Nunc)上以測定ChAT活性。於37℃，在SCM中，在5％CO2/95％O2和95％溼度的氛圍下將細胞保溫24至48小時，然後用添加有神經營養因子的無血清培養基(SFM)更換原培養基。
將評估多巴胺能神經元存活所用的細胞在SFM+營養因子中放置5天，然後用4％PFA固定5分鐘，通過免疫組化染色酪氨酸羥化酶。
將測定ChAT活性的細胞在SFM中放置3天，然後用HBSS+0.1％Triton X-100裂解，立即在乾冰中冷凍直至測定ChAT活性。
加入營養因子由未經轉染的HiB5對照或生產neublastin(HiB5pUbi1zNBN22)或GDNF(HiB5pUbi1zGDNF-L17)的HiB5收集條件培養基。通過對收集自細胞的條件培養基進行GDNF-ELISA測定，證實HiB5pUbi1zNBN22產生約20ng的GDNF/24小時/105個細胞。將各個細胞系與DMEM+1％FCS保溫過夜，取出上清液，儲存於-20℃待用。當加入細胞中時，用SFM將上清液稀釋50倍。用HiB5對照上清液(1∶50)+純化的重組大鼠GDNF(0.03-10ng/ml)處理各個孔。
這些實驗的結果示於圖4。如上文實施例5.1所述，圖4A-4C顯示出HiB5pUbi1zNBN22細胞分泌的neublastin在無血清培養基中對經培養的大鼠胚胎神經元，多巴胺能神經元，前側中腦神經元存活的影響和對膽鹼能顱神經運動神經元中的ChAT活性的影響。
圖4A闡明了重組GDNF對ChAT活性(dpm/小時)之影響的劑量-反應曲線，所述活性是於DIV5在無血清培養物中測定的，所述培養物最初是由E14前側中腦建立的[即HiB5；GDNF 0.03ng/ml；GDNF0.1ng/ml；GDNF 0.3ng/ml；GDNF 1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/ml]。
圖4B闡明了於DIV5在無血清培養物中測定的ChAT活性(dpm/小時)，所述培養物最初是由E14前側中腦建立的。如圖中所示，加入了經稀釋的得自生產neublastin的HiB5pUbi1zNBN22細胞(neublastin)或生產GDNF的HiB5GDNF-L17(GDNFL-17)細胞的條件培養基[即neublastin 1∶10；neublastin 1∶50；GDNF L-17 1∶50]。
圖4C闡明了於DIV7在無血清培養物中測定的每孔中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數目[TH+細胞數目/孔]，所述培養物最初是由E14前側中腦建立的。如圖中所示，加入了經稀釋的得自未經轉染的HiB5細胞(HiB5)或生產neublastin的HiB5pUbilzNBN22細胞(neublastin)的條件培養基，或多種濃度的重組GDNF[即HiB5 1∶10；HiB5 1∶40；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/ml和neublastin 1∶40]。
與相同和較低稀釋度(1∶10和1∶40)的對照(未經轉染的)HiB5細胞相比，按1∶40稀釋的得自經neublastin轉染的HiB5細胞的條件培養基能顯著增加每孔中的TH免疫反應細胞數目(例見圖4B)。TH-免疫反應細胞的增加與GDNF濃度最大(10ng/ml)時觀察到的增加差不多。這表明分泌至培養基中的neublastin對得自大鼠胚胎前側中腦的多巴胺能神經元群體的存活有影響。相反，與經轉染的HiB5細胞分泌的GDNF不同的是，得自經neublastin轉染的HiB5細胞的條件培養基對相同培養物中的另一個神經元群體，即膽鹼能神經元沒有影響(例見圖4A)。實施例7neublastin對豬胚胎多巴胺能前側中腦神經元的薄切片培養物存活的影響在此實驗中，研究了共培養的生產neublastin的方的那條帶。這表明哺乳動物細胞中可產生糖基化形式的neublastin蛋白。在大腸桿菌中表達neublastin為了在大腸桿菌中表達neublastin基因，用較低的GC含量和偏好的大腸桿菌密碼子構建合成基因。將合成基因克隆至兩個載體pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的構建示於圖14。在此構建體中，編碼neublastin之成熟結構域(NBN113)的序列直接與起始甲硫氨酸融合。pMJB164的構建示於圖15。在此構建體中，neublastin的成熟結構域與被腸激酶裂解位點分開的組氨酸標記(即10個組氨酸)融合。組氨酸標記的前面是起始甲硫氨酸。編碼圖14中的neublastin的核苷酸序列ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID NO:29]編碼圖15中的his-標記的neublastin的核苷酸序列ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG [SEQ ID NO: 30]實施例6neublastin對大鼠胚胎多巴胺能神經元的存活和ChAT活性的影響在此實驗系列中，評估了得自上文所述的生產neublastin的HiB5pUbi1zNBN22細胞對豬胚胎前側中腦之薄切片培養物的影響。
製備培養物在無菌條件下由豬胚胎(E28；n=12)分離前側中腦(VM)，切成400μm的薄切片，置於冷的含葡萄糖(6.5mg/ml)的Gey氏平衡鹽溶液(GIBCO)。通過界面培養法培養組織切片，所述方法最初是由Stoppini等[L.Stoppini,P.A.Buchs,D.Muller,神經科學方法雜誌，1991,37,173-182]發展起來的。
簡單地說，將組織切片置於半透膜(Millipore,0.3μm；對應於一個VM，每張膜上放8個切片)上，將膜插入6孔板(Costar)中的含血清培養基(Gibco BRL)中。每孔含有1ml培養基(50％0ptimem,25％馬血清，25％Hank氏平衡鹽溶液(都得自GIBCO))，其中添加有終濃度為25mM的D-葡萄糖。第0天，在每個組織切片上接種7000個經轉染的HiB5pUbi1zNBN22(neublastin)或7000個未經轉染的HiB5細胞(對照)。首先在33℃的溫箱中共培養48小時，使得因具有溫度敏感型癌基因而無限增殖化的HiB5細胞得以增殖，然後轉移至37℃的溫箱使HiB5細胞分化。每周換2次培養基。在任何階段都不使用抗有絲分裂劑和抗生素。
通過HPLC測定多巴胺在體外第12和21天，收集培養基，使用具有電化學檢測的HPLC分析多巴胺(W.N.Slooth,J.B.P.Gramsbergen，神經科學方法雜誌，1995,60,141-49)。
組織處理和免疫組化在第21天，在含4％低聚甲醛的磷酸鹽緩衝液中將培養物固定60分鐘。在20％蔗糖溶液中脫水24小時，冷凍，在低溫恆溫器上切下20μm的切片(4個系列)，將切片置於包被有明膠的顯微鏡載玻片上。對一個切片系列中的酪氨酸羥化酶(TH)進行免疫染色。簡單地說，用含有1％Triton X-100的0.05M Tris-緩衝鹽水(TBS,pH7.4)將切片洗滌3×15分鐘，並與含有10％胎牛血清(FBS,LifeTechnologies)的TBS保溫30分鐘。然後於4℃將組織與用含10％FBS的TBS稀釋600倍的小鼠抗TH單克隆抗體(Boehringer Mannheim)保溫24小時。用含1％Triton X-100的TBS洗滌3×15分鐘之後，將切片與用含10％FBS的TBS稀釋200倍的生物素化抗小鼠IgG抗體(Amersham)保溫60分鐘。然後用含1％Triton X-100的TBS洗滌切片(3×15分鐘)，並與用含10％FBS的TBS稀釋200倍的鏈黴抗生物素蛋白-過氧化物酶(Dako)保溫60分鐘。用TBS洗滌(3×15分鐘)之後，通過用含有0.05％3,3-二氨基聯苯胺(Sigma)和0.01％H2O2的TBS處理以觀察結合的抗體。最後，用乙醇使切片脫水，用二甲苯清洗切片，並在Eukitt中覆蓋封套。
細胞計數和形態測量分析使用亮視野顯微鏡(Olympus)對免疫反應性的TH-ir神經元進行定量測定。僅計數顯示出強染色的，且細胞結構保持完好，細胞核清晰可辨的細胞。使用×20倍的物鏡對每4個培養物切片進行細胞計數，以此為基礎進行估計。根據Abercrombie’s公式(M.Abercrombie,Anat.Rec.1946 94 239-47)，使用TH-ir神經元的核平均直徑(6.6±0.2μm,n=30)校正兩次計數的細胞數目。使用神經元示蹤系統(Neurolucida,Micro-BrightField公司)估計核的大小。
這些實驗的結果示於圖5。圖5A-5C闡明了HiB5pUbi1zNBN22細胞分泌的neublastin對與HiB5pUbi1zNBN22細胞(neublastin)或HiB5細胞(對照)共培養的豬胚胎多巴胺能前側中腦神經元之切片培養物的功能和存活的影響。圖5A和圖5B分別闡明了於DIV12[多巴胺(pmol/ml)-第12天]和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天]釋放至培養基中的多巴胺。圖5C闡明了於DIV21，每個切片培養物中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數目[TH-ir細胞/培養物]。
在第12天，HPLC分析表明得自HiB5-neublastin共培養物的培養基所含有的多巴胺比得自HiB5-C共培養物的培養基中的多巴胺多84％(圖5A)。在第21天，差異是78％(圖5B)，細胞計數表明HiB5-neublastin共培養物含有的酪氨酸羥化酶免疫反應神經元比HiB5-C共培養物的多66％(p＜0.05)(圖5C)。這表明HiB5pUbi1zNBN22克隆分泌的neublastin對豬胚胎多巴胺能神經元的存活具有潛在的影響。實施例8無血清培養基中側根神經節細胞的存活本實施例顯示出neublastin多肽與已知神經營養因子相比較的神經營養活性。
通過頸脫位處死懷孕的雌性小鼠，按下述處理胚胎以進行培養。
使用經電解削尖的鎢針頭，由所示階段的C57/B16小鼠(Mollegaard Breeding,Denmark)解剖得到側根神經節。於37℃，將胚胎神經節與含有0.05％胰蛋白酶(Gibco/BRL)的無鈣和鎂的Hanks平衡鹽溶液保溫5分鐘。用膠原酶/分散酶(1mg/ml)將神經節處理30至45分鐘，然後用胰蛋白酶/DNA酶(0.25％)處理15分鐘。除去胰蛋白酶溶液之後，用10ml含有10％熱滅活馬血清的DMEM將神經節洗滌1次，用經燒邊處理的Pasteur移液管將神經節輕輕搗碎以得到單細胞懸浮液。
將細胞鋪於預先用聚鳥氨酸(0.5mg/ml，過夜)和層粘連蛋白(20mg/ml,4小時；Gibco/BRL)包被的24孔培養板(Nunc)上，於37℃，在潮溼的5％CO2溫箱內的確定培養基中保溫神經元，所述培養基由添加有2mM穀氨醯胺，0.35％牛血清白蛋白，60ng/ml孕酮，16mg/ml腐胺，400ng/ml L-甲狀腺素，38ng/ml硒酸鈉，340ng/ml三碘代-甲狀腺原氨酸，60mg/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素的Hams F14組成。
保溫48小時之後，在相差光學顯微鏡下，因神經元的兩極形態而能清楚地識別該神經元。通過在第48小時時計數孔中的神經元來評估神經元在缺乏或存在營養因子(在接種神經元之前加入培養基中，濃度為10ng/ml)時的存活百分比，或在得自生產neublastin的HiB5pUbi1zNBN22細胞的條件培養基中的存活百分比。
這些實驗的結果示於圖9，其中0表示對照實驗(缺乏營養因子)；1表示存在GDNF時的實驗；2表示存在Neurturin時的實驗；3表示存在本發明的Neublastin時的實驗；E12表示對分離自12天-胚胎的DRG細胞所進行實驗的數據；E16表示對分離自16天-胚胎的DRG細胞所進行實驗的數據；
P0表示對分離自出生當天的DRG細胞所進行實驗的數據；P7表示對分離自出生後7天的DRG細胞所進行實驗的數據；和P15表示對分離自出生後15天的DRG細胞所進行實驗的數據。
這些結果清楚地表明本發明的神經營養因子顯示出相當於或甚至優於已知神經營養因子的活性。實施例9neublastin對黑質多巴胺神經元的體內影響為了檢測neublastin是否能夠保護成熟黑質多巴胺(DA)神經元免受6-羥基多巴胺誘導的降解，我們利用了患帕金森氏病的大鼠模型(Sauer和Oertel，神經科學，1994,59,401-415)以及neublastin的慢病毒基因轉移。
慢病毒的產生為了產生編碼neublastin的慢病毒轉移載體pHR』-neublastin，將得自neublastin cDNA的1331bp BamHⅠ片斷亞克隆至pSL301(Invitrogen)的BamHⅠ/BglⅡ位點。從此構建體上切下1519bp的BamHⅠ/XhoⅠ片斷，連接至pHR』的BamHⅠ/XhoⅠ位點，所述pHR』攜有土撥鼠肝炎病毒翻譯後片斷(Zufferey R,Donello JE,Trono D,Hope TJ土撥鼠肝炎病毒轉錄後的調節元件能增強由逆轉錄病毒載體傳遞的轉基因的表達；病毒學雜誌，1999 73(4):2886-2892)。為了產生pHR-GDNF，將得自pUbi1z-GDNF的701bpBamHⅠ/XhoⅠ片斷連接至pHR』的BamHⅠ/XhoⅠ位點。
Zufferey等人描述了慢病毒載體的產生(Zufferey R,Nagy D,Mandel RJ,Naldini L,Trono D多重減毒的慢病毒載體能在體內進行有效的基因傳遞；Nat.Biotechnol,1997,15(9)871-875)。簡單地說，用轉移構建體和輔助質粒pR8.91和pMDG共同轉染293T細胞。在轉染後48和72小時收集釋放至培養基中的毒粒。為了濃縮病毒，以141000g將培養基離心1.5小時，並將沉澱物溶解於DMEM中。通過GFP螢光，測定出283T細胞中的攜有綠色螢光蛋白(GFP)基因的對照的滴度為108個轉化單位(TU)/ml。使用RNA狹線印跡技術(von Schwedler U,Song J,Aiken C,Trono D:Vif對感染細胞中的人Ⅰ型免疫缺損病毒原病毒DNA合成至關重要，病毒學雜誌，1993,67(8)4945-4955)測定病毒顆粒的滴度。在GDNF上清液和neublastin上清液中，病毒顆粒比GFP上清液中的少10倍。
外科手術方案所有涉及動物的工作都按照Lund大學實驗室動物使用倫理委員會所制訂的細則執行。
總共使用21隻剛成年的雌性Sprague-Dawley大鼠(BK Universal,Stockholm,Sweden)，在12小時光照黑暗周期中圈養這些大鼠，圈養過程中不給大鼠進食和餵水。在損害前3周，根據Sauer和Oertel(Sauer和Oertel，神經科學，1994,59,401-415)所述進行逆行標記和6-OHDA損害。簡單地說，在Equithesin麻醉(0.3ml/100g)下，給大鼠兩側注射0.2μl 2％逆行示蹤Fluoro-Gold(FG；Fluorochrome公司，Englewood,CO)溶液(溶解於0.9％NaCl中)。使用2μl Hamilton注射器在以下坐標處進行注射AP=+0.5mm；ML=離前囟門+3.4mm；DV=離硬腦膜-5.0mm，切齒線被設置於0.0mm。另外，在抽出針頭之前，以0.05μl/min的速度再注射5分鐘。
在FG注射之後14天，動物總共接受5個慢病毒載體沉積物(1μl/沉積物)，所述載體攜有綠色螢光蛋白(GFP),neublastin或GDNF的基因。在下列坐標處，沿著兩條針道將4個沉積物注射至紋狀體AP=+1.0mm,ML=-2.6mm,DV1=-5.0mm,DV2=-4.5mm和AP=0.0mm,ML=-3.7mm,DV1=-5.0mm,DV2=-4.5mm。在AP=-5.2mm,ML=-2.0mm,DV1=-6.3mm處將沉積物注射至黑質上。切齒線被設置於-2.3mm。
逆行標記21天之後，和注射慢病毒7天之後，重新麻醉動物，用10μl Hamilton注射器將單個沉積物，即20μg 6-OHDA(Sigma；計算為游離鹼基並溶解於3μl冰冷的添加有0.02％抗壞血酸的鹽水中)注射至與FG沉積物位置相同的右紋狀體。注射速率為1μl/min，在抽出針頭之前再保留3分鐘。
組織處理在注射6-OHDA之後21天，用水合氯醛深度麻醉動物，經賁門灌流鹽水(pH7.4；室溫)達1分鐘，接著灌流200ml冰冷的甲醛溶液(含4％低聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩衝液，pH7.4)。解剖取腦，在相同的固定劑中固定3至4小時，然後轉移至25％蔗糖/0.1M磷酸鹽緩衝液中放置48小時。在冰冷的切片機上切下穿過紋狀體和黑質(SN)的5個40μm切片系列。
定量評估SN中的多巴胺能神經元如前人所述(Sauer和Oertel,神經科學，1994,59,401-415)，通過不透光的觀察儀評估SN雙緻密層中經FG標記的神經元數目。簡單地說，使用了3個連串切片，這些切片集中於輔助視束的中間末端核水平線周圍(MTN；Paxinos和Watson(1997)圖片-5.3)，以40倍的放大倍數計數MTN側向的所有經標記/染色的神經元(n=6-7/組)。如果FG-標記的神經元在波長為330nm的表面照射下能發出明亮的螢光，顯示出神經元分布圖並延伸至少一個神經過程，即將這些神經元包括在內。
在接受攜有GFP之慢病毒注射的動物的受損害的一側，FG-陽性黑質神經元的數目降低為完好的一側的18％。相反，用慢病毒-neublastin注射的動物顯示出對FG-陽性黑質神經元數目近乎完全的保護(89％)。這與用慢病毒-GDNF處理的動物同樣有效，其中87％逆行標記的神經元保留在受損的一側。這表明neublastin對受損的成年黑質多巴胺神經元而言是強有力的存活因子，並且象GDNF一樣有效。
圖6闡明了慢病毒產生的neublastin對黑質多巴胺神經元的體內影響。用Flurogold(FG)逆行標記雌性Sprague Dawley大鼠的SN雙緻密層中的神經元，3周後用6-羥基多巴胺(6-OHDA)單次注射右紋狀體。在注射6-OHDA之前1周，如圖所示，使動物接受表達neublastin[neublastin],GDNF[GDNF]或綠色螢光蛋白[GFP]的慢病毒載體注射。注射6-OHDA 21天之後，測定紋狀體兩側經FG標記的神經元數目。圖中顯示出3組動物紋狀體的損害(右)側對完好(左)側中經FG標記的神經元的百分比[％FG損害/完好]。實施例10產生抗體為了製備抗neublastin的抗體，以3周為間隔，用肽1CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO:9的胺基酸108-124)或肽2ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的胺基酸93-107)免疫2隻兔子，所述肽與載體蛋白綴合。在第0,3,6和10周用每種肽免疫2隻兔子，在第7和11周收集血液。經由肽親和柱親和純化第二次採的血液。根據肽的不同，將抗體稱為Ab-1和Ab-2。
Western印跡在含有N2添加物(GIBCO)的無血清培養基中將2×106個被neublastin cDNA穩定轉染的HiB5細胞(HiB5pUbi1zNBN22)或未經轉染的HiB5細胞保溫過夜。在具有5kDa截留膜(Millipore,Bedford,MA)的小濃縮器上濃縮培養基，在濃縮的樣品中加入5×Laemmli樣品緩衝液，加熱至95℃5分鐘，在15％丙烯醯胺凝膠上通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離樣品，並轉移至PVDF-膜。用含有5％脫脂奶和0.1％吐溫-20的PBS封閉殘留的蛋白質-結合位點。將膜與neublastin抗體(1∶1000)保溫過夜，接著與同辣根過氧化物酶綴合的抗兔或抗小鼠IgG第二抗體(1∶2000)保溫。
根據廠商(Amersham)說明，使用增強的化學發光Plus(ECL+)觀察免疫染色。這些實驗的結果示於圖3和實施例5。
使用標準技術，我們還針對下列肽產生了兔多克隆抗體肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO:9的胺基酸30-43)；肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的胺基酸57-70)；肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO:9的胺基酸74-85)；肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的胺基酸94-107)；和肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO:9的胺基酸123-136)。
在該組肽中，只有相對靠近於C末端的肽R30和R31才能識別Western印跡上的在還原條件下變性的蛋白質。
序列表16033170PatentIn Ver.2.02101211865212DNA213Homo sapiens220221CDS222(120)..(719)2202215′UTR222(1)..(119)2202213′UTR222(721)..(865)220221sig_肽222(120)..(179)220221mat_肽222(405)..(719)220221misc_結構222(661)..(663)223CARBOHYD:在Asn 87處的糖基化天冬醯胺220221misc_結構222(426)..(623)223DISULFID-Cys8-Cys73二硫橋220221misc_結構222(507)..(707)223DISULFID:Cys35-Cysl01二硫橋220221misc_結構222(519)..(713)223DISULFID:Cys39-Cys103二硫橋220221misc_結構222(616)..(619)223DISULFID:Cys72-Cys72鏈間二硫橋4001ctaggagccc atgcccggcc tgatctcagc ccgaggacag cccctccttg aggtccttcc 60tccccaagcc cacctgggtg ccctctttct ccctgaggct ccacttggtc tctccgcgc 119atg cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg ctg agc agc 167Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser-95 -90 -85 -80gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct gcc ccc cgc215Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg-75 -70 -65gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac ctg ccg ggg263Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly 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Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr195 200 205Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly210 215 2202101721118212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40017cctggccagc ctactggg182101821120212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40018aaggagaccg cttcgtagcg 202101921117212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40019atggaacttg gacttgg 172102021116212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40020tccatcaccc accggc162102121118212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40021ggccaccgct ccgacgag 182102221120212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40022ggcggtccac ggttctccag 202102321129212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40023ccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc 292102421127212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40024catcacccac cggcaggggc ctctcag 272102521135212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40025gagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca352102621134212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40026ccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc 342102721131212DNA213人工序列220223人工序列的描述雜交40027ncaggtggtc cgtggggggc gccaagaccg g312102821116212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40028ctaggagccc atgccc 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1．分離的neublastin核酸，所述核酸含有SEQ ID NO:1,3,8,13,14,15,29和30中的任一個所示的序列。
2．核酸序列，其含有編碼neublastin神經營養因子或其獨特的亞區域的開放閱讀框，該閱讀框編碼neublastin多肽的表達，所述多肽與SEQ IDNO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16具有至少70％的同源性。
3．核酸，它在高度嚴緊的溶液雜交條件下能與權利要求1或2的核酸特異性雜交。
4．核酸，其含有與權利要求3的核酸互補的核酸序列。
5．使用權利要求1至4之任一項的核酸的方法，所述方法包括在細胞中表達由所述核酸編碼的多肽的步驟。
6．權利要求5的方法，其進一步包括給動物施用所述核酸，並在所述動物中表達所述多肽的步驟。
7．含有權利要求1至4之任一項的核酸的載體。
8．權利要求7的載體，其中所述載體是表達載體。
9．使用權利要求8的載體的方法，所述方法包括由所述核酸表達由所述核酸編碼的多肽的步驟。
10．被權利要求1至4之任一項的核酸轉化的細胞。
11．權利要求10的細胞，其中所述細胞選自哺乳動物細胞，真菌細胞，酵母細胞，昆蟲細胞和細菌細胞。
12．權利要求11的方法，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
13．權利要求11的方法，其中所述細胞是得自哺乳動物中樞神經系統的細胞。
14．neublastin神經營養因子多肽，其含有SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16中的任一個所示的胺基酸序列。
15．權利要求14的多肽，其中所述多肽是糖基化的多肽。
16．權利要求14的多肽，其中所述多肽由權利要求1至4之任一項的核酸所編碼。
17．製備權利要求14至16之任一項的多肽的方法，所述方法包括由neublastin神經營養因子核酸表達所述多肽的步驟。
18．權利要求17的方法，所述方法包括在允許生產所述多肽的培養基中培養含有所述neublastin神經營養因子核酸的細胞的步驟。
19．權利要求18的方法，其進一步包括從所述培養基中回收所述多肽的步驟。
20．通過權利要求19的方法得到的純化多肽。
21．組合物，其含有權利要求14至16和20之任一項的多肽和藥物可接受載體。
22．多肽，其具有的胺基酸序列與SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16中的任一個所示的序列至少90％同源。
23．施用權利要求14至16和20之任一項的多肽的方法，所述方法包括將所述多肽傳遞至體外細胞培養物或哺乳動物體內的步驟。
24．權利要求23的方法，其中所述施用包括全身性給藥。
25．權利要求23的方法，其中所述哺乳動物患有選自下列的疾病大腦局部缺血性神經元損傷，外傷性腦損傷，外周神經病，阿爾茨海默氏病，亨廷頓氏病，帕金森氏病，肌萎縮性側索硬化和記憶減退。
26．權利要求23的方法，其中所述哺乳動物患有外周神經系統，髓質或脊髓的神經元失調。
27．治療動物的神經變性疾病或失調的方法，所述方法包括給所述動物施用一種或多種SEQ ID NO:1,3,8,13,14,15,29和30所示的neublastin核酸。
28．治療動物的神經變性疾病或失調的方法，所述方法包括給所述動物施用一種或多種SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的neublastin多肽。
29．抗體，所述抗體與SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一種多肽結合。
30．權利要求29的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
31．測定動物的神經變性疾病或失調是否與neublastin神經營養因子多肽的活性改變有關的方法，所述方法包括步驟(a)將得自所述動物的生物樣品與權利要求29或30的抗體接觸，和(b)測定所述抗體與所述蛋白質之間是否形成免疫複合物，以此判斷所述神經元病症是否由所述neublastin神經營養因子多肽的活性水平改變所引起。
32．權利要求31的方法，其進一步包括將所述樣品中形成的所述免疫複合物的水平與得自未患所述神經元病症的患者的相應生物樣品中形成的所述免疫複合物水平相比較，並由所述比較結果確定所述疾病或病症是否由neublastin神經營養因子多肽活性異常所引起。
33．核酸，其含有SEQ ID NO:17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,31和32之任一個所示的序列。
34．生產SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一種多肽的方法，所述方法包括在允許生產多肽的條件下，培養含有SEQ ID NO:1,3,8,13,14,15,29和30所示的任一種核酸序列的細胞，並從培養基中回收多肽。
35．生產neublastin多肽的方法，所述方法包括(a)將編碼neublastin多肽表達的多核苷酸導入細胞或通過同源重組將調節序列導入細胞，以使調節序列能調節內源性neublastin基因的表達，從而產生neublastin生產細胞；(b)在導致neublastin多肽表達的培養條件下培養neublastin生產細胞。
36．neublastin多肽，其含有(a)保守的Cys殘基；(b)與SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一種序列至少70％同源的胺基酸序列，其中所述neublastin多肽表現出神經營養活性。
37．權利要求36的neublastin多肽，其中多肽具有SEQ ID NO:2的AA72-AA105所示的C末端胺基酸序列。
38．權利要求36的neublastin多肽，其中多肽具有SEQ ID NO:2的AA41-AA105所示的C末端胺基酸序列。
39．權利要求36,37或38之任一項的neublastin多肽，其中與SEQ IDNO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一種序列的所述同源性大於85％。
40．權利要求36,37或38之任一項的neublastin多肽，其中與SEQ IDNO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一種序列的所述同源性大於95％。
41．SEQ ID NO:2,4,5,6,7,9,10,11,12和16所示的任一種neublastin多肽，及其具有保守的胺基酸取代的變體。
42．權利要求41的neublastin多肽，其中保守的胺基酸取代佔多肽殘基總數的10％以下。
43．權利要求41的neublastin多肽，其中保守的胺基酸取代佔多肽殘基總數的2％以下。
44．權利要求41的neublastin多肽，其中保守的胺基酸取代是成熟序列中的單個胺基酸取代，其中經取代的和用於取代的胺基酸都是非環形的。
45．SEQ ID NO:17-28和31-32之任一個所示的分離的核酸序列。
46．分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO:1的核苷酸721-865,SEQ IDNO:3的核苷酸718-861,SEQ ID NO:8的核苷酸718-861和SEQ IDNO:15的核苷酸1647-2136。
47．分離的核酸序列，其由權利要求46之任一個序列中的10-25個鄰接的鹼基對組成，或由權利要求46中的任一個序列所產生的10-25個鄰接的鹼基對組成。
48．分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO:1的核苷酸1-10,SEQ ID NO:8的核苷酸1-57,SEQ ID NO:15的核苷酸1-974。
49．分離的核酸序列，其由權利要求48之任一個序列中的10-25個鄰接的鹼基對組成，或由權利要求48中的任一個序列所產生的10-25個鄰接的鹼基對組成。
50．鑑定，分離或擴增neublastin核酸序列的方法，所述方法包括使用權利要求45-49,43,44或45之任一項的核酸作為引物或探針。
51．通過權利要求50的方法分離的neublastin核酸。
52．分離的核酸序列，其含有SEQ ID NO:13或14所示的序列。
53．編碼neublastin多肽的合成基因，所述合成基因如SEQ ID NO:29或30所示。
54．針對neublastin肽或neublastin多肽的抗體，其中使用下列肽中的任一種產生所述抗體GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO:9的AA30-43)；LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的AA57-70)；CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO:9的AA74-85)；LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的AA94-107)；STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO:9的AA123-136)。CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO:9的AA43-70)；CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的AA74-107)；CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRISATAC(SEQ ID NO:9的AA108-136)。CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO:9的AA108-124)；和ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO:9的AA93-107)。
55．權利要求36的neublastin多肽，其中所述多肽含有7個保守的半胱氨酸殘基，它們位於SEQ ID NO:2中第8,35,39,72,73,101和103位，或SEQ ID NO:4和9中第43,70,74,107,108,136和138位。
56．試劑盒，該試劑盒在一個或多個容器中含有選自下列的物質neublastin多肽，針對neublastin多肽的抗體，能與neublastin RNA雜交的核酸探針，或能引發擴增至少一部分neublastin基因的核酸引物對。
57．診斷或篩選受試者體內是否存在特徵在於neublastin多肽水平異常的疾病或失調或產生所述疾病或失調的誘因的方法，所述方法包括測定所述neublastin多肽和編碼neublastin多肽的RNA的水平，或測定得自受試者的樣品中neublastin多肽的功能活性，其中neublastin多肽，neublastin RNA的水平或樣品中neublastin多肽的功能活性相對於未患疾病或失調或不具有患疾病或失調之誘因的類似樣品中發現的neublastin多肽，neublastin RNA的水平或neublastin的功能活性有所增加或降低，這表明存在疾病或失調或患有疾病或失調的誘因。
58．篩選純化的neublastin多肽，或其衍生物或其片斷，或者上述活性之調節劑的治療或預防疾病之活性的方法，所述方法包括測定和比較衍生自或顯示出疾病相關特徵的細胞系或受試動物的細胞的表型，基因型，行為，存活或增殖的變化，所述細胞或動物已接觸或施用了neublastin多肽，衍生物，片斷或調節劑，所述變化是相對於未接觸或施用過neublastin多肽，衍生物，片斷或調節劑的細胞或動物中的表型，基因型，行為，存活或增殖而言的。
59．治療哺乳動物中選自外周神經病的神經失調的方法，所述方法包括施用治療有效量的neublastin多肽，其中所述外周神經病選自外傷-誘導的神經病，化學治療-誘導的神經病，毒素-誘導的神經病，藥物-誘導的神經病，維生素-缺乏-誘導的神經病；自發性的神經病和糖尿病性神經病。
60．權利要求23的方法，其中neublastin直接傳遞至中樞神經系統。
61．權利要求23的方法，其中通過皮下注射，靜脈內給藥或靜脈內灌注給藥全身性傳遞neublastin。
62．在電腦程式中使用權利要求1-4或45-49之任一項的一種或多種核酸序列鑑定，分離或檢測新核酸序列的方法。
63．在固定底物或DNA晶片上使用權利要求1-4,33或45-49之任一項的一種或多種核酸序列鑑定，分離或檢測新核酸序列的方法。
64．在電腦程式中使用權利要求14-16,20,22或36-44之任一項的一種或多種多肽的序列鑑定，分離或檢測新核酸序列的方法。
65．鑑定候選化合物的方法，所述化合物能誘導neublastin-介導的生物學作用，所述方法包括步驟(a)提供受試細胞，所述細胞當與neublastin接觸時能被誘導表達可測產物；(b)將細胞暴露於候選化合物，並檢測可測產物，所述可測產物的表達是候選化合物能誘導neublastin-介導的生物學作用的標誌。
全文摘要
本發明涉及neublastin神經營養因子多肽,編碼neublastin多肽的核酸和特異性結合neublastin多肽的抗體,及其製備和使用方法。
文檔編號A61K48/00GK1311818SQ99808289
公開日2001年9月5日 申請日期1999年7月5日 優先權日1998年7月6日
發明者T·E·約翰森, N·布洛姆, C·漢森 申請人:恩斯吉恩有限公司