殼聚糖-dna納米顆粒複合物及其製備方法
2023-06-05 00:45:16
專利名稱：殼聚糖-dna納米顆粒複合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種殼聚糖-DNA納米顆粒複合物及其製備方法。
背景技術：
基因治療一直是人們關注的熱點之一，它可以通過填補缺失的基因、替換有缺陷的基因或沉默不需要的基因來治療遺傳性和非遺傳性疾病。但裸露的基因在體內很容易被核酸酶降解，轉染效率很低。因此，發展安全高效的基因載體成為基因治療成功的先決條件。近年來，主要的基因載體系統分為病毒和非病毒載體兩種。雖然病毒載體在體內有較高的轉染效率，但存在可能的毒性、易引起免疫反應及產生炎症的風險。非病毒載體包括脂質體和陽離子複合物，脂質體目前雖被廣泛應用於細胞轉染，但其包封率低、貯存穩定性差、容易被血液中的成分清除，使其在生物整體的應用受到限制。因此，人們將目光轉向了非病毒載體中富含陽離子且骨架包含氨基的聚合物。其中，殼聚糖作為一種聚陽離子基因載體正受到人們的廣泛關注。甲殼素在脫乙醯度達50%-100%之間時，成為殼聚糖(Chitosan，CS)，系統名 (1，4) -2-氨基-2-脫氧-β -D-葡聚糖，可溶於酸性水溶液形成自身帶正電荷的大分子。殼聚糖大分子能夠與DNA相互作用形成殼聚糖-DNA納米顆粒複合物(CNPs-DNA)，且此複合物對DNA有一定的保護作用，使其免受核酸酶的降解，並具有黏膜附著劑的性質。除此之外， 殼聚糖納米顆粒DNA複合物的粒徑大小適於細胞吞噬，且表面帶有適量正電荷可與帶負電的細胞膜產生靜電吸附作用，進而打開上皮細胞之間的緊密連接使大分子物質通過細胞間隙運輸，對細胞無毒副作用。因而可作為良好的基因載體用於基因轉染。影響殼聚糖納米粒體外基因轉染效率的因素很多，主要包括殼聚糖的分子量、脫乙醯度、殼聚糖氨基與DNA磷酸基比例(N/P)、DNA濃度、pH值、離子強度、溫度等。因此，研究殼聚糖的各種影響因素對轉染效率的影響，探尋最有效的CNPs-DNA，對提高目標基因的轉染效率有重要意義，為基因治療奠定了基礎。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種殼聚糖-DNA納米顆粒複合物(CNPs-DNA)。本發明的目的之二在於提供該複合物的製備方法。為達以上目的，本發明通過下述方案實現
一種殼聚糖-DNA納米顆粒複合物，其特徵在於該複合物為殼聚糖上的氨基質子化為一NH3+,與螢光蛋白質粒DNA上的磷酸基以靜電作用結合而形成，其中N:P的摩爾比為 4-8。上述的螢光蛋白質粒為綠色螢光蛋白質粒。上述的綠色螢光蛋白質粒為pEGFP_Cl。一種製備上述的殼聚糖-DNA納米顆粒複合物的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為a.將經純化的殼聚糖溶於10%醋酸中配製成濃度為2g/L的溶液，調節pH為5-6，得殼聚糖原液，經0. 22 μ m濾膜過濾除菌；
b.將步驟a所得殼聚糖原液稀釋成0.2-0. 8g/L，調pH為6_8，經0. 22 μ m濾膜過濾除菌備用；
c.將螢光蛋白質粒DNA用濃度為25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀釋為100—400 μ g/ ml的溶液；
d將步驟b和步驟c所得的殼聚糖稀釋液和質粒溶液置於55°C保溫30 min ； e.按M孔板每孔以IOul殼聚糖溶液與10ul、400ug/ml質粒溶液的比例混合30 s，室溫下靜置1小時。本發明的複合物能保護DNA免受核酸酶的降解，並與帶負電的細胞膜產生靜電吸附作用，促進細胞的內吞作用，實現目的基因的轉染。該複合物細胞毒性低，因而可作為良好的基因載體用於基因轉染。實現了目標基因的轉染，為基因治療的應用提供了有力的條件。
圖1為本發明的凝膠阻滯實驗，其中A，A』為裸質粒DNA;B，B』為CS ;C_I分別為 N/P=10、8、6、4、2、l、l/2 的 CNPs-DNA。圖2為本發明的DNaseI消化後，其中A，A』為裸質粒DNA ；B, B』為CS ；C-I分別為 N/P=10、8、6、4、2、l、l/2 的 CNPs-DNA。圖3為倒置螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白表達情況，其中A為裸質粒轉染組；B為 Lipofectamine 2000 轉染組；C、D、E 分別為 N/P=8、6、4 的 CNPs-DNA 轉染組)。圖4為本發明的流式細胞儀檢測轉染效率，其中A為裸質粒轉染組；B為 Lipofectamine 2000 轉染組；C、D、E 分別為 N/P=8、6、4 的 CNPs-DNA 轉染組。圖5為CNPs-DNA的細胞毒性實驗。
具體實施方案下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例一殼聚糖納米顆粒DNA複合物CNPs-DNA的製備
(1)稱20mg純化後的殼聚糖溶於10%的醋酸，可微微加熱(勿超42°C )，待殼聚糖顆粒完全溶解後，用IOM的NaOH溶液粗調pH為5. 5，得0. 2% (w/v)的殼聚糖原液，經0. 22 μ m 濾膜過濾除菌。(2)取適量的殼聚糖原液稀釋成濃度為0. 08% (w/v)的殼聚糖溶液，用IOM的NaOH 溶液調PH為6. 5-7. 0之間，經0. 22 μ m濾膜過濾除菌備用。(3)質粒DNA (pEGFP-Cl)用蒸餾水稀釋為400 μ g/ml的DNA溶液，加入1/10體積 500mM的Na2SO4溶液(使其終濃度為50mM)。(4)將殼聚糖溶液與質粒溶液分別置於55°C恆溫孵育器上保溫30 min。等體積混合後，迅速於渦旋器上混合30s，室溫下靜置lh，即得殼聚糖納米顆粒DNA複合物CNPs-DNA， 可用於後續轉染實驗。實施例二 對CNPs-DNA物理性質的測定
41.凝膠電泳阻滯和DNase I的消化實驗請具體說明凝膠電泳阻滯消化實驗的具體步
驟，
(1)凝膠電泳阻滯實驗=CNPs-DNA經1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳60V，40min，由於殼聚糖包裹DNA後掩蓋了 DNA本身的負電荷，使其無法在電泳中從負極向正極移動而被阻滯於上樣孔中。(2) DNase I 的消化實驗=CNPs-DNA 中加入 0. 5U DNase I (lU/ul)，37°C溫浴 lh, 經1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳60V，40min,被包裹的DNA滯留在上樣孔中，未被包裹的DNA被 DNase I消化降解。以此來判斷殼聚糖納米顆粒對DNA的保護能力。參見圖1和圖2，說明 CNPs-DNA能夠有效保護DNA免受DNase I的消化。的粒徑和kta電位測定使用ktasizerfOOOHS粒度及電位分析儀測定其平均粒徑和kta電位。參見表1
表1 不同N/P的CS-DNA粒徑及kta分布情況
權利要求
1.一種殼聚糖-DNA納米顆粒複合物，其特徵在於該複合物為殼聚糖上的氨基質子化為一NH3+,與螢光蛋白質粒DNA上的磷酸基以靜電作用結合而形成，其中N:P的摩爾比為 4-8。
2.根據權利要求1所述的殼聚糖-DNA納米顆粒複合物，其特徵在於所述的螢光蛋白質粒為綠色螢光蛋白質粒。
3.根據權利要求2所述的殼聚糖-DNA納米顆粒複合物，其特徵在於所述的綠色螢光蛋白質粒為pEGFP-Cl。
4.一種製備根據權利要求1所述的殼聚糖-DNA納米顆粒複合物的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為a.將經純化的殼聚糖溶於10%醋酸中配製成濃度為2g/L的溶液，調節pH為5-6，得殼聚糖原液，經0. 22 μ m濾膜過濾除菌；b.將步驟a所得殼聚糖原液稀釋成0.2-0. 8g/L，調pH為6_8，經0. 22 μ m濾膜過濾除菌備用；c.將螢光蛋白質粒DNA用濃度為25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀釋為100—400 μ g/ ml的溶液；d將步驟b和步驟c所得的殼聚糖稀釋液和質粒溶液置於55°C保溫30 min ；e.按M孔板每孔以IOul殼聚糖溶液與10ul、400ug/ml質粒溶液的比例混合30 s，室溫下靜置1小時。
全文摘要
本發明涉及一種殼聚糖-DNA納米顆粒複合物及其製備方法。該複合物為該複合物為殼聚糖上的氨基質子化為—NH3+，與銀光蛋白質粒DNA上的磷酸基以靜電作用結合而形成，其中N:P的摩爾比為4-8。本發明的複合物能保護DNA免受核酸酶的降解，並與帶負電的細胞膜產生靜電吸附作用，促進細胞的內吞作用，實現目的基因的轉染。該複合物細胞毒性低，因而可作為良好的基因載體用於基因轉染。實現了目標基因的轉染，為基因治療的應用提供了有力的條件。
文檔編號A61K47/36GK102205134SQ20111013065
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月20日 優先權日2011年5月20日
發明者劉芳, 文鐵橋, 霍一楠 申請人:上海大學