一種基於dna生物傳感器的2-羥基芴的測定方法

2023-06-04 23:48:06

一種基於dna生物傳感器的2-羥基芴的測定方法
【專利摘要】本發明屬於電分析化學和DNA生物傳感【技術領域】，涉及一種基於非生物蛋白酶——DNA酶生物傳感器對2-羥基芴的檢測。具體的以金電極為DNA酶載基，首先通過Au-S鍵作用將巰基修飾的DNA修飾到電極表面，並將該DNA修飾電極依次浸沒到含K+、hemin溶液中形成具有類過氧化物酶催化活性的G-DNA酶。在雙氧水介質中，通過電極表面G-DNA酶的催化作用引起膜電化學阻抗的增加，從而實現對2-羥基芴的檢測。該電化學DNA生物傳感器製備方法簡單，價格低廉，檢測周期短，響應時間快，穩定性好，選擇性高且具有高靈敏等優點。
【專利說明】—種基於DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於電分析化學和DNA生物傳感【技術領域】，涉及一種採用非生物蛋白酶DNA酶修飾的電化學生物傳感器對2-羥基芴的檢測方法，此方法能快速實現對2-羥基芴的檢測。

【背景技術】
[0002]多環芳經(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)因其具有典型的「致癌」、「致畸」和「致突變」作用而引起人們的極大關注。羥基多環芳烴作為多環芳烴的衍生物，同樣具有較強的生物毒性和環境危害性，而且一些羥基芳香烴類汙染物已被列入優先監測黑名單中。一些羥基多環芳烴應用在許多工業領域，如煤氣、焦化、煉油、冶金、機械製造、玻璃、石油化工、木材纖維、化學有機合成工業、塑料、醫藥、農藥、油漆等，如直接排放則可汙染大氣、水、土壤和食品，因此預防羥基多環芳烴的汙染工作任務艱巨，實現其在環境中的監測具有重要意義。到目前為止，用於羥基多環芳烴的分析檢測的傳統方法有很多種，如紅外光譜法、雙波長紫外分光光度法、直接螢光光度法、毛細管區帶電泳法、共振光散射法、催化光度法、示差脈衝伏安法、固相微萃取-氣相色譜法、高效液相色譜法、免疫檢測法等，這些傳統的檢測方法存在儀器設備昂貴、需專業技術人員操作、操作費時、樣本需要衍生處理和不能實現在線監測等缺陷，因此建立檢測羥基多環芳烴的新方法有著重要的現實意義。
[0003]隨著電化學技術和生物傳感技術的發展，DNA生物傳感器作為一種新型的檢測技術越來越多的應用於檢測環境汙染物，但是到目前為止，應用DNA生物傳感器對羥基多環芳烴的檢測還比較少，如Yang等採用酸變性單鏈DNA修飾的玻碳電極實現了 1_萘酚的檢測，這種基於鳥嘌呤氧化電流為信號的DNA生物傳感器對1-萘酚具有較高的靈敏性；Liu等課題組採用hairpin DNA修飾的生物傳感器對多種羥基多環芳烴進行了較為系統的研究，實現了對9-羥基芴的高靈敏檢測並實現了水體中9-羥基芴的分析。值得指出的是，採用DNA生物傳感器對羥基酚類物質的檢測原理主要是基於DNA分子與羥基多環芳烴分子間的非特異性相互作用，因此這種電化學DNA生物傳感器對酚類化合物不具有選擇性，因此開發具有高選擇性的DNA的生物傳感器實現對羥基多環芳烴的檢測具有十分重要的意義。
[0004]多環芳烴芴被列為優先控制的多環芳烴，研究發現，芴在體內酶活化的作用下可以發生代謝作用，其代謝的產物主要是2-羥基芴和9-羥基芴，也是一類具有較高生物活性和強毒性的致癌物質。此外，因二者是同分異構體在採用色譜法、光譜法進行分析時往往會互相產生幹擾，且需對分析信號進行複雜的化學計量處理。到目前為止，應用電化學DNA傳感器對2-羥基芴化合物的檢測還未見報導。因此，開發對2-羥基芴靈敏性高、選擇性強的DNA生物傳感器具有很大的挑戰性。
[0005]綜上所述，建立、完善和發展2-羥基芴化合物的DNA生物分析方法是分析化學和環境化學的難點研究課題，既可為環境健康風險評價及職業安全評估提供參考，同時開發一種新的高靈敏、低成本的檢測方法對完善現有檢測技術手段亦具有重要意義和較好的應用價值。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種基於DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法。
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]一種基於DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法，包括以下步驟:
[0009]I)電極的處理:
[0010]將金電極在鹿皮拋光布上用膏狀a-Al2O3拋光至鏡面，拋光後洗去表面汙物，並依次在乙醇和超純水中超聲清洗，重複三次；然後在H2SO4溶液中經循環伏安掃描至穩定，最後用超純水衝洗乾淨，氮氣吹乾，得到表面乾淨的金電極；
[0011]2) DNA溶液的配製:
[0012]將固體DNA序列用Tris-NaClO4緩衝溶液溶解並稀釋到一定濃度，用漩渦振蕩器混勻，靜置於室溫下備用；
[0013]3) DNA修飾電極的製備:
[0014]將上述步驟I)活化處理的金電極浸泡在上述步驟2)配製的DNA溶液中，靜置於室溫下。巰基修飾的DNA通過Au-S鍵作用自組裝於金電極表面，從而得到DNA修飾電極；
[0015]4)酶活性DNA修飾電極的製備:
[0016]將上述步驟3)製備的DNA修飾的金電極依次浸泡在Tris-NaClO4緩衝溶液配製的KC104、hemin溶液中各lh，從而得到具有類過氧化物酶催化活性的DNA修飾電極。
[0017]優選地，上述步驟2)中所述DNA濃度為2-20 μ Μ。
[0018]優選地，上述步驟4)中所述K+濃度為5_50mM。
[0019]優選地,上述步驟4)中所述hemin濃度為2-10 μ M。
[0020]本發明中，所使用的DNA序列是本領域人員所熟悉的，其獲得可以通過供應商獲得。
[0021]本發明的另一方面，涉及應用如上述製備方法得到的DNA修飾電極對2-羥基芴的檢測方法，其具體檢測方法為:以鉬絲電極為對電極，銀/氯化銀(飽和KCl溶液)為參比電極，以DNA修飾的金電極為工作電極構築三電極體系，先將DNA修飾電極在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN)6]溶液中進行電化學阻抗測量，測完後用Tris-NaClO4緩衝溶液淋洗，然後置於緩衝溶液配製的不同濃度的含過氧化氫的2-羥基芴溶液中，再進行電化學阻抗測定。
[0022]與現有技術相比本專利技術具有以下優點:
[0023]1.本發明所採用的DNA修飾電極，與傳統的酶修飾電極相比具有成本較低、易於貯存的優勢；
[0024]2.本發明所採用的DNA修飾電極是通過金-硫鍵作用將DNA自組裝於金電極表面，與傳統的酶修飾電極相比具有熱穩定性高的優勢；
[0025]3.本發明所採用的DNA修飾電極具有高催化活性、高專一性的優點；
[0026]4.本發明所製備的DNA修飾電極對2-羥基芴的檢測具有靈敏性高、選擇性強等特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為金電極及DNA修飾的金電極的阻抗譜圖；
[0028]圖2為使用本發明的DNA修飾電極分別與K+、hemin、lmM2_羥基芴作用前後的尼奎斯特阻抗譜圖=DNA膜(〇)，與K+作用(.)；與hemin作用(?);與2-羥基芴作用(■);其中，橫坐標代表電化學阻抗的實部(電阻)，單位為Ω 縱坐標代表電化學阻抗的虛部(電容)，單位為Ω.cm2 ;
[0029]圖3為DNA酶電極對2_羥基芴、9_羥基芴及緩衝體系中的的Λ Rct響應情況。

【具體實施方式】
[0030]以下實施實例對本發明做更詳細的描述，但所述實施不構成對本發明的限制。
[0031]實施例1
[0032]I)將金電極在鹿皮拋光布上用0.05 μ m的a -Al2O3粉末拋光至鏡面，拋光後先洗去表面汙物，並依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，每次2?3min，重複三次；然後在Imol/L H2SO4溶液中經循環伏安掃描至穩定，最後用去離子水衝洗乾淨，氮氣吹乾，即可得到表面乾淨的金電極；
[0033]2)將活化處理的金電極浸泡在預先配製的I μ M的DNA溶液中，靜置於室溫下3天，即得到DNA修飾電極；
[0034]3)將DNA修飾電極依次浸泡在Tris-NaClO4緩衝溶液配製的20mM的KC104、I μ M的hemin溶液中各lh，得到DNA酶修飾電極。
[0035]實施例2
[0036]將製備的DNA修飾電極依次浸泡在TriS-NaClO4緩衝溶液配製的20mM KClO4Uu Mhemin溶液中各Ih得到的具有酶催化活性的DNA修飾電極作為工作電極，以Ag/AgCl (飽和KCl溶液)電極為參比電極，鉬電極為對電極構築三電極體系，應用PARSTAT2273電化學綜合測試系統對 Tris-NaClO4 配製的濃度分別為 5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L及500nmol/L的2-輕基荷溶液中(含雙氧水濃度為5 μ M)分別進行電化學阻抗測定。
[0037]表IDNA修飾電極與2-羥基芴作用前後的電化學阻抗變化(Λ Rct)
[0038]
2-輕基荷濃度 5 nM 1nM 50 nM 10nM 150 nM 200 ηΜ 500 ηΜ ARct (Ω-ctn2) 83 98139213297 357 758
[0039]實施例3
[0040]以1mM的KC104、0.5 μ M的hemin溶液分別代替實施例2中的20mM的KC104、I μ M的hemin溶液，其它條件同實施例1，應用PARSTAT2273電化學綜合測試系統進行電化學阻抗測定。
[0041 ] 表2DNA修飾電極與2-羥基芴作用前後的電化學阻抗變化(Λ Rct)
[0042]
2-羥基芴濃度 5nM 1nM 50 nM 10nM 150 ηΜ 200 ηΜ 500 ηΜ ARct (Ω-cm2) 78 85119163207 269 675
[0043]實施例4
[0044]以9-羥基芴溶液代替實施例2中的2-羥基芴溶液，其它條件同實施例1，應用PARSTAT2273電化學綜合測試系統進行電化學阻抗測定。
[0045]表3DNA修飾電極與9-羥基芴作用前後的電化學阻抗變化(ARct)
[0046]

【權利要求】
1.一種基於DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)電極的處理: 將金電極在鹿皮拋光布上用膏狀ct -Al2O3拋光至鏡面,拋光後洗去表面汙物,並依次在乙醇和超純水中超聲清洗，重複三次；然後在H2SO4溶液中經循環伏安掃描至穩定，最後用超純水衝洗乾淨，氮氣吹乾，得到表面乾淨的金電極； 2)DNA溶液的配製: 將固體DNA序列用Tris-NaClO4緩衝溶液溶解並稀釋到一定濃度，用漩渦振蕩器混勻，靜置於室溫下備用； 3)DNA修飾電極的製備: 將上述步驟I)活化處理的金電極浸泡在上述步驟2)配製的DNA溶液中，靜置於室溫下。巰基修飾的DNA通過Au-S鍵作用自組裝於金電極表面，從而得到DNA修飾電極； 4)酶活性DNA修飾電極的製備: 將上述步驟3)製備的DNA修飾的金電極依次浸泡在Tris-NaClO4緩衝溶液配製的KClO4, hemin溶液中各lh，從而得到具有類過氧化物酶催化活性的DNA修飾電極。
2.根據權利要求1所述的一種基於DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法，其特徵在於:所述緩衝溶液中KClO4濃度為5?50mM，hemin濃度為2?10 μ M。
3.根據權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於:所使用的DNA為5'端含雙硫修飾的共24個鹼基的單鏈DNA序列，共包含兩部分:靠近DNA的5'端I?7的胸腺嘧啶鹼基為柔性間隔基團及可以形成DNA酶結構的10?26鹼基部分。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述DNA的濃度為2?20μ Μ。
5.一種應用如權利要求1-4中任一項所述製備方法得到的DNA修飾電極對2-羥基芴檢測的方法，其特徵在於具體步驟為:以鉬絲電極為對電極，銀/氯化銀(飽和KCl溶液)為參比電極，以DNA修飾金電極為工作電極構築三電極體系，先將DNA修飾電極在K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6]溶液中進行電化學阻抗測量，測完後用緩衝溶液淋洗，然後置於緩衝溶液配製的不同濃度梯度的含過氧化氫的2-羥基芴溶液中，然後再進行電化學阻抗測定，比較作用前後阻抗值的變化。
6.如權利要求5所述的DNA修飾的金電極在水中對2-羥基芴的檢測。
【文檔編號】G01N27/26GK104165914SQ201410323754
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月6日 優先權日:2014年9月6日
【發明者】劉新會, 梁剛, 於豔君, 劉冠男, 鞏文雯, 成登苗 申請人:北京師範大學