一種抗大腸桿菌的雞卵黃抗體及其製備方法與應用的製作方法

2023-06-04 23:46:31

專利名稱：一種抗大腸桿菌的雞卵黃抗體及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域中的一種免疫球蛋白及其製備方法與應用，特別是涉及一種抗大腸桿菌雞卵黃抗體及其製備方法與應用。
背景技術：
仔豬大腸桿菌性腹瀉是由豬致病性大腸桿菌引起的一種常見傳染病，常常導致仔豬死亡或發育緩慢，嚴重危害養豬業發展。由於大腸桿菌血清型複雜，免疫缺乏針對性，所以，以往大都使用抗生素和疫苗免疫母豬的方法防治此病。但因致病性大腸桿菌對抗生素容易產生耐藥性，主動免疫效果也不理想，因此防治仔豬大腸桿菌病就成為養豬生產中的突出問題之一。
雞卵黃抗體(IgY)是雞的一種免疫球蛋白(Ig)，其結構與IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空間構象。研究表明，IgY具有高度的穩定性，對熱、酸、鹼環境具有優良的耐受性。利用雞生產特異性免疫抗體，具有可規模化生產、成本低、特異性抗體含量高、安全性好等優點，較實驗室條件下通過實驗動物製備有限的高免血清更有實用性。目前國內已成功地研製和應用雞新城疫、傳染性腔上囊病、鴨病毒性肝炎等禽病毒性傳染病的卵黃抗體，但對細菌性畜禽傳染病的卵黃抗體研究較少。
發明創造內容本發明的目的是提供一種抗大腸桿菌的雞卵黃抗體及其製備方法。
本發明所提供的抗大腸桿菌雞卵黃抗體，可用下述方法得到(1)收集大腸桿菌菌毛抗原；(2)用大腸桿菌菌毛抗原免疫健康母雞，然後收集其所產卵，從卵黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體。
所述收集大腸桿菌菌毛抗原的具體步驟是收集菌體，提取抗原，將其溶於PBS緩衝溶液，加入佐劑，得到大腸桿菌菌毛抗原；所述佐劑優選為弗氏佐劑，一般首免用弗氏完全佐劑，二免用弗氏不完全佐劑；步驟(2)中從卵蛋黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體的方法可為用滅菌蒸餾水或滅菌生理鹽水，優選為用蒸餾水稀釋卵黃，調pH至5.0-7.1，優選為pH7.0，4℃靜置2-6小時，優選為靜置2小時，6000轉/分鐘水平離心30分鐘，除去大量脂類，收集上清，通過0.45μm膜過濾除菌，噴霧乾燥或冷凍乾燥得到抗大腸桿菌雞卵黃抗體粉。所述抗大腸桿菌雞卵黃抗體的分子量約為180KD。
本發明的抗大腸桿菌雞卵黃抗體的製備方法適用範圍廣泛，可用於製備各種大腸桿菌的抗體，所得到的抗體可用於製備預防和/或治療大腸桿菌感染引起的相關疾病的藥物、保健品、食品添加劑以及飼料添加劑，也可用於製備檢測大腸桿菌感染引起的相關疾病的製劑。
本發明所提供的抗大腸桿菌雞卵黃抗體由大腸桿菌抗原免疫產卵母雞而得，具有特異性，對防治動物大腸桿菌感染引起的消化道疾病具有良好效果。本發明的抗體採用母雞所產卵為載體，安全無毒，易於產業化。
具體實施例方式
實施例1、抗大腸桿菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的製備抗大腸桿菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的工藝流程為細菌培養→抗原提取→免疫產蛋雞→收集雞蛋→分離卵黃抗體→冷凍乾燥→原料成品，具體步驟如下1、菌毛抗原的製備大腸桿菌(Escherichia cold)K88、K99、987P菌株，在TSB液體培養基中培養至對數生長期，4℃條件下，3000r/min水平離心15分鐘，沉澱溶於PBS緩衝溶液中，然後在同樣條件下離心15分鐘，收集菌體，將其滅活後，在冰浴中高速(8000r/min)攪拌10min，再在4℃條件下，10000g水平離心15分鐘，收集含有菌毛抗原的上清液，用0.45μm濾器過濾上清液，將濾液調至pH為4.7-4.9後，在4℃條件下10000g水平離心15分鐘，收集沉澱溶於PBS緩衝溶液中，即為菌毛抗原溶液，濃度約為2.25mg/ml，於-20℃冷凍保存。部分抗原溶液按體積比1∶1加入已滅菌的完全弗氏佐劑(首免用)，部分抗原溶液按體積比1∶1加入已滅菌的不完全弗氏佐劑(二免用)，乳化得菌體抗原。以上所有操作均在無菌條件下進行。
2、抗大腸桿菌(Escherichia coli) K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的製備(1)對產卵母雞的免疫A.基礎免疫選用健康產卵非免疫產蛋雞隔離飼養。進行雞皮下多點注射步驟1中製備的完全弗氏佐劑菌體抗原1ml/只。
B.強化免疫基礎免疫兩周後，進行強化免疫，注射步驟1製備的不完全弗氏佐劑菌體抗原1ml/只。
於兩周後開始收集雞蛋，4℃儲存備用。
(2)抗大腸桿菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的提取從免疫雞卵中分離蛋黃，以蒸餾水稀釋8倍，調至pH至5.0-7.1，優選為pH7.0，4℃靜置2-6小時，優選為靜置2小時，6000轉/分鐘水平離心30分鐘，除去大量脂類，收集上清，通過0.45μm膜過濾除菌，噴霧乾燥或冷凍乾燥得到抗大腸桿菌雞卵黃抗體粉。
實施例2、抗大腸桿菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的檢測(1)分子量的測定及純度分析用SDS-PAGE電泳檢測實施例1中得到的抗大腸桿菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的純度，具體過程如下SDS-PAGE電泳，分離膠濃度8％，濃縮膠濃度5％，穩流電泳4小時，Marker採用低相對分子質量標準蛋白質電泳結束後，取下凝膠用考馬斯亮蘭染色，結果顯示只出現一條電泳帶，說明抗體純度高，其分子量約為180KD。
(2)濃度測定用Bradford蛋白濃度測定法測定實施例1中得到的抗大腸桿菌(Escherichiacoli)K88、K99、987P菌株雞卵黃抗體的濃度。
(3)活性檢測①ELISA間接試驗每孔加100μl實施例1中製備的抗原溶液包板，37℃溫浴2小時；倒掉包被液，用PBST溶液洗板5次，拍幹；每孔加100μl封閉液(1％牛血清白蛋白溶液)，37℃靜置1小時，用PBST溶液洗板5次，拍幹；每孔加100μl辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgY(工作稀釋度為1∶5000)，37℃靜置1小時，用PBST溶液洗板5次，拍幹；每孔加100μl含有過氧化氫的TMB，反應15分鐘後，每孔加入100μl的2MH2SO4終止反應，顯黃色，用DG3022型酶聯免疫檢測儀測吸光值OD450nm。
結果顯示，用酶聯免疫吸附試驗測得抗大腸桿菌雞卵黃抗體效價為1∶14000-16000。
②瓊脂擴散法A.瓊脂板的準備100ml生理鹽水加1.2克瓊脂粉，加熱融化，倒入玻璃平皿，製成2-3mm厚的瓊脂板，室溫凝固後，4℃倒置保存待用。
B.抗體的稀釋採用二倍稀釋法用生理鹽水連續稀釋卵黃抗體，其稀釋倍數分別為2×、4×、8×、16×、32×、64×及更高稀釋倍數。
C.瓊脂擴散反應用打孔器將瓊脂板打成七孔梅花型孔，酒精燈加熱封底。測樣時，在中央孔加入實施例1中得到的抗原溶液，外圍孔按一定順序分別加入不同稀釋倍數的抗體，每孔加入20μl樣品；倒置平皿於37℃密閉溼盒24至72小時，直至沉澱線產生，觀察抗體效價，以出現沉澱線的最大稀釋倍數為該卵黃抗體的效價。
結果顯示，本發明的抗大腸桿菌雞卵黃抗體用瓊脂擴散法測得抗體效價在1128以上。
實施例3、動物實驗仔豬攻毒和治療試驗取1日齡未吃初乳仔豬12頭，隨機分成兩組，採用人工哺乳法每隔兩小時飼餵一次牛奶，觀察仔豬適應環境後攻毒，攻毒劑量為1.0×109CFU/頭，待仔豬剛開始出現腹瀉症狀時，治療組飼餵精製卵黃抗體溶液4ml，每日兩次；對照組餵等量生理鹽水，觀察卵黃抗體治療效果，以糞便指數和死亡率為指標反映治療組和對照組差異顯著性。
試驗結果顯示，攻毒後12-24h所有仔豬均出現不同程度的腹瀉，治療組在口服卵黃抗體液24h後腹瀉症狀減輕，48h後糞便變為粘稠，72h後基本恢復正常；而對照組腹瀉呈水樣噴射，死亡主要出現在48-72h，之後症狀趨於緩和，死亡率為36％-65％。
權利要求
1.一種抗大腸桿菌雞卵黃抗體，可用下述方法得到(1)收集大腸桿菌菌毛抗原；(2)用大腸桿菌菌毛抗原免疫健康母雞，然後收集其所產卵，從卵黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體。
2.根據權利要求1所述的抗大腸桿菌雞卵黃抗體，其特徵在於所述收集大腸桿菌菌毛抗原的具體步驟是收集菌體，提取抗原，將其溶於PBS緩衝溶液，加入佐劑，得到大腸桿菌菌毛抗原；所述佐劑為弗氏佐劑。
3.根據權利要求1或2所述的抗大腸桿菌雞卵黃抗體，其特徵在於步驟(2)中所述從卵蛋黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體的提取方法為從免疫雞卵中分離蛋黃，以蒸餾水稀釋8倍，調至pH至5.0-7.1，優選為pH7.0，4℃靜置2-6小時，優選為靜置2小時，6000轉/分鐘水平離心30分鐘，除去大量脂類，收集上清，通過0.45μm膜過濾除菌，噴霧乾燥或冷凍乾燥得到抗大腸桿菌雞卵黃抗體粉。所述抗大腸桿菌雞卵黃抗體的分子量約為180KD。
4.一種製備抗大腸桿菌雞卵黃抗體的方法，包括以下步驟(1)收集大腸桿菌菌毛抗原；(2)用大腸桿菌菌毛抗原免疫健康母雞，然後收集其所產卵，從卵黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述收集大腸桿菌菌毛抗原的具體步驟是收集菌體，提取抗原，將其溶於PBS緩衝溶液，加入佐劑，得到大腸桿菌菌毛抗原；所述佐劑為弗氏佐劑。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於步驟(2)中所述從卵蛋黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體的提取方法為從免疫雞卵中分離蛋黃，以蒸餾水稀釋8倍，調至pH至5.0-7.1，優選為pH7.0，4℃靜置2-6小時，優選為靜置2小時，6000轉/分鐘水平離心30分鐘，除去大量脂類，收集上清，通過0.45μm膜過濾除菌，噴霧乾燥或冷凍乾燥得到抗大腸桿菌雞卵黃抗體粉。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述稀釋劑為滅菌蒸餾水。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述pH為7.0；所述溫度為4℃。
9.權利要求1所述抗大腸桿菌雞卵黃抗體在製備檢測大腸桿菌感染引起的相關疾病的製劑中的應用。
10.權利要求1所述抗大腸桿菌雞卵黃抗體在製備預防和/或治療大腸桿菌感染引起的相關疾病的藥物、保健品、食品添加劑以及飼料添加劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗大腸桿菌雞卵黃抗體及其製備方法與應用。本發明所提供的抗大腸桿菌雞卵黃抗體，可用下述方法得到(1)收集菌體，提取抗原，將其溶於PBS緩衝溶液，加入佐劑，得到大腸桿菌菌毛抗原；(2)用步驟(1)製備的大腸桿菌菌毛抗原免疫健康母雞，然後收集其所產卵，從卵黃中提取抗大腸桿菌雞卵黃抗體。本發明的抗大腸桿菌雞卵黃抗體的分子量約為180KD。本發明的抗大腸桿菌雞卵黃抗體可用於製備預防和/或治療大腸桿菌感染引起的相關疾病的藥物、保健品、食品添加劑以及飼料添加劑，也可用於製備檢測大腸桿菌感染引起的相關疾病的製劑。
文檔編號C07K16/12GK1634989SQ200310112980
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月29日 優先權日2003年12月29日
發明者劉國華, 金立志, 鄭愛娟 申請人:北京銳思嘉業飼料應用技術研究中心