用於治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及製備方法
2023-06-05 09:09:06 2
專利名稱：用於治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及製備方法。
血栓性疾病如腦血栓、心肌梗塞、血栓性靜脈炎以及冠心病是對人類危害極大的疾病，發病率及死亡率都很高，目前，臨床上主要採用溶栓藥物治療，西藥如尿激素、鏈激酶、組織型纖維酶原激活劑以及蝮蛇抗栓酶，這些藥物有的治療效果較差，復通率低，再栓率高；有的對富血小板血栓或富纖維蛋白血栓溶栓作用不很明顯，也有的易產生出血副作用，有的藥物原料來源困難，製備工藝複雜，價格昂貴；中藥如用有纖維活性的地龍粗提物製成的口服製劑，但該製劑起效慢。
本發明的目的正是為了克服上述已有技術的缺點與不足而提供一種以地龍粉為原料的經過提取將具有溶栓活性的組分製成靜脈注射針劑的用於治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑，從而可大大提高藥效，提高治癒率。
本發明還涉及該針劑的製備方法。
本發明的目的是通過下列技術方案實現∶用於治療急性血栓性疾病的地龍溶栓酶針劑，其特徵在於該針劑含有分子量為1.0-3.0萬或2.5-4.0萬或3.5-5.0萬，等電點為3.6-4.4的地龍溶栓酶，每針劑2ml注射水含量為2-5mg。
地龍溶栓酶針劑製備方法，其特徵在於它按下步驟進行a)將地龍粉用PH=4-10的0.02M緩衝液進行攪拌溶解，其重量濃度為5-20％，經離心分離取上清，用硫酸銨進行初級沉澱，其最終飽和度為20-30％，離心分離取上清，再用硫酸銨進行二級沉澱，其最終飽和度為40-70％，離心取沉澱，用水溶解沉澱，在PH=4-10的緩衝液中充分透析除去硫酸銨，得到粗級混合地龍溶栓酶溶液；
b)再將(a)項粗級混合，地龍溶栓酶溶液，用陰離子交換劑交換，進樣前，用PH=4-10的0.02M緩衝液平衡交換劑，進樣吸附後，用前述緩衝液淋洗後，再用含氯化鈉的前述緩衝液進行梯度洗脫，收集三種具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到用於提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬三種地龍溶栓酶粗級產品，依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ。
c)將b)項的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別進行超濾濃縮，濃縮比為5∶1-20∶1的體積；d)再將濃縮後的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別用疏水層析劑進行疏水層析，進樣前，用含硫酸銨的PH=4的0.02M緩衝液平衡層析劑，進樣後，用前述平衡緩衝液淋洗後，再用含硫酸銨的PH=4-10的緩衝液進行梯度洗脫，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產品；e)再將(d)項三種純化產品分別進行超濾、濃縮，濃縮比30∶1-50∶1，用分子篩過濾層析，進樣前，用PH=6-8的0.2M緩衝液平衡，層析劑，進樣後，用上述緩衝液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產品。
f)最後將(e)項中三種地龍溶栓酶液分別用親和層析劑進行親和層析，進樣前用PH=6-9的0.02M緩衝液平衡親和層析劑，進樣吸附後，用上述緩衝液淋洗後，改用PH=4-10的0.1M-1M的精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓活性的組份，分別透析，除菌過濾，最終製成分子量為1.5-3.0萬、3.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種液體。
也可將地龍溶栓酶液體，用凍幹方法製成乾粉，再按每針劑2.5mg裝瓶；緩衝液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸、醋酸-醋酸鈉緩衝劑；陰離子交換劑為DEAE Sepharose FastFlow、DEAE Sephacel、QSepharose Fast Flow；疏水層析劑為Phenyl-Sepharose 6 Fast Folw(low Sub),Phenyl-Sepharose 6Fast Folw(high Sub),Octyl-Sepharose Fast Flow；分子篩過濾層析劑為Sephadex G-75,Sephacryl S-200；親和層析劑為Benzamide-Sepharose；離子交換的線性梯度洗脫為梯度洗脫時間為0.5-10小時，氯化鈉濃度由0M線性遞增至0.5M；疏水層析的線性梯度洗脫為梯度洗脫時間為0.5-5小時，硫酸銨濃度由1.5M線性遞減至0M。
本發明所使用的離子交換劑、疏水層析劑、分子篩層析劑、親和層析劑均由瑞典Pharmacia公司生產。
本發明的藥物進行了毒理及藥效實驗觀察，其結果如下a)主要藥效實驗1)實驗性腦血栓模型的建立方法地鼠麻醉後，揭去頭蓋骨，暴露腦膜，股靜脈注射腺血卟啉後，雷射照射腦血管形成血栓後，股靜脈給藥，觀察溶栓起效時間和效果。血栓形成、血栓溶解過程可用錄像觀察。
2)用地鼠40隻，分實驗組(20隻)和對照組(20隻)，按上述方法建立腦血栓模型後，實驗組股靜脈滴注本發明中的地龍溶栓酶，劑量為2-10mg/kg體重，對照組股靜脈滴注尿激酶或重組鏈激酶，觀察溶栓效果。結果表明，實驗組給藥0.5小時後，血栓開始出現溶解，1-2小時，血流再通，有1隻(5％)出現出血現象。而對照組有4隻(20％)地鼠溶栓的同時伴有出血現象。顯示出按本發明方法製備的地龍溶栓酶在地鼠體內具有溶血栓的作用。
3)對大鼠體內凝血系統的影響，實驗結果表明，大鼠尾靜脈注射本發明的地龍溶栓酶後，對血小板聚集有抑制作用並能增強體內纖溶活性，表現為優球蛋白溶解時間(EIT)縮短，血清纖維蛋白的裂解物(FDPS)升高和血漿纖維蛋白原含量降低，提示按本發明方法製備的地龍溶栓酶在地鼠體內具有良好的抗栓作用。
b)毒理實驗急性毒性實驗，分實驗組和對照組，實驗組尾靜脈注射本發明的地龍溶栓酶，對照組尾靜脈注射生理鹽水，結果表明該地龍溶栓酶LD50為85mg/Kg體重。這說明該地龍溶栓酶具有較好的安全性。
c)質量檢測為確保該地龍溶栓酶的質量，建立了與療效密切相關的質控指標。
1)地龍溶栓酶體外溶栓活性測定
按照衛生部制定頒發的尿激酶瓊脂糖-纖維蛋白平板法。本發明製備的地龍溶栓酶比活為每毫克相當於1000-5000尿激酶單位。
2)地龍溶栓酶的純度及含量測定採用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，本發明方法製備的三個地龍溶栓酶在SDS-PAGE均主要表現為均一的條帶，採用薄層掃描進行定量，純度達90％以上。三個地龍溶栓酶的分子量分別為1-3萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬，等電點為3.6-4.4。
3)微生物與熱源的測定按照中華人民共和國藥典標準進行，經檢測無微生物及熱源。
本發明與已有技術相比具有如下優點及效果a)本發明的藥物製備方法採用中藥西制，得到三個有效地龍溶栓酶成分在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳上主要表現為均一的條帶，薄層掃描純度達90％以上，可直接靜脈注射，充分發揮地龍溶栓酶的溶栓效果；b)原料來源廣，製備方法簡單，成本低；c)溶栓效果好，毒副作用小，尤其對急性血栓疾病治療效果更為明顯。
實施例l取10g地龍粉與PH=4的0.02M醋酸-醋酸鈉緩衝液進行攪拌溶解，經離心分離取上清，用硫酸銨進行初級沉澱，其最終飽和度為20％，再用硫酸銨進行二級沉澱，其最終飽和度為40％，離心取沉澱，用水溶解沉澱，在PH=4的上述緩衝液中充分透析除硫酸銨，得到粗級混合地龍溶栓酶溶液，然後用瑞典進口的DEAE Sephrose Fast Tlow陰離子交換劑進行離子交換，在進樣前用PH=4的0.02M前述緩衝液平衡交換劑，進樣吸附後，用前述緩衝劑洗滌5個柱床體積後，再用含氯化鈉的前述緩衝液進行線性梯度洗脫，梯度洗脫時間0.5小時，氯化鈉濃度由0M線性遞增至0.5M收集三種具有活性的地龍溶栓酶峰液.得到用於提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種地龍溶栓酶粗級產品依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ，再將上述三種產品分別進行超濾濃縮，濃縮比為5∶1的體積後，再分別用Phenyl-Sepharase 6 FastFlow(low sub)疏水層析劑進行疏水層析，進樣前用含硫酸銨的PH=4的0.02M的緩衝液平衡層析劑，進樣後，用前述平衡緩衝液洗滌5個柱床體積後，用含硫酸銨的PH=4的0.02M前述緩衝液進行線性梯度洗脫，梯度洗脫時間0.5小時，硫酸銨濃度由1.5M線性遞減至0M，收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，分別得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產品，再將上述純化產品超濾濃縮，濃縮比為30∶1後，用分子篩過濾層析，分子篩過濾層析劑為Sephadex G-75，進樣前，用PH=6的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液平衡層析劑，進樣後，用上述緩衝液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產品，最後再將上述產品分別用親和層析劑Benzamide-sepharose進行親和層析，進樣前用PH=6的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液平衡親和層析劑，進樣吸附後，用上述緩衝液淋洗後，改用PH=4的0.1M精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓性的組份，分別透析，除菌，過濾，分裝，最後製成液體針劑，每2ml注射水含量為2mg。
實施例2取10g地龍粉與PH=6的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液進行攪拌溶解，經離心分離取上清，用硫酸銨進行初級沉澱，其最終飽和度為25％，再用硫酸銨進行二級沉澱，其最終飽和度為55％，離心取沉澱，用水溶解沉澱，在PH=6的0.02M上述緩衝液中充分透析除硫酸銨，得到粗級混合地龍溶栓酶溶液，然後用瑞典進口的DEAE Sephacel陰離子交換劑進行離子交換，在進樣前用PH=6的0.02M上述緩衝液平衡交換劑，進樣吸附後上述緩衝液洗滌5個柱床體積後再用含氯化鈉上述緩衝液進行線性梯度洗脫，梯度洗脫時間6小時，氯化鈉濃度由0M線性遞增0.5M收集三種具有活性的地龍溶栓酶峰液，得到用於提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種地龍溶栓酶粗級產品依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ，再將上述三種產品分別進行超濾濃縮，濃縮比為10∶1的體積後，再分別用Octyl-Sepharose Fast Flow疏水層析劑進行疏水層析，進樣前用含硫酸銨的PH=6的0.02M前述緩衝液平衡層析劑，進樣後用前述平衡緩衝液洗滌5個柱床體積後，用含硫酸銨的PH=6的0.02M前述緩衝液進行線性梯度洗脫，梯度洗脫時間2.0小時，硫酸銨濃度由0.8M線性遞減至0M，收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產品，再將上述純化產品超濾濃縮，濃縮比為40∶1後，用分子篩過濾層析，分子篩過濾層析劑為Sephacryl S-200，進樣前，用PH=7的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液平衡層析劑，進樣後，用上述緩衝液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產品，最後再將上述產品分別用親和層析劑Benzamide-sepharose進行親和層析，進樣前用PH=7的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氯鈉綬衝液平衡親和析劑，進樣吸附後，用上述緩衝液淋洗後，改用PH=6的0.5M精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓性的組份，分別透析，除菌，過濾，分裝，最後製成液體，用凍幹方法製成乾粉，按每針劑5mg裝瓶。
實施例3取10g地龍粉與PH=10的0.02M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液進行攪拌溶解，經離心分離取上清，用硫酸銨進行初級沉澱，其最終飽和度為30％，再用硫酸銨進行二級沉澱，其最終飽和度為70％，離心取沉澱，用水溶解沉澱，在PH=10的0.02M上述緩衝液中充分透析除硫酸銨，得到粗級混合地龍溶栓酶溶液，然後用瑞典進口的QSepharose Fast Flow陰離子交換劑進行離子交換，在進樣前用PH=10的0.02M上述緩衝液平衡交換劑進樣吸附後，用前述緩衝液洗滌5個柱床體積後，再用含氯化鈉的前述緩衝液進行線性梯度洗脫，梯度洗脫時間10小時，氯化鈉濃度由0M線性遞增0.5M收集三種具有活性的地龍溶栓酶峰液，得到用於提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種地龍溶栓酶粗級產品依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ，再將上述三種產品分別進行超濾濃縮，濃縮比為20∶1的體積後，再分別用Phenyl-Sepharose FastFlow(high sub)疏水層析劑進行疏水層析，進樣前用含硫酸銨的PH=10的0.02M前述緩衝液平衡層析劑進樣後，前述平衡緩衝液洗脫，用含硫酸銨的PH=10的0.02M前述緩衝液進行線性梯度洗脫，梯度洗脫時間5.0小時，硫酸銨濃度由0.5M線性遞減至0M，收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產品，再將上述純化產品超濾濃縮，濃縮比為50∶1後，用分子篩過濾層析，分子篩過濾層析劑為Sephacrye S-200，進樣前，用PH=9的0.02M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液平衡層析劑，進樣後，用上述緩衝液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產品，最後再將上述產品分別用親和層析劑Benzamide-sepharose進行親和層析，進樣前用PH=9的0.02M三羥甲氨基甲烷-鹽酸緩衝液平衡親和層析劑，進樣吸附後，用上述緩衝液淋洗後，改用PH=10的1.0M精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓性的組份，分別透析，除菌，過濾，分裝，最後製成液體針劑，每2ml注射水含量為5mg。
權利要求
1.用於治療急性血栓性疾病的地龍溶栓酶針劑，其特徵在於該針劑含有分子量為1.0-3.0萬或2.5-4.0萬或3.5-5.0萬，等電點為3.6-4.4的地龍溶栓酶，每針劑2ml注射水含量為2-5mg。
2.如權利要求1所述的地龍溶栓酶針劑製備方法，其特徵在於它按下步驟進行a)將地龍粉用PH=4-10的0.02M緩衝液進行攪拌溶解，其重量濃度為5-20％，經離心分離取上清，用硫酸銨進行初級沉澱，其最終飽和度為2 0-30％，離心分離取上清，再用硫酸銨進行二級沉澱，其最終飽和度為4 0-70％，離心取沉澱，用水溶解沉澱，在PH=4-10的緩衝液中充分透析除去硫酸銨，得到粗級混合地龍溶栓酶溶液；b)再將(a)項粗級混合，地龍溶栓酶溶液，用陰離子交換劑交換，進樣前，用PH=4-10的0.02M緩衝液平衡交換劑，進樣吸附後，用前述緩衝液淋洗後，再用含氯化鈉的前述緩衝液進行梯度洗脫，收集三種具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到用於提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬三種地龍溶栓酶粗級產品，依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ。c)將b)項的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別進行超濾濃縮，濃縮比為5∶1-20∶1的體積；d)再將濃縮後的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別用疏水層析劑進行疏水層析，進樣前，用含硫酸銨的PH=4的0.02M緩衝液平衡層析劑，進樣後，用前述平衡緩衝液淋洗後，再用含硫酸銨的PH=4-10的緩衝液進行梯度洗脫，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產品；e)再將(d)項三種純化產品分別進行超濾、濃縮，濃縮比30∶1-50∶1，用分子篩過濾層析，進樣前，用P1=6-8的0.2M緩衝液平衡，層析劑，進樣後，用上述緩衝液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產品。f)最後將(e)項中三種地龍溶栓酶液分別用親和層析劑進行親和層析，進樣前用PH=6-9的0.02M緩衝液平衡親和層析劑，進樣吸附後，用上述緩衝液淋洗後，改用PH=4-10的0.1M-1M的精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓活性的組份，分別透析，除菌過濾，最終製成分子量為1.5-3.0萬、3.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種液體。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於也可將地龍溶栓酶液體，用凍幹方法製成乾粉，再按每針劑2.5mg裝瓶。
4.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述的緩衝液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸、醋酸-醋酸鈉緩衝液。
5.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述的陰離子交換劑為DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE Sephacel、Q Sepharose Fast Flow。
6.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述的疏水層析劑為Phenyl-Sepharose 6 Fast Folw(low Sub),Phenyl-Sepharose 6 Fast Folw(high Sub),Octyl-Sepharose Fast Flow。
7.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述的分子篩過濾層析劑為Sephadex G-75，Sephacryl S-200。
8.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述的親和層析劑為Benzamide-Sepharose。
9.根據權利要求2或3所述的製備方法，其特徵在於所述的離子交換的線性梯度洗脫為梯度洗脫時間為0.5-10小時，氯化鈉濃度由OM線性遞增至0.5M。
10.根據權利要求2或3所述製備方法，其特徵在於所述的疏水層析的線性梯度洗脫為梯度洗脫時間為0.5-5小時，硫酸銨濃度由1.5M線性遞減至0M。
全文摘要
本發明涉及一種用於治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及製備方法,其特徵在於將地龍粉經溶解、沉澱、離子交換、疏水層析、分子篩層析和親和層析,得到三種具有活性的地龍溶栓酶,製成針劑或凍幹製品,該產品純度高,治療效果好,毒副作用小。
文檔編號A61K38/43GK1225821SQ98126139
公開日1999年8月18日 申請日期1998年12月25日 優先權日1998年12月25日
發明者蔣盤宏, 宋金華 申請人:北京化學試劑研究所