一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法

2023-06-05 04:12:16

專利名稱：：一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法。
背景技術：
：蛋白泛素化系統影響著真核生物生長發育的各個方面。該影響滲透了生物體的胚胎生成、細胞周期、基因的轉錄調節、生物鐘的形成與維持以及細胞的凋亡等過程。對植物而言，蛋白泛素化系統還影響著植物根的生長、花的形成、光合作用、激素調節以及植物的對逆境脅迫的適應。在蛋白的泛素化過程中主要有泛素活化酶(El)、泛素偶聯酶(E2)和泛素連接酶(E3)三個酶參與，在三個酶的共同作用下，底物蛋白被加上一個長的泛素鏈，帶有長的泛素鏈的蛋白最終被26S蛋白酶體所識別並降解，其中泛素連接酶在特異性識別底物過程中起主要作用。在植物中主要通過三個方面驗證泛素連接酶和底物之間的特異性相互作用(l)體外表達的泛素連接酶和相應的底物可以相互作用；(2)泛素連接酶可以在體外泛素化相應的底物；(3)在泛素連接酶基因缺失或者高表達的植株中，相應底物的表達量升高或降低。這些方法對於蛋白泛素化的研究不可或缺，但存在如下缺點(l)體外表達的蛋白由於沒有正常的蛋白翻譯後修飾，其生理生化活性必然會受到很大的影響，在實驗過程中不可避免的會產生不正確的結果；(2)體外的泛素連接酶對底物的反應很容易產生假陽性，並且有時由於缺少必要的翻譯後修飾導致泛素連接酶難以在體外把泛素蛋白加在其底物上；(3)植株突變體鑑定和轉基因植物的獲取需要較長的時間。在動物中，人們利用在培養的細胞中瞬時表達蛋白的方法來研究蛋白泛素連接酶與其相應底物的特異性反應。這種方法方便快捷，並且蛋白量大更利於後續試驗的實施。在植物中至今尚沒有相應的快速檢測蛋白泛素化的技術。
發明內容本發明的目的是提供一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法。本發明提供的檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法，包括如下步驟1)用DNA片段I和pl9基因瞬時轉染菸草葉片，得到菸草葉片甲；所述DNA片段I為帶有標記基因A的待測蛋白基因；將含有泛素連接酶基因的DNA片段II和pl9基因瞬時轉染菸草葉片，得到菸草葉片乙；2)進行如下a)或b)或c)的操作a)檢測菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白是否與菸草葉片乙中的泛素連接酶^口口；b)檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白降解；c)檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白與泛素蛋白連接。所述泛素連接酶的基因可如GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示；所述pl9基因可如GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示。所述DNA片段II可包括所述泛素連接酶基因和標記基因B;所述標記基因B與所述標記基因A不同。所述p19基因具體可通過重組質粒35S:pl9瞬時轉染所述菸草；所述DNA片段II具體可通過重組質粒35S:MYC-C0P1瞬時轉染所述菸草；所述重組質粒35S:pl9是在pCambia-1300221的多克隆位點間插入GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示的DNA得到的重組質粒；所述重組質粒35S:MYC-C0P1是在pBA002_MYC的多克隆位點間插入GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示的DNA得到的重組質粒。所述重組質粒35S:pl9具體可為在pCambia-1300221的BamHI和Sacl位點間插入GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示的DNA得到的重組質粒；所述重組質粒35S:MYC-C0P1具體可為在pBA002-MYC的Smal和Spel位點間插入GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示的DNA得到的重組質粒。所述步驟2)中，可通過如下方法檢測菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白是否與菸草葉片乙中的泛素連接酶結合(I)用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片甲的總蛋白，得到提取液甲；用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片乙的總蛋白，得到提取液乙；然後進行(II)或(III);(II)將提取液甲和提取液乙混合，加入針對標記基因A編碼蛋白的一抗，然後加入IgGbeads,收集免疫沉澱複合物；將免疫沉澱複合物進行SDS-PAGE，轉膜後用針對標記基因B編碼蛋白的一抗進行免疫雜交，如果出現待測蛋白的信號，待測蛋白即為所述泛素連接酶的底物；(III)將提取液甲和提取液乙混合，加入針對標記基因B編碼蛋白的一抗，然後加入IgGbeads,收集免疫沉澱複合物；將免疫沉澱複合物進行SDS-PAGE，轉膜後用針對標記基因A編碼蛋白的一抗進行免疫雜交，如果出現待測蛋白的信號，待測蛋白即為所述泛素連接酶的底物。所述步驟2)中，可通過如下方法檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白降解(I)用添加了ATP的非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片甲的總蛋白，得到提取液甲；用添加了ATP的非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片乙的總蛋白，得到提取液乙；用添加了ATP的非變性蛋白提取緩衝液提取未轉染菸草葉片的總蛋白，得到提取液丙；將提取液甲和提取液乙混合得到提取液甲乙，將提取液甲和提取液丙混合得到提取液甲丙(II)將提取液甲乙和提取液甲丙分別同時間隔時間取樣，進行SDS-PAGE;(III)轉膜後用針對標記基因A編碼蛋白的一抗進行免疫雜交，如果隨時間提取液甲乙和提取液甲丙中待測蛋白的信號均降低，且提取液甲乙的降低幅度大於提取液甲丙的降低幅度，待測蛋白即為所述泛素連接酶的底物。所述步驟2)中，可通過如下方法檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白與泛素蛋白連接(I)用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片甲的總蛋白，得到提取液甲；用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片乙的總蛋白，得到提取液乙；(II)將提取液甲和提取液乙混合，加入針對標記基因B編碼蛋白的一抗，然後加入IgGbeads,收集免疫沉澱複合物；(III)將免疫沉澱複合物分成三組第一組加入泛素偶聯酶和帶有HIS標籤的泛素蛋白；第二組加入泛素活化酶和帶有HIS標籤的泛素蛋白；第三組加入泛素活化酶、泛素偶聯酶和帶有HIS標籤的泛素蛋白；(IV)三組分別進行SDS-PAGE，轉膜後分別用針對標記基因A編碼蛋白的一抗和Nichel-HRP進行免疫雜交，如果第三組有如下蛋白的信號，而第一組和第二組沒有如下蛋白的信號，待測蛋白即為泛素連接酶的底物分子量大於待測蛋白且具有針對標記基因A編碼蛋白的一抗的信號且具有Nichel-HRP信號。所述非變性蛋白提取緩衝液的具體組成如下所述非變性蛋白提取緩衝液的組成如下50mMTris-MESpH8.O，O.5M蔗糖，lmMMgCl2，10mMEDTA，5mMDTT，有效劑量的蛋白酶抑制劑；其餘為水。所述待測蛋白可為HY5蛋白；所述標記基因A可為GFP基因；所述標記基因B可為MYC基因。所述MYC基因具體可為pBA002-MYC中的MYC基因。所述GFP基因的核苷酸序列具體可為GenBankAccessionNumber:FJ172221.1自5'端第4419至5135位核苷酸。所述HY5基因的核苷酸序列具體可為GenBankAccessionNumber:NM_121164.4自5'端第193至699位核苷酸。本發明還提供了另一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法，包括如下步驟1)將DNA片段A和pl9基因瞬時轉染菸草葉片；所述DNA片段A為帶有標記基因的待測蛋白基因；所述泛素連接酶的基因如GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示；所述pl9基因如GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示；2)通過檢測步驟1)轉染後的菸草葉片中的帶有標記的待測蛋白是否進行了泛素化，判斷待測蛋白是否為泛素連接酶的底物。菸草是一種常用的實驗室模式植物，利用菸草做蛋白瞬時表達有如下優點首先，任何一個植物實驗室都可以很好的種植菸草，不需要額外的試驗條件及技術；其次，在菸草注射的同時注射基因沉默的抑制子pl9可以很大程度地提高蛋白的表達量；再次，菸草瞬時表達是通過葉片注射完成的，這一過程簡單易行不需要特殊的儀器及專業的實驗技術；最後，整個蛋白表達過程耗時短，從開始準備到蛋白獲得僅需一周左右。本發明中，用p19基因作為輔助基因，在菸草中表達待測蛋白和泛素連接酶蛋白，可以快速大量的得到翻譯修飾後的待測蛋白和泛素連接酶，結果更為準確。圖1為待效圖2為待效圖3為待效圖4為待效l蛋白與泛素連接酶的特異性結合檢測結果(GFP抗體)。l蛋白與泛素連接酶的特異性結合檢測結果(MYC抗體)。l蛋白在菸草體內泛素化的檢測結果(MYC抗體)。l蛋白在菸草體內泛素化的檢測結果(泛素蛋白抗體)。圖5為待測蛋白降解實驗的結果。圖6為待測蛋白降解實驗的結果(添加抑制劑MG132)。圖7為待測蛋白體外泛素化的檢測結果(GFP抗體)。圖8為待測蛋白體外泛素的檢測結果(Nichel-HRP)。具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中所用到的實驗材料如下GFP抗體購自Roche公司(目錄號N01814460);MYC抗體購自santacruz公司(目錄號sc-40);FLAG抗體購自sigma公司(目錄號F3165);ubiquitin抗體購自sigma公司(目錄號U0508);二抗購自proteintech(目錄號00001-1);IgGbeads購自Millipore公司(目錄號16-266);MG132購自sigma公司(目錄號c2211);NichelHRP購自KTL公司(目錄號24-01-01);ATP購自sigma公司(目錄號A9187);NC膜購自Amersham公司(目錄號RPN303C)。以下實施例中所用的非變性蛋白提取緩衝液的配方如下所述非變性蛋白提取緩衝液的配方如下50mMTris-MESpH8.0，0.5Msucrose,lmMMgCl2，10mMEDTA，5mMDTT，proteaseinhibitorcocktailtablets(蛋白酶抑制劑混合物)。本專利所用菸草為本生煙；中國科學院遺傳與發育生物學研究所；參考文獻MichaelM.Goodinl，RalfG.Dietzgen，DeniseSchichnes，StevenRuzinandAndrew0.Jackson.pGDvectors-versatiletoolsfortheexpressionofgreenandredfluorescentproteinfusionsinagroinfi1tratedplantleaves.〈〈thePlantJournal》，2002年31巻3期，375-383。pBA002-MYC載體中國科學院遺傳與發育生物學研究所；參考文獻YiyueZhang，ChengweiYang，YinLi，NuoyanZheng，HaoChen，QingzhenZhao，TingGao，HuishanGuoandQiXie.SDIR1IsaRINGFingerE3LigaseThatPositivelyRegulatesStress-ResponsiveAbscisicAcidSignalinginArabidopsis.《ThePlantCell〉〉，2007年19巻6期，1912-1929。pCambia-1300221載體中國科學院遺傳與發育生物學研究所；參考文獻ChengguoDuan，ChunhanWang，RongxiangFangandHuishanGuo.ArtificialMicroRNAsHighlyAccessibletoTargetsConferEfficientVirusResistanceinPlants.《JOURNALOFVIR0L0GY》，2008年82巻22期，11084-11095。農桿菌EHA105:中國科學院遺傳與發育生物學研究所；參考文獻JianbinLai，HaoChen，KunlingTeng，QingzhenZhao，ZhonghuiZhang，YinLi，LimingLiang，RanXia，YaorongWu，HuishanGuoandQiXie.RKP，aRINGfingerE3ligaseinducedbyBSCTVC4protein,affectsgeminivirusinfectionbyregulationoftheplantcellcycle。《thePlantJournal》，2009年57巻5期，905-917。實施例1、重組表達載體的構建—、重組質粒35S:MYC-C0P1的製備1、設計擴增C0P1基因的CDS全序列(GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸)的引物並在其兩端分別加上Smal和Spel酶切位點。2、採用步驟1的引物通過PCR的方法克隆得到C0P1基因的CDS全序列，用限制性內切酶Smal和Spel進行酶切。3、用限制性內切酶Smal和Spel酶切pBA002_MYC載體，得到載體骨架。4、將步驟2的酶切產物與步驟3的載體骨架進行連接，得到重組質粒35S:MYC-C0P1(骨架載體為pBA002_MYC，Smal和Spel位點間插入了GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示的DNA)。二、重組質粒35S:HY5-GFP的製備1、用限制性內切酶Xbal和Sacl酶切pBA002_MYC載體，得到MYC序列。2、用限制性內切酶Xbal和Sacl酶切pCambia-1300221載體，得到載體骨架。3、將步驟1的MYC序列與步驟2的載體骨架連接，得到重組質粒pCambia-1300221-MYC。4、設計擴增GFP基因的CDS全序歹lj(GenBankAccessionNumber:FJ172221.1自5'端第4419至5135位核苷酸序列所示的DNA)的引物並在其兩端分別加上Ascl和Kpnl酶切位點。5、採用步驟4的引物通過PCR的方法克隆得到GFP基因的CDS全序列，用限制性內切酶Ascl和Kpnl進行酶切。6、用限制性內切酶AscI和KpnI酶切pCambia-1300221-MYC載體，得到載體骨架。7、將步驟5的酶切產物與步驟6的載體骨架連接，得到重組質粒pCambia-1300221-GFP。8、設計擴增HY5基因的CDS全序列(GenBankAccessionNumber:NM_121164.4自5'端第193至699位核苷酸序列所示的DNA)的引物並在其兩端分別加上Xbal和Xhol酶切位點。9、採用步驟8的引物通過PCR的方法克隆得到HY5基因的CDS全序列，用限制性內切酶Xbal和Xhol進行酶切。10、用限制性內切酶Xbal和XhoI酶切pCambia-1300221-GFP載體，得到載體骨架。11、將步驟9的酶切產物與步驟10的載體骨架連接，得到重組質粒35S:HY5-GFP(骨架載體為pCambia-1300221，Ascl和Kpnl位點間插入了GenBankAccessionNumber:FJ172221.1自5，端第4419至5135位核苷酸序列所示的DNA，Xbal和Xhol位點間插入了GenBankAccessionNumber:NM_121164.4自5，端第193至699位核苷酸序列所示的DNA)。三、35S:MYC-HY51、設計擴增HY5基因的CDS全序列(GenBankAccessionNumber:NM_121164.4自5'端第193至699位核苷酸序列所示的DNA)的引物並在其兩端分別加上BamHI和Spel酶切位點。2、採用步驟1的引物通過PCR的方法克隆得到HY5基因的CDS全序列，用限制性內切酶BamHI和Spel進行酶切。3、用限制性內切酶BamHI和Spel酶切pBA002_MYC載體，得到載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒35S:MYC-HY5(骨架載體為pBA002-MYC，BamHI和Spel位點間插入了GenBankAccessionNumber:NM_121164.4自5'端第193至699位核苷酸序列所示的DNA)。四、重組質粒35S:pl9的製備1、設計擴增pl9基因的CDS全序列(GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示的DNA)的引物並在其兩端分別加上BamHI和Sacl酶切位點。2、採用步驟1的引物通過PCR的方法克隆得到p19基因的CDS全序列，用限制性內切酶BamHI和Sacl進行酶切。3、用限制性內切酶BamHI和Sacl酶切pCambia-1300221載體，得到載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒35S:pl9(骨架載體為pCambia-1300221，BamHI禾口Sacl位點間插入了GenBankAccessionN咖ber:NC_001554.1所示的DNA)。五、重組質粒35S:MYC-GFP的製備1、設計擴增GFP基因的CDS全序歹lj(GenBankAccessionNumber:FJ172221.1自5'端第4419至5135位核苷酸序列所示的DNA)的引物並在其兩端分別加上Smal和Spel酶切位點。2、採用步驟1的引物通過PCR的方法克隆得到GFP基因的CDS全序列，用限制性內切酶Smal和Spel進行酶切。3、用限制性內切酶Smal和Spel酶切pBA002_MYC載體，得到載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒35S:MYC-GFP(骨架載體為pBA002-MYC，Smal和Spel位點間插入了GenBankAccessionNumber:FJ172221.1自5'端第4419至5135位核苷酸序列所示的DNA)。六、蛋白的製備泛素活化酶(El)，泛素偶聯酶(E2)以及帶有HIS標籤的泛素蛋白的製備參見文獻JianbinLai，HaoChen，K皿lingTeng，QingzhenZhao，ZhonghuiZhang，YinLi，LimingLiang，RanXia，YaorongWu，HuishanGuoandQiXie.RKP，aRINGfingerE3ligaseinducedbyBSCTVC4protein,affectsgeminivirusinfectionbyregulationoftheplantcellcycle。《thePlantJo證al》，2009年57巻5期，905-917。實施例2、重組農桿菌的製備—、製備35S:pl9重組農桿菌將實施例l製備的重組質粒35S:pl9，通過電擊轉化的方法導入農桿菌EHA105中，將轉化的農桿菌塗於含50g/ml卡那黴素和50g/ml利福平的固體培養基上，生長兩天得到單克隆菌落用於後續試驗。二、製備35S:HY5-GFP重組農桿菌將實施例1製備的重組質粒35S:HY5-GFP，通過電擊轉化的方法導入農桿菌EHA105中，將轉化的農桿菌塗於含50iig/ml卡那黴素和50yg/ml利福平的固體培養基上，生長兩天得到單克隆菌落用於後續試驗。三、製備35S:MYC-HY5重組農桿菌將實施例1製備的重組質粒35S:MYC-HY5，通過電擊轉化的方法導入農桿菌EHA105中，將轉化的農桿菌塗於含50iig/ml壯觀黴素和50yg/ml利福平的固體培養基上，生長兩天得到單克隆菌落用於後續試驗。四、製備35S:MYC-C0P1重組農桿菌將實施例1製備的重組質粒35S:MYC-C0P1，通過電擊轉化的方法導入農桿菌EHA105中，將轉化的農桿菌塗於含50iig/ml壯觀黴素和50yg/ml利福平的固體培養基上，生長兩天得到單克隆菌落用於後續試驗。五、製備35S:MYC-GFP重組農桿菌將實施例1製備的重組質粒35S:MYC-GFP，通過電擊轉化的方法導入農桿菌EHA105中，將轉化的農桿菌塗於含50iig/ml壯觀黴素和50yg/ml利福平的固體培養基上，生長兩天得到單克隆菌落用於後續試驗。實施例3、檢測待測蛋白是否與泛素連接酶特異性結合—、製備35S:pl9重組農桿菌的重懸液挑取35S:pl9重組農桿菌單克隆菌落轉入3mlLB培養液中(含50yg/ml卡那黴素和50iig/ml利福平)，28t:搖菌過夜。培養得到的菌液以1:100的比例轉接於10mlLB(含50iig/ml卡那黴素、50yg/ml利福平、10yM2_(N_嗎啉代)乙磺酸和40yM乙醯丁香酮)，28t:搖菌過夜。菌液OD值為3.0時，收集菌液入離心管，4000rpm、10min，收集菌體。用新鮮配製的如下溶液重懸菌體溶質為10mMMgCl2和200yM乙醯丁香酮；溶劑為水。重懸菌體的OD值為1。二、製備35S:HY5-GFP重組農桿菌的重懸液挑取35S:HY5-GFP重組農桿菌單克隆菌落轉入3mlLB培養液中(含50yg/ml卡那黴素和50iig/ml利福平)，28t:搖菌過夜。培養得到的菌液以1:100的比例轉接於10mlLB(含50iig/ml壯觀黴素、50iig/ml利福平、10iiM2-(N-嗎啉代)乙磺酸和40iiM乙醯丁香酮)，28t:搖菌過夜。菌液OD值為3.0時，收集菌液入離心管，4000rpm、10min，收集菌體。用新鮮配製的如下溶液重懸菌體溶質為10mMMgCl2和200yM乙醯丁香酮；溶劑為水。重懸菌體的OD值為1.5。三、製備35S:MYC-C0P1重組農桿菌的重懸液挑取35S:MYC-C0P1重組農桿菌單克隆菌落轉入3mlLB培養液中(含50yg/ml壯觀黴素和50iig/ml利福平)，28t:搖菌過夜。培養得到的菌液以1:100的比例轉接於10mlLB(含50iig/ml壯觀黴素、50iig/ml利福平、10iiM2-(N-嗎啉代)乙磺酸和40iiM乙醯丁香酮)，28t:搖菌過夜。菌液OD值為3.0時，收集菌液入離心管，4000rpm、10min，收集菌體。用新鮮配製的如下溶液重懸菌體溶質為10mMMgCl2和200yM乙醯丁香酮；溶劑為水。重懸菌體的OD值為1.5。四、檢測待測蛋白是否與泛素連接酶特異性結合1、製備HY5-GFP樣品將步驟一製備的得到的35S:pl9重組農桿菌的重懸液與步驟二製備得到的35S:HY5-GFP重組農桿菌的重懸液1:1(體積比)混合，靜止2_5小時；然後用1毫升的無針頭注射器注射生長到7-8片葉子的菸草。注射一天後剪取注射過的區域。用液氮磨碎10葉片，葉片粉末(HY5-GFP樣品)放於-8(TC備用。2、製備MYC-C0P1樣品將步驟一製備的得到的35S:pl9重組農桿菌的重懸液與步驟三製備得到的35S:MYC-C0P1重組農桿菌的重懸液1:1(體積比)混合，靜止2-5小時；然後用1毫升的無針頭注射器注射生長到7-8片葉子的菸草。注射五天後剪取注射過的區域。用液氮磨碎葉片，葉片粉末(MYC-C0P1樣品)放於-S(TC備用。3、檢測待測蛋白是否與泛素連接酶特異性結合(l)GFP抗體雜交檢測①用非變性蛋白提取緩衝液分別提取HY5-GFP樣品和MYC-C0P1樣品；將HY5-GFP樣品的提取液作為提取液I，將MYC-C0P1樣品的提取液作為提取液II，將等體積混合的提取液i和提取液n作為提取液m。②取三種提取液(提取液I、提取液II和提取液III)各lml，分別加入10iig的MYC抗體，4t:輕輕搖蕩混合過夜。③第二天上午在五種提取液中分別加入20ii1的IgGbeads,繼續4t:搖蕩三個小時，然後14000g離心5秒，收集免疫沉澱複合物。④三種免疫沉澱複合物分別用預冷到4t:的PBS洗三次後加入60ia2X蛋白上樣緩衝液，進行10%的SDS-PAGE膠分離，用電轉的方式把膠上的蛋白轉移到NC膜上，然後用GFP的抗體進行免疫雜交。結果見圖l。(2)MYC抗體雜交檢測①同步驟(1)的①。②取三種提取液(提取液I、提取液n和提取液m)各lml，分別加入10iig的GFP抗體，4t:輕輕搖蕩混合過夜。③同步驟(1)的③。④三種免疫沉澱複合物分別用預冷到4t:的PBS洗三次後加入60ia2X蛋白上樣緩衝液，進行10%的SDS-PAGE膠分離，用電轉的方式把膠上的蛋白轉移到NC膜上，然後用MYC的抗體進行免疫雜交。結果見圖2。圖1和圖2的結果表明HY5和C0P1可以相互作用，把彼此免疫共沉澱。實施例4、檢測待測蛋白是否可以被泛素化—、製備35S:pl9重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟一。二、製備35S:MYC-HY5重組農桿菌的重懸液挑取35S:MYC-HY5重組農桿菌單克隆菌落轉入3mlLB培養液中(含50yg/ml壯觀黴素和50iig/ml利福平)，28t:搖菌過夜。培養得到的菌液以1:100的比例轉接於10mlLB(含50iig/ml壯觀黴素、50iig/ml利福平、10iiM2-(N-嗎啉代)乙磺酸和40iiM乙醯丁香酮)，28t:搖菌過夜。菌液0D值為3.0時，收集菌液入離心管，4000rpm、10min，收集菌體。用新鮮配製的如下溶液重懸菌體溶質為10mMMgCl2和200yM乙醯丁香酮；溶劑為水。重懸菌體的OD值為1.5。11三、製備35S:MYC-GFP重組農桿菌的重懸液挑取35S:MYC-GFP重組農桿菌單克隆菌落轉入3mlLB培養液中(含50yg/ml壯觀黴素和50g/ml利福平)，28t:搖菌過夜。培養得到的菌液以1:100的比例轉接於10mlLB(含50iig/ml壯觀黴素、50iig/ml利福平、10iiM2-(N-嗎啉代)乙磺酸和40iiM乙醯丁香酮)，28t:搖菌過夜。菌液OD值為3.0時，收集菌液入離心管，4000rpm、10min，收集菌體。用新鮮配製的如下溶液重懸菌體溶質為10mMMgCl2和200yM乙醯丁香酮；溶劑為水。重懸菌體的0D值為0.3。四、檢測待測蛋白是否可以被泛素化[O130]1、製備MYC-HY5樣品將步驟一製備的得到的35S:pl9重組農桿菌的重懸液與步驟二製備得到的35S:MYC-HY5重組農桿菌的重懸液1:1(體積比)混合，靜止2_5小時；然後用1毫升的無針頭注射器注射生長到7-8片葉子的菸草。注射一天後剪取注射過的區域。用液氮磨碎葉片，葉片粉末(MYC-HY5)放於-S(TC備用。[O132]2、製備MYC-GFP樣品將步驟一製備的得到的35S:pl9重組農桿菌的重懸液與步驟三製備得到的35S:MYC-GFP重組農桿菌的重懸液1:1(體積比)混合，靜止2_5小時；然後用1毫升的無針頭注射器注射生長到7-8片葉子的菸草。注射一天後剪取注射過的區域。用液氮磨碎葉片，葉片粉末(MYC-GFP)放於-8(TC備用。3、檢測待測蛋白是否可以被泛素化(l)MYC抗體雜交檢測①用非變性蛋白提取緩衝液分別提取兩個樣品；將MYC-HY5樣品的提取液作為提取液I，將MYC-GFP樣品的提取液作為提取液II。②取兩種提取液各lml，分別加入10g的MYC抗體，4。C輕輕搖蕩混合過夜。③三個小時後在兩種提取液中分別加入20ill的IgGbeads,繼續4。C搖蕩三個小時，然後14000g離心5秒，收集免疫沉澱複合物。④兩種免疫沉澱複合物分別用預冷到4t:的PBS洗三次後加入60ia2X蛋白上樣緩衝液，然後用MYC的抗體進行免疫雜交。結果見圖3。圖3中，MYC-HY5樣品中有，而MYC-GFP樣品中沒有的，分子量大於MYC-HY5融合蛋白的蛋白條帶，即為候選的被泛素化的MYC-HY5融合蛋白。(2)泛素蛋白抗體雜交檢測①同步驟(1)的①。②同步驟(1)的②。③同步驟(1)的③。④兩種免疫沉澱複合物分別用預冷到fC的PBS洗三次後加入60iU2X蛋白上樣緩衝液，進行10%的SDS-PAGE膠分離，用電轉的方式把膠上的蛋白轉移到NC膜上，然後用泛素蛋白的抗體(sigma公司，目錄號U0508)進行免疫雜交。結果見圖4。圖4中，MYC-HY5樣品中有，而MYC-GFP樣品中沒有的，分子量大於MYC-HY5融合蛋白的蛋白條帶，即為候選的被泛素化的MYC-HY5融合蛋白。在圖3和圖4中同時為候選的被泛素化的MYC-HY5融合蛋白，即為被泛素化的MYC-HY5融合蛋白。在圖3和圖4中MYC-HY5樣品中都監測到分子量大於MYC-HY5融合蛋白的蛋白條帶，說明HY5蛋白確實在菸草體內被泛素化了。實施例5、檢測泛素連接酶是否可以促進待測蛋白降解—、製備35S:pl9重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟一。二、製備35S:HY5-GFP重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟二。三、製備35S:MYC-C0P1重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟三四、檢測蛋白泛素連接酶是否可以促進待測蛋白降解1、製備HY5-GFP樣品同實施例3的步驟四的1。2、製備MYC-C0P1樣品同實施例3的步驟四的2。3、製備WT樣品剪取菸草中未注射過的菸草葉片，用液氮磨碎葉片，樣品粉末放於-8(TC備用。4、檢測蛋白泛素連接酶是否可以促進待測蛋白降解(1)待測蛋白的降解實驗①用非變性蛋白提取緩衝液(含10iiMATP)分別提取兩個樣品；將HY5-GFP樣品的提取液作為提取液I，將WT樣品的提取液作為提取液II，將MYC-C0P1樣品的提取液作為提取液III，將等體積混合的提取液I和提取液II作為提取液IV，將等體積混合的提取液I和提取液III作為提取液V。②兩種提取液(提取液IV和提取液V)放於4t:輕輕搖蕩混合併於0、2、4、6小時分別取樣。③所取出的樣品加入4X蛋白上樣緩衝液並煮沸5分鐘終止反應，進行10%的SDS-PAGE膠分離，用電轉的方式把膠上的蛋白轉移到NC膜上，用麗春紅染色，然後分別用GFP的抗體和MYC的抗體進行免疫雜交。免疫雜交結果見圖5。圖5中，1:提取液IV，0小時；2:提取液V，0小時；3:提取液IV，2小時；4:提取液V，2小時；5:提取液IV，4小時；6:提取液V，4小時；7:提取液IV，6小時；7:提取液V，6小時。結果表明隨著時間的增加HY5-GFP融合蛋白的量明顯減少，而HY5-GFP融合蛋白降解產生的小片段蛋白明顯增加，且提取液V中HY5-GFP融合蛋白減少的速度明顯快於提取液IV。(2)加入抑制劑後待測蛋白的降解實驗①用非變性蛋白提取緩衝液(含10iiMATP和50iiMMG132)分別提取兩個樣品；將HY5-GFP樣品的提取液作為提取液I，將WT樣品的提取液作為提取液II，將MYC-C0P1樣品的提取液作為提取液III，將等體積混合的提取液I和提取液II作為提取液IV，將等體積混合的提取液I和提取液III作為提取液V;MG132是26S蛋白酶體的特異性抑制劑MG132。②同步驟(1)的②。③同步驟(1)的③。免疫雜交結果見圖6。圖6中，1:提取液IV，0小時；2:提取液V，0小時；3:提取液IV，6小時；4:提取液IV+MG132，6小時；5:提取液V，6小時；6:提取液V+16132，6小時。結果表明MG132可以抑制HY5-GFP融合蛋白被降解。實施例6、檢測待測蛋白是否可以在體外被泛素化—、製備35S:pl9重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟一。二、製備35S:HY5-GFP重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟二。三、製備35S:MYC-C0P1重組農桿菌的重懸液同實施例3的步驟三。四、檢測待測蛋白是否可以在體外被泛素化1、製備HY5-GFP樣品同實施例3的步驟四的1。2、製備MYC-C0P1樣品同實施例3的步驟四的2。3、檢測待測蛋白是否可以在體外被泛素化①用非變性蛋白提取緩衝液分別提取HY5-GFP樣品和MYC-C0P1樣品；將HY5-GFP樣品的提取液作為提取液I，將MYC-C0P1樣品的提取液作為提取液II，將等體積混合的提取液i和提取液n作為提取液m。②取提取液mlml，加入10iig的MYC抗體，4"輕輕搖蕩混合過夜。③第二天上午在提取液中加入20iU的IgGbeads,繼續4。C搖蕩三個小時，然後14000g離心5秒，收集免疫沉澱複合物。④免疫沉澱複合物用預冷到4t:的PBS洗三次後等分為三份第一份加入50ng泛素偶聯酶(E2)和5yg純化的帶有HIS標籤的泛素蛋白(his-Ub);第二份加入20ng泛素活化酶(El)和5yg純化的帶有HIS標籤的泛素蛋白(his-Ub);第三份加入20ng泛素活化酶(El)，50ng泛素偶聯酶(E2)和5yg純化的帶有HIS標籤的泛素蛋白(his-Ub)。⑤將三份免疫沉澱複合物分別加水補足30iU，在Ep管熱混合儀上30°C，900rpm反應一個半小時後加入4X蛋白上樣緩衝液並煮沸5分鐘終止反應，進行10%的SDS-PAGE膠分離，用電轉的方式把膠上的蛋白轉移到NC膜上，然後用GFP的抗體(或Nichel-HRP)進行免疫雜交。GFP的抗體的免疫雜交結果見圖7。Nichel-HRP的免疫雜交結果見圖8。結果表明加入El，E2，His-Ub的樣品中可以明顯看到有分子量大於HY5-GFP融合蛋白的條帶，說明C0P1確實在體外把泛素蛋白加在了HY5-GFP融合蛋白上。1權利要求一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法，包括如下步驟1)用DNA片段Ⅰ和p19基因瞬時轉染菸草葉片，得到菸草葉片甲；所述DNA片段Ⅰ為帶有標記基因A的待測蛋白基因；將含有泛素連接酶基因的DNA片段Ⅱ和p19基因瞬時轉染菸草葉片，得到菸草葉片乙；2)進行如下a)或b)或c)的操作a)檢測菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白是否與菸草葉片乙中的泛素連接酶結合；b)檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白降解；c)檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白與泛素蛋白連接。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述泛素連接酶基因如GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示；所述p19基因如GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述DNA片段II包括所述泛素連接酶基因和標記基因B;所述標記基因B與所述標記基因A不同。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述p19基因通過重組質粒35S:pl9瞬時轉染所述菸草；所述DNA片段II通過重組質粒35S:MYC-C0P1瞬時轉染所述菸草；所述重組質粒35S:pl9是在pCambia-1300221的多克隆位點間插入GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示的DNA得到的重組質粒；所述重組質粒35S:MYC-C0Pl是在pBA002-MYC的多克隆位點間插入GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示的DNA得到的重組質粒。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述步驟2)中，通過如下方法檢測菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白是否與菸草葉片乙中的泛素連接酶結合(I)用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片甲的總蛋白，得到提取液甲；用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片乙的總蛋白，得到提取液乙；然後進行(II)或(III);(II)將提取液甲和提取液乙混合，加入針對標記基因A編碼蛋白的一抗，然後加入IgGbeads,收集免疫沉澱複合物；將免疫沉澱複合物進行SDS-PAGE，轉膜後用針對標記基因B編碼蛋白的一抗進行免疫雜交，如果出現待測蛋白的信號，待測蛋白即為所述泛素連接酶的底物；(III)將提取液甲和提取液乙混合，加入針對標記基因B編碼蛋白的一抗，然後加入IgGbeads,收集免疫沉澱複合物；將免疫沉澱複合物進行SDS-PAGE，轉膜後用針對標記基因A編碼蛋白的一抗進行免疫雜交，如果出現待測蛋白的信號，待測蛋白即為所述泛素連接酶的底物。6.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特徵在於所述步驟2)中，通過如下方法檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白降解(I)用添加了ATP的非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片甲的總蛋白，得到提取液甲；用添加了ATP的非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片乙的總蛋白，得到提取液乙；用添加了ATP的非變性蛋白提取緩衝液提取未轉染菸草葉片的總蛋白，得到提取液丙；將提取液甲和提取液乙混合得到提取液甲乙，將提取液甲和提取液丙混合得到提取液甲丙(II)將提取液甲乙和提取液甲丙分別同時間隔時間取樣，進行SDS-PAGE;(III)轉膜後用針對標記基因A編碼蛋白的一抗進行免疫雜交，如果隨時間提取液甲乙和提取液甲丙中待測蛋白的信號均降低，且提取液甲乙的降低幅度大於提取液甲丙的降低幅度，待測蛋白即為所述泛素連接酶的底物。7.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特徵在於所述步驟2)中，通過如下方法檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的帶有標記的待測蛋白與泛素蛋白連接(I)用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片甲的總蛋白，得到提取液甲；用非變性蛋白提取緩衝液提取菸草葉片乙的總蛋白，得到提取液乙；(II)將提取液甲和提取液乙混合，加入針對標記基因B編碼蛋白的一抗，然後加入IgGbeads,收集免疫沉澱複合物；(III)將免疫沉澱複合物分成三組第一組加入泛素偶聯酶和帶有HIS標籤的泛素蛋白；第二組加入泛素活化酶和帶有HIS標籤的泛素蛋白；第三組加入泛素活化酶、泛素偶聯酶和帶有HIS標籤的泛素蛋白；(IV)三組分別進行SDS-PAGE，轉膜後分別用針對標記基因A編碼蛋白的一抗和Nichel-HRP進行免疫雜交，如果第三組有如下蛋白的信號，而第一組和第二組沒有如下蛋白的信號，待測蛋白即為泛素連接酶的底物分子量大於待測蛋白且具有針對標記基因A編碼蛋白的一抗的信號且具有Nichel-HRP信號。8.如權利要求5至7中任一所述的方法，其特徵在於所述非變性蛋白提取緩衝液的組成如下:50mMTris-MESpH8.O，O.5M蔗糖，ImMMgCl2，10mMEDTA，5mMDTT，有效劑量的蛋白酶抑制劑；其餘為水。9.如權利要求8中所述的方法，其特徵在於所述待測蛋白為HY5蛋白；所述標記基因A為GFP基因；所述標記基因B為MYC基因。10.—種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法，包括如下步驟1)將DNA片段A和pl9基因瞬時轉染菸草葉片；所述DNA片段A為帶有標記基因的待測蛋白基因；所述泛素連接酶的基因如GenBankAccessionNumber:NM_128855.3自5'端第68至2095位核苷酸序列所示；所述pl9基因如GenBankAccessionNumber:NC_001554.1所示；2)通過檢測步驟l)轉染後的菸草葉片中的帶有標記的待測蛋白是否進行了泛素化，判斷待測蛋白是否為泛素連接酶的底物。全文摘要本發明公開了一種檢測待測蛋白是否為泛素連接酶的底物的方法。本發明的方法，包括如下步驟1)用DNA片段Ⅰ和p19基因瞬時轉染菸草葉片，得到菸草葉片甲；DNA片段Ⅰ為帶有標記基因A的待測蛋白基因；將含有泛素連接酶基因的DNA片段Ⅱ和p19基因瞬時轉染菸草葉片，得到菸草葉片乙；2)檢測菸草葉片甲中的待測蛋白是否與菸草葉片乙中的泛素連接酶結合；檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的待測蛋白降解；檢測菸草葉片乙中的泛素連接酶是否促進菸草葉片甲中的待測蛋白與泛素蛋白連接。本發明用p19作為輔助基因，在菸草中表達待測蛋白和泛素連接酶蛋白，可以快速大量的得到翻譯修飾後的待測蛋白和泛素連接酶，結果更為準確。文檔編號C12Q1/25GK101781674SQ20091023648公開日2010年7月21日申請日期2009年10月23日優先權日2009年10月23日發明者劉利靜,唐三元,張譯月,謝旗申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所