從細胞中提取蛋白質的方法

2023-06-05 03:06:01

專利名稱：：從細胞中提取蛋白質的方法從細胞中提取蛋白質的方法交叉參考本申請要求於2006年5月11日提交的美國臨時申請號60〃47，076的權益，將該申請引入本文作為參考。
背景技術：
：在許多診斷方法中，從受試者中獲取細胞並將其存放在含有固定劑的液體培養基中。將細胞固定在培養基中，並通過細胞學方法對其進行檢查，從而提供診斷。例如，檢測子宮頸組織中的癌前或癌細胞通常通過顯微鏡評估脫落的子宮頸細胞進行。這種由GeorgeN.Papanicolaou開發並稱為"Pap"檢驗的方法包括利用取樣裝置從女性子宮頸剝離細胞，將剝離的細胞存放在含有固定劑的運送培養基中，和然後將該細胞放置在載玻片上。然後，染色細胞，並由受訓的醫學專業人員通過光學顯微鏡法檢査細胞的異常性。僅在美國，每年進行超過5千5百萬次的Pap檢驗。儘管該細胞學檢驗很成功，但是該檢驗容易出錯。例如，估計多至40%的常規Pap檢驗受到存在汙染物諸如粘液、血細胞和不明顯的炎性細胞的危害。這些汙染物引起假陰性結果、假陽性結果、和巨大的後繼工作量。參見，例如，Koss，L.G.(1989),用於子宮頸癌檢測的巴帕尼科拉烏試驗成功禾口災難(ThePapanicolaouTestforCervicalCancerDetection:ATriumphandaTmgedy)，JAMA261:737-743;還參見DeMay,"Pap塗片解釋中的問題"("ProblemsinPapSmearInterpretation"),病理學實驗室醫學紀錄(Arch.Pathol.Lab.Med.)121:229-23(1997)。鑑於上述內容，存在著對用於分析在含有固定劑的液體培養基中存在的細胞的補充分子診斷方法的需要。然而，該方法不是直接的，因為不總是可能在固定的細胞上進行該方法。例如，某些固定劑(例如，THINPREP，或SUREPATH^檢驗系統中使用的那些運送培養基)可以導致特定細胞的蛋白質沉澱或聚集，由此使得那些蛋白質不能溶解並難於或不可能通過常規方法，例如利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)或其他免疫學檢驗，得到可靠的檢測。因此，存在著對從固定的細胞中，以這樣的方式提取蛋白質的方法和組合物的巨大需要，所述方式容許提取的蛋白質適合於在分子測定，例如免疫學檢測測定中使用。本文描述的發明滿足了這一需要以及其他需要。文獻感興趣的文獻包括美國專利6,890,729,6,337,189和公布的美國專利申請20050032105。發明概述本發明提供了用於從細胞，優選固定的細胞中產生蛋白質提取物的方法。概括地，該方法包括增高所述細胞的pH到至少約pH10.0，從而產生中間組合物，和然後，在非離子型洗滌劑的存在下，中和所述中間組合物的pH，從而產生所述蛋白質提取物。該方法可以包括a)使所述細胞與提取試劑相接觸，從而產生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物；和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的pH，並產生蛋白質提取物。所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者含有所述非離子型洗滌劑。在某些實施方案中，固定的細胞可以是固定的脫落子宮頸細胞。定義除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬
技術領域：
中普通技術人員的通常理解相同的含義。儘管如此，為了清楚和容易參考的好處，在下文中定義了某些要素。當用於本文時，術語"細胞樣品"涉及含有一種或多種目的細胞的液體組合物。細胞樣品可以是含有從個體取出(例如，切除或剝離)的細胞的臨床樣品，所述細胞包括但不僅限於，例如，來自血漿、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮膚表面部分、呼吸道、腸道、和生殖泌尿道、淚液、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、或器官的細胞。在其他實施方案中，細胞樣品可以包含體外生長的細胞(包括但不僅限於在細胞培養基中的細胞、病毒感染的細胞、重組細胞、等)。在某些實施方案中，細胞樣品可以包含最容易被HPV感染的細胞。在這些實施方案中，可以從子宮頸、外陰、陰道、肛門、陰莖、口腔或喉嚨中獲得細胞。在某些實施方案中，細胞來自黏膜，並可以是上皮來源的。除剝離或切除的細胞外，細胞樣品可以或可以不包含汙染物。例如，粘液細胞、或細菌細胞、酵母細胞或血細胞可以存在於細胞樣品中。"HPV"是人乳頭瘤病毒屬，其包括但不限於HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、和82。"致癌HPV毒株"是己知為如由國家癌症研究所(NCI，2001)確定的引起子宮頸癌的HPV毒株。"致癌E6蛋白"是由致癌HPV毒株編碼的E6蛋白。示範性的致癌毒株是HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35、HPV30、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV59、HPV58、HPV33、HPV66、HPV68、HPV69、和HPV82。致癌E6蛋白的胺基酸序列存放在NCBI基因庫(NCBI'sGenBank)資料庫中。雖然不希望受到理論的限制，但是通常認為HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、和50不是致癌的。術語"多肽"和"蛋白質"可互換使用。術語"多B太"包括這樣的多肽和肽，在所述多肽中用非-天然存在的或合成的主鏈替換常規主鏈，且在所述肽中用一個或多個非-天然存在的或合成的胺基酸替換一個或多個常規胺基酸。術語"融合蛋白"或其語法等價物指由許多多肽成分組成的蛋白質，所述多肽成分在不以它們的天然狀態附著時，由它們各自的氨基和羧基末端通過肽鍵連接，從而形成單一連續多肽。融合蛋白可以是2、3或甚至4或更多個不同蛋白質的組合。術語多肽包括融合蛋白，其包括但不僅限於具有異源胺基酸序列的融合蛋白、具有異源和同源前導序列的融合、具有或不具有N-末端的甲硫氨酸殘基的融合；免疫學標記的蛋白質；具有能檢測的融合配偶體的融合蛋白，例如包括螢光蛋白、P-半乳糖苷酶、螢光素酶等作為融合配偶體的融合蛋白。通常，多肽可以是任意長度，例如多於2個胺基酸，多於4個胺基酸，多於約10個胺基酸，多於約20個胺基酸，多於約50個胺基酸，多於約100個胺基酸，多於約300個胺基酸，通常多達約500或1000或更多個胺基酸。"肽"通常多於2個胺基酸，多於4個胺基酸，多於約10個胺基酸,多於約20個胺基酸，通常多達約50個胺基酸。在一些實施方案中，肽為5-30個胺基酸長。多肽可以是天然的，其中它們可以由生物體或病毒的基因組編碼，或是非-天然的，其中它們非天然存在。術語"捕獲劑"指通過這樣的相互作用結合蛋白質的試劑，所述相互作用足以允許該試劑結合和濃縮來自不同蛋白的均勻混合物中的蛋白質。因此，術語"捕獲劑"指這樣的分子或多分子複合物，其能夠以低於約10'6M的解離常數(KD)，特異性結合分析物，例如，特異性結合關於所述捕獲劑的分析物，而不結合其他靶標。該結合相互作用可以由捕獲劑的親合區域介導。代表性的捕獲劑包括抗體(包括其片段和模擬)和含有PDZ結構域的蛋白質，等。術語"特異性結合"指捕獲劑優先結合存在於不同蛋白質的均勻混合物中的特定蛋白質的能力。在某些實施方案中，特異性結合相互作用應該區分樣品中的特定蛋白質和其他蛋白質，在一些實施方案中，超過約10-100倍或更多(例如，超過約1000-或io，ooo-倍)。術語"捕獲劑/蛋白質複合物"是由捕獲劑與蛋白質的特異性結合產生的複合物，即"結合配偶體對"。捕獲劑和關於該捕獲劑的蛋白質在"適合於特異性結合的條件"下，彼此特異性結合，其中所述條件是容許在處於溶液中的捕獲劑和待結合的蛋白質之間發生結合的那些條件(在鹽濃度、pH、洗滌劑、蛋白質濃度、溫度、等方面)。該條件，特別是關於抗體和它們的抗原，是本領域中眾所周知的(見，例如，Harlow和Lane，抗體冷泉港實驗室實驗室手冊(Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港(ColdSpringHarbor),紐約(1989))。在某些實施方案中，特異性結合在捕獲劑/蛋白質複合物中的捕獲劑和蛋白質之間的親和性由KD(解離常數)表徵，所述KD低於10—6M,低於10—7M,低於10—8M,低於10—9M,或低於約10—1QM。"結合配偶體"和等價物指能夠存在於捕獲劑/分析物複合物中的，即表現出彼此間特異性結合的分子對。術語"抗體"和"免疫球蛋白"在本文中可互換使用，指具有至少一個抗體表位結合結構域的捕獲劑。這些術語是本領域技術人員所熟知的，且指含有一種或多種與抗原特異性結合的多肽，一種抗體形式構成抗體的基本結構單位。該形式是四聚物，且由兩對相同的抗體鏈組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈。在每對中，輕鏈和重鏈可變區共同負責與抗原的結合，且恆定區負責抗體效應器功能。識別的免疫球蛋白多肽包括k和X輕鏈和a、Y(IgG,，IgG2，IgG3,IgG4)、S、s和p重鏈或其他物種中的等價物。全長免疫球蛋白"輕鏈"(約25kDa或約214個胺基酸)包括位於NH2-末端的約110個胺基酸的可變區和位於COOH-末端的k和X恆定區。全長免疫球蛋白"重鏈"(約50kDa或約446個胺基酸)，類似地包括可變區(約116個胺基酸)和一個上述重鏈恆定區，例如X(約330個胺基酸)。術語"抗體"和"免疫球蛋白"包括任何同種型的抗體和免疫球蛋白，保持與抗原特異性結合的抗體片段，其包括但不僅限於Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、以及包括抗體的抗原-結合部分和非-抗體蛋白的融合蛋白。可以例如利用放射性同位素，產生可檢測產物的酶、螢光蛋白等，可檢測地標記所述抗體。抗體可以進一步與其他部分，諸如特異性結合對成員，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對的成員)等綴合。抗體還可以與固相支持體結合，所述固體支持體包括但不僅限於聚苯乙烯平板或珠，等。該術語還包括Fab'、Fv、F(ab')2和或其他保持與抗原特異性結合的抗體片段。抗體可以以多種其他形式存在，所述其它形式包括例如，Fv、Fab、和(Fab')2、以及雙-功能(即，雙-特異性)雜種抗體(Lanzavecchia等，歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)17,105(1987))，並且以單鏈存在(例如，Huston等，美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，85，5879-5883(1988)和Bird等，科學(Science)，242,423-426(1988)，將其引入本文作為參考)。(參見，通常，Hood等，"免疫學"("Immunology"),Benjamin,N.Y"第2版.(1984),禾卩Hunkapiller和Hood,自然(Nature)，323，15-16(1986))。單克隆抗體和"噬菌體展示"抗體在本領域中眾所周知，且包含在術語"抗體"中。術語"評估"包括任何形式的測量，並包括確定元素是否存在。術語"確定"、"測量"、"評價"、"評估"和"測定"可互換使用，並且可以包括定量和/或定性的確定。評估可以是相對的或絕對的。"評估……的存在"包括確定某物存在的量，和/或確定其是存在還是不存在。"遠程位置"意指除了獲得細胞並將其存放在含有固定劑的液體中的位置以外的位置。例如，遠程位置可能是在獲得細胞的同一建築物中的不同房間(例如，另一個實驗室)，在獲得細胞的同一建築群中的不同建築物，或同一城市、州或國家中不同的位置，等。例如，當顯示細胞樣品是從遠程位置"接收"的時，該細胞樣品可以從遠程位置獲得，或從遠程位置交送、郵寄或信使遞送。"傳達"信息指從一個位置到另一個位置獲得信息的任何方法，無論是通過實體傳送包含該信息的列印材料，還是通過計算機可讀媒體(例如，通過郵寄)，或通過傳輸信息。如果傳輸信息，則通過合適的通訊通道(例如，私人的、公共的或無線網絡)傳輸代表該信息的數字或模擬信號(例如，電磁信號，諸如光或電信號)。可以使用任何便利的方法傳輸數據，例如傳真、數據機、網際網路、電子郵件、等。用於本文時，術語"運送培養基"用於描述適合於收集細胞和以某種方式保存那些細胞的液體，所述方式是容許它們適合於基於-液體的細胞學研究。Pap檢驗中普遍使用運送培養基。可以或不可以將運送培養基中存放的細胞在該培養基中，從一個位置運輸到另一個位置。運送培養基含有固定劑。將細胞存放在運送培養基中固定該細胞，從而產生固定的細胞。典型的運送培養基包括SUREPATHTM或PRESERVCYTTM運送培養基。"固定的細胞"是用化學固定劑處理或通過化學固定劑細胞學保存的細胞。固定的細胞通常適合於染色和隨後通過光學顯微鏡法進行的形態學和/或細胞學分析。作為參考的引入以如同每篇單獨出版物或專利申請特別和分別指出進行參考引用的相ii同的程度，通過參考將本說明書提及的所有出版物和專利申請引入本文。發明詳述儘管在本文中顯示和描述了本發明的優選實施方案，但是所述實施方案僅以舉例的方式提供，這對於本領域技術人員而言是顯然的。現在，在不偏離本發明的條件下，本領域技術人員應該想到許多變體、改變、和替換。應該理解本文中所述發明的實施方案的不同備選方案可以用在本發明的實踐中。下列權利要求意欲定義本發明的範圍，且這些權利要求範圍內的方法和結構以及它們的等價物包括在其中。本發明提供了用於從固定的細胞中產生蛋白質提取物的方法。概括地，該方法包括增高固定的細胞的pH到至少約pH10.0的pH，從而產生中間組合物，並且然後，在非離子型洗滌劑的存在下，中和中間組合物的pH，從而產生蛋白質提取物。該方法可以包括a)使固定的細胞與提取試劑接觸，從而產生具至少約pH10.0的pH的中間組合物，和b)使所述中間組合物與中和試劑接觸，從而中和中間組合物的pH，並產生蛋白質提取物。所述提取試劑和中和試劑之一或二者含有非離子型洗滌劑。在某些實施方案中，固定的細胞可以是固定的脫落的子宮頸細胞。本發明還提供了用於實施本主題方法的試劑盒和組合物。本主題方法用於多種不同的應用，包括在由此產生的蛋白質提取物中檢測特殊蛋白質的診斷檢驗中。進一步描述本發明前，應該理解本發明不受限於以下所述的本發明的特殊實施方案，因為可以產生所述特殊實施方案的變體，並且其仍然屬於所附權利要求的範圍。還應該理解，所使用的術語是為了描述特殊實施方案的目的，且不意欲進行限制。替代地，本發明的範圍應該由所附權利要求確定。在該說明書和所附權利要求中，單數形式"一"("a")、"一"("an")和"這"("the")包括複數參考，除非上下文另外明確指示。在提供數值範圍時，除非上下文另外明確指示，應該理解為本發明包括在該範圍上限和下限之間的每個介於其間的數值，直到下限單位的1/10，和該指定範圍內的任何其他指定的或介於其間的數值。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地包括在該較小的範圍內，並也包括在本發明內，服從於該指定範圍內的任何明確排除的界限。當該指定範圍包括所述界限中之一或二者時，排除那些包括的界限之一或二者的範圍也包括在本發明中。除非另外定義，本文中使用的全部技術和科學術語具有與本發明所屬領域中普通技術人員普遍理解的相同的含義。儘管類似於或等價於本文所述內容的任何方法、裝置和材料能夠用在本發明的實踐或檢驗中，現在描述優選的方法、裝置和材料。出於描述和公開在可以與本文所述的方法聯合使用的公布中所描述的要素的目的，將本文提及的全部出版物引入本文作為參考。如上總結，本主題發明提供用於從固定的細胞中產生蛋白質提取物的方法和組合物。在對本發明更詳細的描述中，首先描述了該方法，隨後描述在實踐本主題方法中使用的試劑盒和系統。蛋白質提取的方法如上所示，本發明提供用於從固定的細胞中產生蛋白質提取物的方法。通常，該方法包括兩個步驟a)使所述固定的細胞與具有高於約pH10.0的pH的提取試劑相接觸，從而產生中間組合物，和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸。所述提取試劑和/或中和試劑含有非離子型洗滌劑。由此產生的蛋白質提取物含有非離子型洗滌劑，並具有中性pH(即，約pH7.0-約pH8.0)。該方法通常產生含有這樣的蛋白質的蛋白質提取物，所述蛋白質容易通過利用有關那些蛋白質的捕獲劑檢測。同樣地，由本方法產生的蛋白質提取物通常適合用於為了檢測那些蛋白質的結合測定，例如免疫學測定。在某些實施方案中，所述方法可以包括增高固定的細胞的pH到至少約pH10.0的pH，從而產中間組合物，和然後，在非離子型洗滌劑的存在下，中和所述中間組合物的pH,從而產生所述蛋白質提取物。由於，如上所述，非離子型洗滌劑可以存在於提取試劑或中和試劑(或提取試劑和中和試劑的二者)中，所以本方法的某些實施方案包括a)使固定的細胞與提取試劑相接觸，從而產生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物;和b)使所述中間組合物與包含非離子型洗滌劑的中和試劑相接觸；從而13中和所述中間組合物的pH並產生蛋白質提取物。在其他實施方案中，本方法可以包括a)使固定的細胞與包含非離子型洗滌劑的提取試劑相接觸，從而產生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物；和，b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸；從而中和所述中間組合物的pH並產生蛋白質提取物。在某些實施方案中，由本方法產生的蛋白質提取物可以比利用其他方法，例如不使用高pH提取步驟(即，增高pH到高於約pH10.0或pH11.0的步驟)、中和步驟(即，增高pH到約pH7.0-約pH8.0的步驟)和非離子型洗滌劑的方法生成的蛋白質提取物含有更多易受捕獲劑影響的蛋白質。單獨的高pH和單獨的非離子型洗滌劑都不產生這樣的蛋白質提取物。在特殊的實施方案中，高pH提取試劑溶解在固定的細胞中的蛋白質，而非離子型洗滌劑防止中間組合物中溶解的蛋白質在中和所述中間組合物的pH時再-聚集或沉澱。以下更詳細地描述了本方法中使用的試劑和由本方法產生的蛋白質提取物，並描述了可以如何使用所述試劑產生蛋白質提取物。如下文中所討論地，本方法中使用的試劑的最適濃度和pH可以根據使用哪種試劑而變化。然而，通過試驗或經驗的方法，容易確定試劑的最適濃度和pH。通過利用本發明的方法從中提取蛋白質的細胞本發明所述的方法學能夠用於從細胞樣品中提取靶蛋白或目的蛋白。細胞樣品可以是同源細胞群、或不同類型細胞的異源混合物。樣品細胞還可以含有"汙染物"，諸如粘液、血液細胞和炎性細胞，所述汙染物不是耙蛋白提取目的的興趣或不含有靶蛋白。在一些實施方案中，靶蛋白是在受到病毒、優選地病理學病毒感染的細胞中存在的病毒蛋白，並且所述細胞優選地是從哺乳動物，例如人中分離的細胞。致病病毒可以是在人或其他動物中引起致病作用或疾病的任何致病病毒。所述致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的不同毒株，諸如HIV-1和HIV-2。病毒蛋白可是HIV糖蛋白(或表面抗原)諸如HIVGP120和GP41,或衣殼蛋白(或結構蛋白)諸如HIVP24蛋白。致病病毒可以是依波拉或馬爾堡病毒。病毒蛋白可以是依波拉糖蛋白或表面抗原，諸如依波拉GP1或GP2蛋白。致病病毒可以是肝炎病毒，諸如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒。例如，病毒蛋白可以是B型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，諸如小B型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也稱為澳大利亞抗原(Australiaantigen)),中B型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大B型肝炎表面抗原(LHBsAg)。病毒抗原可以是C型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，諸如NS3、NS4和NS5抗原。致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，RSV病毒蛋白可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)。致病病毒可以是單純皰疹病毒(HSV)，諸如HSV-1和HSV-2。例如,HSV病毒抗原可以是來自HSV-2的糖蛋白D。靶蛋白可以是腫瘤抗原，諸如乳腺癌細胞的Her2和淋巴瘤細胞上的CD20,靶蛋白可以是病毒致癌基因諸如人乳頭狀瘤病毒的E6和E7，或是細胞致癌基因諸如突變的ms。.在一些實施方案中,細胞樣品含有其中存在靶蛋白的固定的細胞。本方法中使用的固定的細胞通常通過將細胞(例如，通過解剖、剝離或灌洗從受試者切除細胞而獲得)樣品存放在液體培養基中獲得。可以將細胞樣品存放在已經包含化學固定劑的液體培養基中，或在將細胞置於所述培養基後，可以向所述液體培養基中添加化學固定劑。含有固定劑和固定的細胞的液體培養基在本文中稱為"細胞樣品"。本方法中可以使用的典型化學固定劑包括醇(例如，甲醇或乙醇)，醛(例如，戊二醛(gluteraldehyde)或甲醛)和酮(例如，丙酮)，以及四氧化鋨，乙酸，苦味酸和重金屬離子鹽。本方法可以使用的其他固定劑的實例包括基於亞硫酸氫鹽的固定劑(其可以還包括乙酸)，基於-PVP的固定劑(其可以還含有丙二醇和甲醇)以及美國專利號3,546,334、4,578,282、4,857,300、5,104,640、5,256,571、5,432,056和5,196,182中記述的那些。本方法可能使用的固定劑的實例，包括那些固定劑的工作濃度，可以參見Baker,(生物學顯微技術原理固定和染色的研究(PrinciplesofBiologicalMicrotechnique:AStudyofFixationandDyeing),1959)禾口Williams("用於免疫細胞化學的組織製備"("Tissuepreparationforimmunocytochemistry")，臨床病理學雜誌(JClinPathol)199750:422)。本方法中特別感興趣的是被稱為"運送培養基"並常規作為婦科檢查一部分的，用於收集、保存(即，固定)和運送子宮頸陰道細胞(例如，脫落的子宮頸細胞)的液體培養基。FDA批准的運送培養基是特別感興趣的。可以使用的可商購運送培養基的實例包括例如，基於甲醇的PRESERVCYTTM運送培養基(其作為Mass.莫爾伯勒(Marlborough)Cytyc，公司，的THINPREPTM婦科取樣試劑盒的一部分出售)，基於乙醇的、正式稱為CYTORICH的SUREPATH運送培養基(TriPath，公司.Burlington,N.C.),和基於甲醇的CYTOLYT運送培養基(Cytyc，公司，莫爾伯勒(Marlborough)，Mass.).可以通過常規方法，包括但不僅限於剝離(例如，刮)、解剖和灌洗，獲得細胞。特別感興趣的是子宮頸來源的上皮細胞，該細胞典型地是通過利用適合的刷子、抹刀或刮刀的剝離方法獲得的，並將其存放在含有固定劑的液體培養基中。提取試劑本方法中使用的提取試劑含有以這樣的量存在的成分，所述量在濃度上足以隨著將該提取試劑加入到固定的細胞中，產生具有至少pH10.0的pH的蛋白質提取物。因此，所述提取試劑通常具有至少約pH10.0的pH。使提取試劑與固定的細胞相接觸，從而產生中間組合物。提取試劑和由此產生的中間組合物的pH通常是至少約pHlO.O，例如，在約pHlO.O-約pH13.0或約pHll.O-約pH12.0的範圍內。在某些實施方案中，提取試劑可以具有約pH10.0-約pH10.5、pH10.5-約pHU.0、pH11.0-約pH11.5、pH11.5-約pH12.0、pH12.0-約pH12.5或pH12.5-約pH13.0的pH。例如，提取試劑可以利用任何合適的氫氧離子，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀，或碳酸鈣來源製成。在某些實施方案中,提取試劑可以不含有顯著量的變性劑。然而，在其他實施方案中，除了具有至少10.0的pH外，提取試劑還可以含有變性劑,例如,離子型洗滌劑，諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)或十二烷基肌氨酸鈉,或16離液劑，諸如尿素。在這些實施方案中,變性劑，如果存在的話,可以以這樣的濃度存在，所述濃度不顯著降低將來測定的靈敏性。在某些實施方案中,在樣品處理過程中，變性劑的濃度可以降低，例如，通過在使用前對蛋白質提取物使用中和緩衝劑或添加稀釋劑，例如緩衝液或水而稀釋變性劑。根據所使用的變性劑的強度和提取緩衝液的pH，變性劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、0.1M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在於提取緩衝液中。變性劑，如果存在於提取試劑中的話，可以以這樣的濃度存在，所述濃度充分低於使蛋白質變性典型使用的變性劑濃度。換言之，提取試劑可以含有處於這樣濃度的變性劑，所述濃度容許在按照本主題方法產生蛋白質提取物後，利用關於那種蛋白質的捕獲劑檢測蛋白質。所使用的變性劑濃度通常足以產生含有這樣的蛋白質的蛋白質提取物，所述蛋白質是在使用捕獲劑的結合測定，例如在抗體檢測測定中可容易檢測的。本提取試劑中的示範性變性劑及其濃度十二烷基硫酸鈉(SDS):約0.01%-約2%,例如，0.05%,肌氨醯約0.01%-約5%,例如，0.5%,胍約0.1M-約6M，例如，約0.5M，和尿素約0.1M-約8M,例如,約0.5M,重量/體積。典型地使用濃度為0.1%-0.5%的SDS變性蛋白質，典型地使用濃度為2n/。w/v的肌氨醯變性蛋白質，典型地使用濃度為2M-8M的尿素變性蛋白質，典型地使用濃度為3M-8M的胍變性蛋白質，典型地使用濃度為5%w/v的N-十六烷基三甲基銨氯化物變性蛋白質，且典型地使用濃度為2%,w/v的N-辛基葡萄糖苷變性蛋白質(見蛋白質純化手冊(ProteinpurificationHandbook),安瑪西亞法瑪西亞生物技術(AmershamPharmaciaBiotech)，第71頁(1999))。如果提取試劑不存在變性劑，則該試劑可以具有至少約pH11.0的pH。如果提取試劑含有洗滌劑，則該提取試劑的pH可以具有至少約pH10.0的pH。如在下文中更詳細描述地，在某些實施方案中,提取試劑還可以含有非離子型洗滌劑。17在某些實施方案中,提取試劑可以含有緩衝劑，從而將該試劑維持在理想的pH。如果本主題提取試劑中存在緩衝劑，則該緩衝劑在25"C，可以具有約9.0-約12.5範圍內的pKa。可以在主題蛋白質提取試劑中使用的示範性緩衝劑包括例如，CABS、哌啶、磷酸鹽、CAPS、甘氨酸或乙醇胺。在高於約pH10.0的pH處具有很小或不具有緩衝能力的緩衝劑(例如，tris、tricine、hepes、等)通常不用於緩衝提取試劑的pH，但是仍然可以存在於提取試劑中。除上述成分外，本主題蛋白質提取試劑可以含有其他成分，例如鹽離子螯合劑、蛋白酶抑制劑、等。蛋白質提取試劑可以是液體或固體組合物，並且在某些實施方案中,可以含有不同變性劑的組合。本提取緩衝液中可以使用的變性劑通常是強變性劑，且包括但不僅限於離液劑(例如，尿素、鹽酸胍、或硫氰酸鹽諸如硫氰酸鈉或硫氰酸胍、碘化鈉、高氯酸鈉等；參見K.Hamaguchi等，國家科學院學報(ProcNatl.Acad.Sci.)62:1129-1136,1962)和離子型洗滌劑(例如，十二垸基硫酸鈉(SDS)，十二烷基肌氨酸鈉或N-十六烷基三甲基銨氯化物)，其包括陽離子、陰離子和兩性離子洗滌劑(諸如CHAPS或CHAPSO)。本方法中可以使用的其他變性劑列在美國專利6,488,671的第7和8欄中，將其全部內容引入本文作為參考。在某些實施方案中，不使用弱變性劑，諸如LiCl、LiC104、LiBr、CaCl2或NaCl作為提取緩衝液中的變性劑，儘管在提取緩衝液或蛋白質提取物中除了前段列出的變性劑外，可以存在這樣的化合物。如上所示，使提取試劑與固定的細胞相接觸(例如，結合或混合)。在某些實施方案中，可以將含有固定的細胞的細胞樣品(例如,含有固定的細胞的運送培養基)直接加入到提取試劑中。在其他實施方案中,可以在向蛋白質提取試劑添加固定的細胞之前，從細胞樣品中分離(例如，通過沉降、離心、過濾或親合方法)固定的細胞。在加入到提取試劑中前，可以清洗細胞，或使細胞與其他試劑相接觸。全部或一部分可用的固定的細胞可以與提取試劑相結合。例如，在某些實施方案中，一部分固定的細胞可以在細胞學檢驗中使用，並且一部分固定的細胞可以與提取試劑相接觸，從而產生中間組合物。固定的細胞和提取試劑可以結合併被維持在合適的溫度(例如，冰上，在約室溫下或在約37。C)並且持續合適的時間(例如，10秒-24小時)，從而產生中間組合物。在某些實施方案中，在使固定的細胞與提取試劑相接觸後，立即使中和試劑和中間組合物相接觸。中和試劑本方法中使用的中和試劑具有隨著與所述中間組合物相接觸，足以中和上述中間組合物pH的pH。換言之，中和試劑含有非離子型洗滌劑，並具有這樣的pH，所述pH在該中和試劑與中間組合物相混合時，足以中和該中間組合物的pH。如在下文中更詳細描述地，在某些實施方案中，中和試劑可以含有非離子型洗滌劑中和試劑的pH足以中和通過使固定的細胞與主題提取試劑相接觸產生的中間組合物。根據提取試劑的pH和是否使用緩衝劑，中和試劑的pH可以是pH4.0-pH8.0。在某些實施方案中，中和試劑可以具有約pH4.0-約pH4.5、pH4.5-約pH5.0、pH5.0-約pH5.5、pH5.5-約pH60、pH6.0-約pH6.5、pH6.5-約pH7.0或pH7.0-約pH7.5的pH。例如，中和試劑可以是利用任何合適的氫離子來源，例如鹽酸或乙酸製成的。在某些實施方案中,中和試劑可以具有低於pH4.0的pH。中和試劑可以是緩衝的或非緩衝的。例如，如果所述中和試劑是緩衝的，則所述中和試劑可以是利用具有約6-約8的pKa的任何緩衝劑，例如，tris,hepes或tricine緩衝的。如上所示,提取試劑和/或中和試劑可以含有非離子型洗滌劑在某些實施方案中，使用的非離子型洗滌劑可以是乙基苯基聚乙二醇(NonidetP-40)、n-辛基葡萄糖苷、TRITON洗滌劑諸如TRITONX-100、辛基卩-硫葡糖吡喃糖苷、TWEENW洗滌劑諸如吐溫-20、或NP-40。根據所用洗滌劑的強度，洗滌劑可以以約0.01M-約0.05M、約0.05M-約0.1M、01M-約0.2M、約0.2M-約0.5M、約0.5M-約1.0M、約1.0M-約2.0M、約2.0M-約4.0M、或約4.0M-約8.0M的濃度存在於提取緩衝液或中和緩衝液中。美國專利6,488,671的第7和8欄中列出了可以在本方法中使用的其他洗滌劑，將其全部內容引入本文作為參考。在某些實施方案中,洗滌劑可以存在於提取和中和緩衝液二者中。本中和禾n/或提取試劑中的示範性洗滌劑及其濃度包括:TritonX-100:約0.1%-約10%，例如,約1%,NP40:約0.1%-約10%,例如,約1%，和吐溫-20:約0.1°/。-約10%,例如，約1%,重量/體積。如上所示，使中和試劑與中間組合物相接觸(例如，結合或混合)，從而產生具有中性pH(即，在約pH6.5-約pH8.0範圍內，例如，在約口117.0-約pH7.8範圍內的pH)的蛋白質提取物。蛋白質提取物還含有來自固定的細胞的蛋白質、處於以上列出的濃度的非離子型洗滌劑，和在某些實施方案中，用於將蛋白質提取物維持在特定pH範圍內的緩衝劑。如果將變性劑加入到固定的細胞中，則蛋白質提取物還可以含有該變性劑。pH、洗滌劑的選擇和所用洗滌劑的濃度(和，如果使用變性劑，則變性劑的確定和濃度)足以容許蛋白質提取物直接用於結合測定，從而檢測在蛋白質提取物中存在的蛋白質。細胞提取物的中和還可以通過使該提取物流經充滿中和試劑的過濾器或過濾嘴而實現。在提取物流過過濾材料時，中和試劑被溶解，且該提取物的pH接近中性。用於中和細胞提取物的備選方法是使所述提取物流過經處於中性pH的溶液預-平衡的BioSpin柱(BioRad)。還可以將提取物置於容納含有中和劑的凝膠(或過濾材料)的注射器或相似的裝置中，並通過正壓從所述注射器中遞送。在某些實施方案中，本主題蛋白質提取物含有溶解的HPVE6蛋白(特別是來自HPV致癌毒株的E6蛋白質)，所述HPVE6蛋白在對蛋白質提取物不進行進一步處理的條件下(例如，在不進一步加入變性劑、改變pH或加熱的條件下)，容易被捕獲劑接近和容易檢測。蛋白質提取物還可以含有溶解的或不可溶的膜、除HPVE6蛋白外的蛋白質、和其他細胞內容物諸如DNA、RNA、碳水化合物、等。還可以存在其他汙染物，諸如源自原始細胞樣品的mucal汙染的那些。蛋白質提取物成分通常不含有完整的(即，細胞學完整)細胞。蛋白質提取物可以立即使用，或在使用前，例如，以冷凍形式對其進20行保存。在特殊的實施方案中，由上述方法產生的蛋白質提取物可以用在蛋白質檢測方法中，下文中更加詳細地描述了該方法。如由上文明顯地，在上述試劑中可以使用多種不同的變性劑、洗滌劑、緩衝劑、pH和組分濃度。任何試劑中的最佳變性劑、洗滌劑、緩衝劑或pH、或組分濃度是容易利用常規方法確定的。中和細胞提取物後，通過用含有關於E6的粘合劑的粒子溫育該提取物，可以從所述細胞提取物中濃縮E6蛋白。粘合劑可以包括PDZ、E6關聯蛋白(E6AP)或其片段、或E6結合蛋白(E6BP)或其片段。在E6被該粒子捕獲後，清洗該粒子，並且然後通過用處於高於10的pH的緩衝劑溫育，將E6從所述粒子中釋放出來。將粒子從洗脫溶液中分離出來，並且然後通過前述過程中和剩餘的溶液。備選地，可以在不從所述捕獲粒子中釋放出來的條件下，檢測E6蛋白。蛋白質檢測方法由上述方法製成的蛋白質提取物可以直接或間接地(即，添加其他試劑後)用於評估在該蛋白質提取物中存在一種或多種蛋白質的方法中。蛋白質檢測法通常包括特異性結合蛋白質的捕獲劑。在進行所述方法時，待檢測蛋白質的身份可以是已知的(S卩，預-確定的)或未知的身份。可以利用本主題蛋白質檢測方法檢測的蛋白質包括這樣的蛋白質，所述蛋白質是疾病或病症，例如癌症、炎症疾病、或由例如病毒、細菌或真菌引起的感染的診斷標記。在某些實施方案中，利用本主題方法檢測的蛋白質是常規不可檢測的，除非使用本主題蛋白質提取物方法。可以利用本方法檢測的示範性蛋白質包括由傳染性介質，諸如人乳頭狀瘤病毒(HPV)編碼的蛋白質。在特殊的實施方案中，本方法可以用於檢測HPV的E6蛋白質，其是被證明在由固定的細胞製成的蛋白質提取物中通過其他方法很難或不可能檢測的蛋白質。概括地，蛋白質檢測方法是本領域中眾所周知的，且包括結合測定，即，檢測蛋白質和關於該蛋白質的捕獲劑之間結合的測定。所述測定包括免疫測定，即，使用與蛋白質特異性結合的抗體的結合測定，包括但不僅限於，利用諸如下列技術的競爭和非-競爭測定系統僅指出一些，蛋白質印跡法、放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、"夾心"免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體-固定測定、免疫放射測定、螢光免疫測定、和蛋白質A免疫測定。所述測定是本領域中常規的和眾所周知的(見，例如,Ausubd等，編,1994,分子生物學中的通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology),巻l,JohnWiley和Sons,公司，紐約，將其全部內容引入本文作為參考)。以下簡要描述示範性免疫測定。免疫沉澱方案通常包括產生蛋白質提取物，向蛋白質提取物中添加捕獲劑，例如抗體，和在一段合適的時間和溫度下，培養所述蛋白質提取物和捕獲劑。捕獲劑然後與固相支持體，例如，親合基底諸如與蛋白質A和/或蛋白質G相連的珠子相結合,並溫育和清洗該混合物。將固相支持體重新混懸在樣品緩衝液中，並可以通過例如，蛋白質印跡法檢測目的蛋白質。ELISA可以包括製備蛋白質提取物，連接蛋白質提取物和固相支持體(例如，多孔微量滴定平板的孔)，使該支持體-結合的蛋白提取物與捕獲劑例如抗體相接觸，和檢測所述捕獲劑和所述蛋白質之間的結合。在某些ELISA方法中，在使捕獲劑與支持體-結合的蛋白提取物相接觸前，可以用可檢測部分如酶底物(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)可檢測地標記捕獲劑。然而，在其他實施方案中，通過可檢測的第二捕獲劑(例如,第二抗體)，可以檢測捕獲劑與蛋白質提取物的結合，所述第二捕獲劑結合與所述蛋白質提取物相接觸的捕獲劑。在其它ELISA測定中，捕獲劑可以與固相支持體相連接，且蛋白質提取物和與固相支持體結合的捕獲劑相接觸。利用關於該蛋白質的第二捕獲劑，可以檢測蛋白質提取物中的蛋白質和固相-支持體抗體的結合。所述"夾心測定"是本領域中眾所周知的。在其他測定中，在捕獲劑的表面固定前，可以在溶液中發生該捕獲劑和蛋白質之間的結合。特別地，本方法可以用於檢測來自HPV致癌毒株的E6蛋白。在這些實施方案中，該檢測方法中使用的捕獲劑可以是，例如,包括與E6蛋白中包含的PDZ配體(g卩，關於PDZ結構域的結合位點)結合的PDZ結構域的抗體或多肽。例如，本E6檢測結合方法可以使用包含PDZ結構域的蛋白質，所述蛋白質含有MAGI-1的第二PDZ、或DLG或TIP1的PDZ結構域，等，如在公開的申請US20040018487(2004年1月29日公開)中所述，並將其全部內容引入本文作為參考。示範性的包含PDZ結構域的蛋白質和PDZ結構域序列顯示在申請US20040018487的表2和實施例4中。術語"PDZ結構域"還包括該序列的變體(例如，天然存在的變體)(例如，多形變體，具有保守取代的變體、等)和來自備選物種(例如，小鼠、大鼠)的結構域。典型地，PDZ結構域與美國專利申請系列號09/724,553中顯示的那些基本相同，將該申請引入本文作為參考，例如，當為了最大一致性而進行比較和比對時，至少約70%，至少約80%，或至少約90%的胺基酸殘基相同。本領域中認識到能夠突變PDZ結構域，從而提供能夠加強或削弱結合併改變特異性，但保持PDZ結構域的胺基酸變化(Schneider等,1998,自然生物技術(NatBiotech.)17:170-5)。除非另外指出，引用特殊PDZ結構域(例如，MAGI-1結構域2)意欲包括該特殊PDZ結構域及其HPVE6-結合變體。換言之，如果對特殊PDZ結構域作出引用，則也對結合HPV的致癌E6蛋白質的PDZ結構域變體作出引用，如下所述。在這方面，注意到蛋白質中PDZ結構域的編號可以改變。例如，如本文中所引用的MAGI-1結構域2(胺基酸序列為PSELKGKFIHTKLRKSSRGHTHAQWKIFQSIPIGASVDLELCRGYPLPFDPDDPN的)，在其他文獻中可以被引用為MAGI-1結構域1。同樣地，當在本申請中引用蛋白質的特殊PDZ結構域時，應該鑑於如本文所述地，特別是在申請US20040018487的序列列表表2中的結構域的序列，對該引用進行理解，當合適時，申請US20040018487的序列列表表2顯示了所述序列列表的序列和關於不同結構域的名稱和Genbank編號之間的關係。用於本文時，術語"PDZ蛋白質"指天然存在的含有PDZ結構域的蛋白質。示範性PDZ蛋白質包括CASK、MPP1、DLG1、DLG2、PSD95、NeDLG、TIP-33、SYNla、TIP-43、UDP、UM、UMK1、LIMK2、MPP2、N0S1、AF6、PTN-4、pr工16、41.8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVL1、TIP-40、TIAM1、MINT1、MAGI-1、MAGI-2、MAGI-3、KIAA0303、CBP、MINT3、TIP-2、KIAA0561、和TIP-1。用於本文時，術語"PDZ-結構域多肽"指含有PDZ結構域的多肽，諸如包括PDZ結構域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白質、或分離的PDZ結構域肽。因此，PDZ-結構域多肽可以是約60或更多個胺基酸的長度、約70或更多個胺基酸的長度、約80或更多個胺基酸的長度、約90或更多個胺基酸的長度、約IOO或更多個胺基酸的長度、約200或更多個胺基酸的長度、約300或更多個胺基酸的長度、約500或更多個胺基酸的長度、約800或更多個胺基酸的長度、約IOOO或更多個胺基酸的長度，通常多達約2000或更多個胺基酸的長度、約50-2000個胺基酸的長度、約50-1500個胺基酸的長度、約50-1000個胺基酸的長度、約60-1000個胺基酸的長度、約70-1000個胺基酸的長度。PDZ結構域肽通常不多於約200個胺基酸(例如，50-200個胺基酸、60-180個胺基酸、80-120個胺基酸、或90-110個胺基酸),並編碼PDZ結構域。例如，適合於檢測HPV的E6蛋白質的抗體記述在20050142541(2005年6月30日公開的)中。在公開的美國專利申請US20040018487中找到用於識別來自HPV致癌毒株的E6蛋白的詳細方法，將該方法的全部內容引入本文。這些公開的方法易於適合在本方法中使用。在某些實施方案中，抗-E6抗體可以與固相支持體結合，並且使由本主題方法產生的蛋白質提取物和與固相支持體結合的抗體相接觸。利用包含PDZ結構域的蛋白質，可以檢測蛋白質提取物中的致癌E6蛋白的結合。在其他實施方案中,包含PDZ結構域的蛋白質可以與固相支持體結合，並且使由本主題方法產生的蛋白質提取物和與固相支持體結合的包含PDZ結構域的蛋白質相接觸。利用抗-E6抗體，可以檢測蛋白質提取物中的致癌E6蛋白的結合。在備選的方法中，在包含PDZ結構域的蛋白質的抗體之間的結合可以發生在溶液中(即，在缺乏抗體或包含PDZ結構域的蛋白質與固相支持體結合的條件下)，並且，結合後，該抗體或包含PDZ結構域的蛋白質可以與固相支持體(例如，珠或類似物)結合。在這些實施方案中，包含PDZ結構域的蛋白質可以是具有親合結構域的融合蛋白，所述親合結構域與固相支持體相結合。利用識別E6蛋白的第二捕獲劑，能夠檢測E6蛋白的存在。可以將獲自上述測定方法的結果與獲自合適的對照，例如，陽性對照24(其中，可以使用已知含有與捕獲劑結合的蛋白質的蛋白質提取物)或陰性對照(例如，其中可以使用不與細胞樣品相接觸的蛋白質提取試劑)的結果進行比較。獲自上述測定方法的結果可以顯示在蛋白質提取物中蛋白質的存在、缺乏、或在某些實施方案中，顯示在蛋白質提取物中蛋白質的含量。在某些實施方案中，可以將獲自上述測定方法的結果傳達回遠程位置，例如，通過電話、傳真、電子郵件、郵寄或任何其他方式。例如，可以將所述結果傳達給受試者或受試者的醫生。以上蛋白質檢測方法可以與不同的檢驗，諸如細胞學檢驗，例如用於確定癌或癌前子宮頸細胞的Pap檢驗、或其他分子檢驗聯合進行。在這些實施方案中,在使用前，可以將細胞樣品分為幾部分。第一部分可以在細胞學測定中使用，且第二部分可以在上述方法中使用。依照以上內容，本發明的某些實施方案還提供了用於產生蛋白質提取物的系統。該系統通常含有a)包含固定的細胞的細胞樣品；b)具有至少約pH10.0的pH的提取試劑；和c)中和試劑，其中所述固定的細胞、提取試劑和中和試劑可以在以上方法中使用，從而產生適合於在結合測定中使用的蛋白質提取物。所述提取試劑和/或中和試劑含有非離子型洗滌劑。試劑盒在另一方面中，本發明提供用於實施本主題方法的試劑盒，例如，用於從固定的細胞中產生蛋白質提取物的試劑盒，在某些實施方案中，用於檢驗蛋白質提取物中蛋白質的存在的試劑盒。本主題試劑盒至少包括具有至少約pH10.0的pH的提取試劑，和中和試劑。所述提取試劑和/或中和試劑含有非離子型洗滌劑。另外，該試劑盒可以包括用於檢測蛋白質的捕獲劑，禾P,在某些實施方案中，用於利用捕獲劑檢測蛋白質的試劑(例如，緩衝劑和檢測試劑)。以上成分可以存在於分別的容器中或可以將一種或多種成分組合到一個容器，例如玻璃或塑料瓶中。除以上成分外，本主題試劑盒還可以包括用於實施本主題方法的操作指南。這些操作指南可以以多種形式出現在本主題試劑盒中，在試劑盒中25可以出現一種或多種形式。這些操作指南可以出現的一種形式是作為在試劑盒包裝中、在包裝插頁等中的合適媒介或基底上印刷的信息，例如在一張或數張在其上印刷了該信息的紙上的印刷的信息。另一種方式是其上記錄了該信息的計算機可讀媒體，例如，磁碟、CD、等。再一種可以出現的方式是可以用來通過網際網路訪問處於遠端的信息的網站地址。該試劑盒中可以存在任何便利的方法。效用上述方法和系統易於用於多種研究和診斷方法，包括診斷特殊疾病或病症、或由傳染性媒介諸如病毒或細菌引起的感染的方法。在一個實施方案中,將本方法用作檢測HPV感染的細胞診斷的一部分。由於HPV的致癌毒株的存在與癌和癌前細胞相關，所以本方法可以用於檢測癌或癌前子宮頸細胞。已知HPV是下列疾病中的病原體疣狀表皮發育不良(EV)，即導致皮膚(例如，鱗狀細胞的)癌高風險的終身皮膚病症；子宮頸瘤形成，諸如子宮頸上皮內瘤形成(CIN)和侵入性子宮頸癌(ICC);陰道瘤形成，諸如陰道上皮內瘤形成(VAIN)和陰道癌(VC);外陰瘤形成，諸如外陰上皮內瘤形成(VIN)和外陰癌；陰莖癌(包括，退行發育丘疹病(Bowenoidpapulosis));肛門(AC)和肛周癌(PC);口咽癌(OS);食管癌(EC);非-黑素瘤皮膚癌(例如，基細胞癌-BCC和鱗狀細胞癌-SCC);和黑素瘤。同樣，在一個實施方案中，本方法可以用作對任何這些疾病的診斷。在一個實施方案中，從受試者獲得(例如，剝離或切除)細胞，並將其存放在含有固定劑的液體培養基中，在某些實施方案中，所述液體培養基可以是用於細胞學檢驗的運送培養基。通常在醫生的辦公室或診室中獲得細胞，將細胞樣品轉送到檢驗機構並且由其接收，在所述機構中，進行了上述蛋白質檢測方法和，任選地，細胞學測定。將來自該檢驗的結果傳達給受試者，在一些實施方案中，通過醫生及其同事傳達。其細胞被採用的受試者可以是哺乳動物，例如，狗或貓，齧齒動物(例如，小鼠、豚鼠、或大鼠)，或靈長類動物(例如，人、黑猩猩、或猴)。在許多實施方案中，受試者應該是人，具體地，男性或女性。在某些實施方案中，受試者可以表現出HPV感染的症狀(例如,可以在身體的一處或多處具有疣),可以被懷疑受到HPV的感染(例如，可以含有與所述感染在細胞學上一致的細胞)或可以已被檢驗出HPV陽性。在某些實施方案中，受試者可以不具有HPV感染的適應證,且以上方法可以用作常規篩查的一部分。在一個實施方案中，本方法可以用於檢測致癌HPV的任何毒株，例如，HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35、HPV30、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV59、HPV58、HPV33、HPV66、HPV68或HPV69，(特別地，任何最普遍的HPV毒株，例如，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45),其通過檢測來自所述毒株的E6蛋白而進行。在一個實施方案中，在本方法的起始點，尚不知固定的細胞是否含有致癌E6蛋白或致癌E6蛋白來自哪種毒株。如果檢測測定顯示出在固定的細胞中存在致癌E6蛋白，則感染那些細胞的HPV毒株的身份能夠通過其他分子測定或通過病毒DNA測序而確定，分子測定例如使用對特殊E6蛋白或由病毒編碼的其他蛋白質特異的抗體的那些。通過舉例說明而非限制的方式，提供了一些實施例。實驗提取摻加的(spiked)臨床樣品將受HPV16E6基因(C33A+)轉染的細胞用THINPREP頂培養基固定，並如下所列出地，將其添加(即，"摻加")到部分THINPREP，固定的臨床樣品中。將細胞摻加到5種臨床樣品中每一種的一半中(每一半臨床樣品具有2千萬個C33A+細胞)。提取方案-C33A(+)ThinPrep細胞/20M細胞/ml1-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到K臨床陰性弁229(l.Oml提取物)中2-將20MC33A(+)ThinPr印細胞添加到^臨床陰性弁230(l.Oml提取物)中3-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到K臨床陰性弁231(1.0ml提取物)中4-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到^臨床陰性弁232(l.Oml提取物)中5-將20MC33A(+)ThinPrep細胞添加到W臨床陰性存233(l.Oml提取物)中6-20MC33A(+)TWnPrep細胞(l.Oml提取物)提取試劑TritonX-100/Lot092K0171-(1%=5MNaCl/Lot5701-53-(0.15M=750pl)0.5.Tris鹼/Lot5708-20-(0.1M=5ml)05M甘氨酸/Lot5708-9-(0.1M=5ml)10%SDS/Lot5708-8-(0.05%=125^1)8M尿素/Lot5678-83-(0.25M=781^1)加入RO/DI至20ml-(8.1ml)5NNaOH/LotA09522-(525^1)加入RO/DI至25ml-(4.475ml)最終pH-11.48最終製劑0.1MTris/0.1M甘氨酸/0.15MNaCl/1%TritonX-100/0.05%SDS/0.25M尿素pH11.48蛋白質提取程序1.將細胞混懸液加入到50ml離心管中2.在3000rpm旋轉10-15分鐘3.小心地去除上清液4.將內容物轉移到15mlnunc管中5.在3000rpm旋轉10-15分鐘6.小心地去除上清液287.向沉澱加入需要量的提取試劑8.重新混懸，從而打碎細胞沉澱a.添加劑(處於1:100的DTT)9.檢查pH，調節到11,510.在RT(或對提取合適的溫度)下混合30分鐘11.在14,000rpm旋轉10-15分鐘12.去除澄清的上清液13.以1:IOO加入DTT14.用5NHC1中和到pH8.0，並在ELISA中檢驗(用31.(Hil5NHCl/lml中和到pH8.0)100mMDTT/NR5701-90/DOM2/7/05ELISA方法1—用5ug/ml處於PBS(lot021405)中的GST-Magi-PDZ(lot88.18/0.65ug/ul)包被平板(Nunc439454MaxisorpF96/lot542043)—100ul/孔llmlx5ug/ml=55ugxlul/0.65ug=84.6ulGST-Magi-PDZ2-在4'C溫育過夜3-用平板清洗劑清洗3次(TBS-吐溫)4-用250ul封閉緩衝劑(lot033005)封閉平板5-在25"溫育2小時6-用平板清洗劑清洗3次(TBS-吐溫)7-將100ulMBP-E6/溶解產物樣品加入到合適的孔中8-在25"C溫育1小時9-用平板清洗劑清洗3次(TBS-吐溫)10—將100ul處於5ug/ml的抗-E6抗體(4C6-2.85mg/ml-lot02)加入到處於2%BSAHNTG緩衝液(lot031805B)中的合適孔中。將N-末端肽(HPV16E6lot#PN3952-2)以10ug/ml加入到合適的樣品中，從而證實信號的特異性(在加入前，用抗-E6抗體預培養肽45分鐘)11-在25。C溫育2小時2912-用板清洗劑清洗3次(TBS-突文)13-在2%BSA/0.05%吐溫20緩衝液(lot040505)中製備山羊抗-小鼠IgG-HRP(傑克遜(Jackson)GxMIgG-HRP/目錄#115-035-062/lot60988)的1:5000稀釋液。10.0mlx1/5000=0.002mlx1000ul/ml=2.0ul山羊抗-小鼠IgG-HRP14-將lOOul1:5000山羊抗-小鼠IgG-HRP稀釋液加入到合適的孔中(去除TMB底物並置於室溫下)15-在25。C溫育1小時16-用平板清洗劑清洗5次(TBS-吐溫)17-加入100ulNeogenK-藍TMB底物(lot041018)18-在25t:溫育30分鐘19-加入100ul終止溶液(lot030705)並讀取A450製劑2。/。BSA/0,05。/。吐溫緩衝液-(lot040505)2%BSA封閉劑lot033005(49.975ml)吐溫20lotA016759301(0.025ml)結果tableseeoriginaldocumentpage30*提取體積-1ml如能夠從上表中看到地，對所有摻加的臨床樣品檢測E6結合。由以上結果和討論證明本主題方法為固定的細胞的分子分析提供許多獨特的優勢。具體地，本方法提供用於從固定的細胞中產生蛋白質提取物的常規方法，其中蛋白質提取物中的蛋白質是可以在結合測定中檢測的。由於通常很難檢測在固定的細胞中的某種蛋白質，所以，本主題發明表現出對本領域的顯著貢獻。將本說明書中引用的全部出版物和專利申請引入本文作為參考，如同將每篇單獨的出版物或專利申請特別地和個別地指定引入作為參考。任何出版物的引用是關於在提交日前的公開，並且不應該將其解釋為承認本發明沒有資格通過在先的發明先於所述出版物。儘管為了清楚理解的目的，通過舉例說明或實施例詳細描述了前述發明，但是對於本領域中普通技術人員明顯地是，根據本發明的教導，在不偏離所附權利要求的精神或範圍的條件下，可以對其進行某些改變和改進。權利要求1.用於從固定的細胞產生蛋白質提取物的方法，所述方法包括a)使所述固定的細胞與提取試劑相接觸，從而產生具至少約pH10.0的pH的中間組合物，和b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的所述pH，並產生所述蛋白質提取物，其中，所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者含有非離子型洗滌劑。2.權利要求1的方法，其中所述方法包括a)使所述固定的細胞與提取試劑相接觸，從而產生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物;和b)使所述中間組合物與包含非離子型洗滌劑的中和試劑相接觸；從而中和所述中間組合物的所述pH，並產生所述蛋白質提取物。3.權利要求1的方法，其中所述方法包括a)使所述固定的細胞與包含非離子型洗滌劑的提取試劑相接觸，從而產生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物；禾口b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸；從而中和所述中間組合物的所述pH，並產生所述蛋白質提取物。4.權利要求1的方法，所述方法還包括在步驟a)前，接收包含所述固定的細胞的細胞樣品。5.權利要求1的方法，其中所述細胞是固定的子宮頸細胞。6.權利要求1的方法，其中所述固定的細胞存在於SUREPATHTM、CYTOLYT或PRESERVCYT運送培養基中。7.權利要求4的方法，其中從遠程位置接收所述細胞樣品。8.權利要求1的方法，其中所述pH處於約pHll.O-約pH13的範圍內。9.權利要求1的方法，其中所述提取試劑包括變性劑。10.權利要求9的方法，其中所述變性劑是十二垸基硫酸鈉(SDS)、尿素或肌氨醯。11.權利要求1的方法，其中所述非離子型洗滌劑包括TRITON或TWEENTM洗滌劑。12.用於檢測蛋白質的方法，所述方法包括a)按照權利要求1的方法從固定的細胞中產生蛋白質提取物；和b)檢驗在所述蛋白質提取物中的所述蛋白質的存在。13.權利要求12的方法，其中所述檢驗使用關於所述蛋白質的捕獲劑。14.權利要求12的方法，其中所述檢驗包括免疫學測定。15.權利要求12的方法，其中所述測定是酶聯免疫吸附測定(ELISA)。16.權利要求12的方法，其中所述蛋白質是人乳頭狀瘤病毒(HPV)蛋白。17.權利要求12的方法，其中所述蛋白質是HPVE6蛋白。18.權利要求12的方法，其中所述固定的細胞是脫落的子宮頸細胞。19.權利要求12的方法，其中在所述接觸步驟a)之前，從遠程位置接收所述固定的細胞。20.權利要求12的方法，所述方法還包括d)將所述檢驗的結果傳達到遠程位置。21.用於產生蛋白質提取物的系統，所述系統包括a)包含固定的細胞的細胞樣品，b)具有至少約pH10.0的pH的提取試劑，和c)中和試劑，其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包括非離子型洗滌劑，且其中所述提取試劑和中和試劑可以在權利要求1的方法中使用，從而產生適合於在結合測定中使用的蛋白質提取物。22.權利要求21的系統，所述系統還包括用於檢測在所述蛋白質提取物中的蛋白質的試劑。23.用於從固定的細胞中產生蛋白質提取物的試劑盒，所述試劑盒包括a)具有至少約pH10.0的pH的提取試劑；b)中和試劑；禾口c)用於利用所述提取試劑和所述中和試劑進行權利要求1的方法的操作指南；其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包括非離子型洗滌劑。24.權利要求23的試劑盒，所述試劑盒還包括用於檢測所述蛋白質提取物中的蛋白質的試劑。25.權利要求24的試劑盒，其中所述試劑包括關於所述蛋白質的捕獲劑。26.權利要求24的試劑盒，其中所述蛋白質是HPVE6蛋白。27.用於從細胞樣品中提取靶病毒蛋白的方法，所述方法包括a)使包含存在或懷疑存在靶病毒蛋白的細胞的細胞樣品與提取試劑相接觸，從而產生具有至少約pH10.0的pH的中間組合物;禾口b)使所述中間組合物與中和試劑相接觸，從而中和所述中間組合物的所述pH，並產生所述靶病毒蛋白提取物。28.權利要求27的方法，其中所述提取試劑和所述中和試劑之一或二者包括非離子型洗滌劑。29.權利要求27的方法，其中所述細胞樣品中的細胞用化學固定劑固定。30.權利要求29的方法，其中所述化學固定劑選自由下列各項組成的組醇、醛、酮、四氧化鋨、乙酸、苦味酸、重金屬離子鹽、和丙二醇。31.權利要求30的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇；所述醛是戊二醛或甲醛；且所述酮是丙酮。32.權利要求1的方法，所述方法還包括在步驟a)之前，接收包含固定的細胞的細胞樣品。33.權利要求27的方法，其中所述病毒蛋白由致病病毒編碼。34.權利要求33的方法，其中所述致病病毒是選自由下列各項組成的組HIV、依波拉病毒、馬爾堡病毒、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)。35.權利要求27的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6或E7蛋白。36.權利要求35的方法，其中所述HPV是HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、或82。37.權利要求35的方法，其中所述HPV是致癌HPV毒株，所述致癌HPV毒株選自由下列各項組成的組HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35、HPV30、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV59、HPV58、HPV33、HPV66、HPV68、HPV69、和HPV82。38.權利要求27的方法，所述方法還包括檢測在所述提取物中所述靶病毒蛋白的存在。39.權利要求38的方法，其中所述檢測使用關於所述靶病毒蛋白的捕獲劑。40.權利要求39的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白；且所述捕獲劑是針對所述E6蛋白的抗體。41.權利要求39的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白；且所述捕獲劑包括包含PDZ結構域的多肽。42.權利要求41的方法，其中所述PDZ結構域是MAGI-1的第二結構域、DLG或TIP1的PDZ結構域。43.權利要求27的方法，其中所述細胞樣品還含有粘液或血液。44.權利要求27的方法，其中所述細胞樣品含有脫落的子宮頸細胞。全文摘要本發明提供了用於從細胞，諸如包含病毒蛋白的細胞中產生蛋白質提取物的方法。概括地，所述方法包括增高所述細胞的pH到至少約pH10.0，從而產生中間組合物，和然後，在非離子型洗滌劑的存在下，中和所述中間組合物的pH，從而產生蛋白質提取物。本發明還提供了用於實踐本主題方法的試劑盒和組合物。文檔編號C12Q1/70GK101460636SQ200780021031公開日2009年6月17日申請日期2007年5月11日優先權日2006年5月11日發明者南西·哈塞,維吉尼亞·克魯斯,彼得·魯,史蒂芬·洛弗爾,約翰內斯·施威澤,莉迪婭·布蘭克申請人:伯克頓迪金森公司;生命樹股份有限公司