桃膠分解酶生產菌株及其在製備桃膠多糖中的應用的製作方法

2023-06-19 01:05:41 1

專利名稱：：桃膠分解酶生產菌株及其在製備桃膠多糖中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及桃膠多糖的製備領域，具體涉及一種桃膠分解酶生產菌株及其在製備桃膠多糖中的應用。
背景技術：
：阿拉伯膠替代品的研究開發和生產是非常迫切而必要的，代替阿拉伯膠的新產品可以對穩定市場供應進行有效控制。桃膠是替代阿拉伯樹膠的唯一天然植物膠粘劑。桃、李、杏、櫻桃等樹幹分泌的膠稱為桃膠。桃膠是半透明的多糖物質，用途廣泛，可被用於食品、醫藥、化妝、印刷、纖維等輕、化工領域，如紡織工業用作酸性印花漿料，花筒雕刻工藝用作保護膠劑，印刷工業用作金粉膠粘劑等。桃膠在我國的工業化生產還剛起步，國內有些生產桃膠的廠家，但大部分都屬於酸鹼法製造粗製桃膠，該方法是將原桃膠用水浸脹後，通過酸、鹼和高溫的方法水解成水溶性桃膠，桃膠多糖高溫化學水解過程發生褐變反應會導致產品色澤變暗，在後續工序還要進行漂白脫色，在水解工序，浸提酸度大，加熱時間過長都會導致膠質徹底水解成單糖，降低提取率，浸提鹼性太強，會對生產設備造成影響，另外，採用酸鹼水解法生產工藝還會產生大量酸鹼廢水，造成一定的環保負擔。在國內外，桃膠多糖產品已作為商品出售，佔有可觀的市場份額並展現很大的市場潛力，目前市場對桃膠的需求越來越大，對產品質量要求也很高。但對桃膠產品性質及生產研究報導並不多。利用酶法生產桃膠多糖，是可以獲得高質量、相對分子量範圍較窄桃膠產品的一種有效生產技術。酶法生產是以酶為催化劑，具有高效、安全、生態和環保等特點，能夠有效帶動相關領域技術水平的提高，對應用產業開發新產品、提高質量、節能降耗、保護環境具有重要意義。找到一種高效低成本的桃膠生產用酶是制約桃膠生產的瓶頸。但目前尚未見到利用微生物發酵法生產桃膠分解用酶，從而進行桃膠多糖生產的相關報導。
發明內容本發明的目的在針對現有技術的不足，提供一種可生產桃膠分解複合酶的菌株，且該桃膠分解複合酶對桃膠具有較強的分解能力。本發明的另一個目的是提供上述菌株生產的桃膠分解酶，用於桃膠多糖中的製備。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的本發明人分離篩選到一株新的對大分子原桃膠具有分解能力的菌株，該菌株屬於微桿菌，名稱為微桿菌A5(英文名為Microbacteriumsp.A5)，已於2009年8月7日保存於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCN0:M209174。—、菌株的分離本發明人發現卡拉膠由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3，6-脫水半乳糖通過a-l，3糖苷鍵和P-l，4鍵交替連接而成，在1，3連接的D半乳糖單位C4上帶有l個硫酸基，很難被微生物分解；桃膠主要含有半乳糖，阿拉伯糖，木糖，糖醛酸，分子結構未知，半乳糖與糖醛酸含量與卡拉膠接近，因此本發明人篩選能分解卡拉膠的菌株，將該菌株用於降解桃膠。1.能分解卡拉膠菌株的篩選卡拉膠作為一種海產多糖，很少為陸地微生物所降解。但是在生產卡拉膠的工廠之中，發明人取得了卡拉膠自然變質的樣品，白色粉末狀的卡拉膠變質成為棕色的膠泥樣固體。以該變質的卡拉膠作為原料，先篩選降解卡拉膠的菌株，其步驟如下(1)採用稀釋塗平板法對變質卡拉膠進行微生物分離，樣品稀釋度為10—2、10—3、10—4和10—5，分別塗布營養瓊脂培養基平板和麥芽汁培養基平板上，每個濃度3個平板，好氧與厭氧培養後進行菌落分離；(2)將分離到的12個疑似菌種接入甲基紅卡拉膠培養基(培養基組成甲基紅0.lg、卡拉膠40g、營養肉湯10g，蒸餾水定容至1L)中培養，若該菌株可以分解卡拉膠使硫酸解離，則接種該菌種的培養基變紅；接著本發明人依次採用菌株對卡拉膠分解試驗、菌株對原桃膠分解試驗，篩選出對桃膠具有分解能力的菌株，其步驟如下2.菌株對卡拉膠分解實驗選取上述步驟(2)中，紅色最明顯的菌擴增(細菌使用營養肉湯，真菌使用液體真菌培養基)，將所得培養液50ml接入200ml不同濃度的純卡拉膠培養基中，另接入無菌水作對照組，測量其粘度作為對比；若卡拉膠分解則粘度有明顯降低；3.篩選菌株對原桃膠分解實驗選取上述試驗中對卡拉膠降解能力最強的細菌菌株，接入營養肉湯擴增，將所得培養液50ml接入200ml不同濃度的桃膠培養基中，另接入無菌水作對照組，測量其還原糖含量作為對比；如桃膠分解還原糖含量有明顯升高；最後，對篩選到的對桃膠具有分解能力的菌株，進行產酶馴化試驗，從而最終獲得具有高效降解桃膠活性的菌株，其步驟如下4.菌種產酶馴化實驗將上述試驗中獲得的對桃膠降解能力最強的菌株進行產酶馴化；第1次馴化方法分別取營養肉湯150ml、2X桃膠(質量百分比)、種子液化20mL、放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的蕩箱中振蕩培養七天；第2次馴化方法分別取營養肉湯150mL、4%(質量百分比)桃膠、第一次訓化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在30°C、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養七天；第3次馴化方法分別取營養肉湯150mL、6%(質量百分比)桃膠、第二次馴化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養至殘糖降為1%;第4次馴化方法分別取營養肉湯150mL、第3次馴化過的菌液20ml、8X(質量百分比)桃膠放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養至殘糖降為1%;經過四次馴化，最終獲得對桃膠分解力較強的菌株。二、菌種鑑定對上述篩選獲得的桃膠分解力較強的菌株進行鑑定。1.分子生物學鑑定對上述篩選所得對桃膠分解力較強的菌株，進行分子生物學鑑定，根據16SrDNA測序分子鑑定、細菌形態觀察和生理生化實驗，結果顯示該菌株與微桿菌屬(Microbacterium)同源性達99%以上，其形態特徵及生理生化特徵與微桿菌屬(Microbacterium)最相符合。2.本發明人從國內微生物菌種保藏中心購買了其它四株微桿菌菌株與本發明篩選的菌株共同用於桃膠分解實驗，本發明的菌株具有很強的桃膠分解能力，而其它四種菌株不具有桃膠分解能力。此外，國內外也未見有微桿菌菌株具有桃膠分解能力的相關報導。綜上所述，本發明篩選獲得了微桿菌屬的一種新菌株，名稱為微桿菌A5(英文名為Microbacteriumsp.A5)，該菌株可高產桃膠分解酶。三、菌種的培養條件本發明人經過試驗研究發現，本發明的微桿菌A5其培養條件如下斜面培養採用含8%桃膠(質量百分比)的營養瓊脂培養基，3(TC，培養36小時。液體培養採用含8%桃膠(質量百分比)的營養肉湯培養基，在3(TC、180r/min振蕩培養24小時。本發明在菌種篩選以及菌種培養中所需要的培養基，如營養瓊脂培養基、營養肉湯和麥芽汁培養基，均為本領域技術人員的常用培養基，其配方採用常規配方即可實現本發明。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明通過分離篩選獲得一株新菌株，該菌株可高效生產桃膠分解酶，將該分解酶用於桃膠降解，即可得到富有經濟價值的桃膠多糖；2.本發明採用酶法生產桃膠，其水解周期短，產品的相對分子質量分布較窄，無環境汙染，容易控制；3.本發明提供一種新的、更環保、產品質量統一的生物法樹膠生產工藝，利於社會的可持續性發展，同時也將促進我國農業栽培的廢棄物深加工綜合利用開發，具備很廣闊的市場前景。圖1為桃膠分解酶SDS-PAGE電泳圖；其中，1為蛋白Marker,2為桃膠分解酶粗酶製劑，3為稀釋後的桃膠分解酶粗酶製劑。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例並不對本發明做任何限定。實施例1菌株的篩選獲得本實施例以變質的卡拉膠作為原料，先篩選得到能降解卡拉膠的菌株，然後通過卡拉膠降解能力以及原桃膠降解能力，兩個篩選條件，挑選出對原桃膠具有降解能力的菌株，接著再結合菌種產酶馴化，從而最終獲得可高效降解桃膠的菌株，其具體步驟如下1.能分解卡拉膠菌株的篩選(1)採用稀釋塗平板法對變質卡拉膠進行微生物分離，樣品稀釋度為10—2、10—3、10—4和10—5，分別塗布營養瓊脂培養基平板和麥芽汁培養基平板上，每個濃度3個平板，好氧與厭氧培養後進行菌落分離；(2)將分離到的12個疑似菌種接入甲基紅卡拉膠培養基(培養基組成甲基紅0.lg，卡拉膠40g，營養肉湯10g，蒸餾水定容至1L)中培養，若該菌株可以分解卡拉膠使硫酸解離，則接種該菌種的培養基變紅；2.菌株對卡拉膠分解實驗選取上述步驟(2)中，紅色最明顯的菌擴增(細菌使用營養肉湯，真菌使用液體真菌培養基)，將所得培養液50ml接入200ml不同濃度的純卡拉膠培養基中，另接入無菌水作對照組，測量其粘度作為對比；若卡拉膠分解則粘度有明顯降低；3.篩選菌株對原桃膠分解實驗選取上述試驗中對卡拉膠降解能力最強的細菌菌株，接入營養肉湯擴增，將所得培養液50ml接入200ml不同濃度的桃膠培養基中，另接入無菌水作對照組，測量其還原糖含量作為對比；如桃膠分解還原糖含量有明顯升高；4.菌種產酶馴化實驗將上述試驗中獲得的對桃膠降解能力最強的菌株進行產酶馴化；第1次馴化方法分別取營養肉湯150ml、2X桃膠(質量百分比)、種子液化20mL、放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的蕩箱中振蕩培養七天；第2次馴化方法分別取營養肉湯150mL、4X桃膠(質量百分比)、第一次訓化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在30°C、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養七天；第3次馴化方法分別取營養肉湯150mL、6X桃膠(質量百分比)、第二次馴化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養至殘糖降為1%;第4次馴化方法分別取營養肉湯150mL、第3次馴化過的菌液20ml、8X桃膠(質量百分比)放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養至殘糖降為1%;經過四次馴化，最終獲得對桃膠分解力較強的菌株。實施例2菌株的鑑定分析本實施例對實施例1篩選獲得，對桃膠分解力較強的菌株進行鑑定。1.16SrDNA測序將該菌株提取DNA，採用核酸/蛋白質分析儀於NucleicAcid程序下測定，進行DNA純度和濃度檢測，進行PCR擴增，空白對照中含有除模板核酸外的所有組份。擴增產物送測序公司測序，將得到的鹼基序列通過網際網路在GenBank等國際核酸序列資料庫內進行同源序列搜索(blastsearch)，結果發現該菌株與微桿菌屬(Microbacterium)同源性達99%以上，其形態特徵及生理生化特徵與微桿菌屬(Microbacterium)最相符合。2.生理生化實驗實施例1篩選獲得的對桃膠分解力較強的菌株，其菌落形態為黃色菌落，表面光滑不透明，邊緣整齊有光澤；革蘭氏染色結果陽性，有球桿變形現象，但無明顯杆-球同期，厭氧實驗結果是好氧生長，厭氧條件下不生長；接觸酶實驗陽性，氧化酶實驗陰性，V-P實驗陰性，明膠液化實驗陽性，硝酸鹽還原實驗陰性，糖醇發酵實驗葡萄糖、蔗糖和海藻糖陽性，蜜二糖陰性。查閱常見細菌系統鑑定手冊和伯傑細菌鑑定手冊知，可知實施例1篩選到的菌株屬於微桿菌屬，桃膠發酵實驗結果陽性。目前已知的微桿菌屬的菌種，均沒有能降解桃膠的報導，因此實施例1篩選到的菌株有別於其它微桿菌株，說明本發明篩選獲得了微桿菌屬的一種新菌株，名稱為微桿菌A5(英文名為Microbacteriumsp.A5)，該菌株可高產桃膠分解酶。實施例3菌株生產桃膠分解酶的性質鑑定1.桃膠多糖的測定1)標準曲線的繪製葡萄糖標準液的製備準確稱取100mg葡萄糖，先用少量蒸餾水溶解後，轉移到100ml容量瓶中定容，得1.OOmg/ml的標準葡萄糖溶液。準確取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50ml的1.OOmg/ml葡萄糖標準液分別加入到50ml的容量瓶中，各加5ml的DNS在沸水浴中煮5min後流水迅速冷卻，定容搖勻，空白調零。在540nm的吸收光譜波長下測定光密度值。2)樣品測定分別取各儲備液1ml於50ml容量瓶中，其他步驟與標準曲線的製作相同，測出樣品的光密度值，並根據標準曲線求出含量。2.菌種對桃膠降解能力通過測菌體生長過程中含桃膠培養基中還原糖增加的情況，間接反映對菌株產酶分解桃膠解離出還願糖的能力。用含8%桃膠的培養基按5%接種量接入各液體菌種，301:，180rpm震蕩培養48小時測定發酵液中還原糖含量，還原糖含量升高表明原桃膠被不同程度降解。對照組本發明人從國內微生物菌種保藏中心購買了四株已保存的微桿菌，作為對照菌。空白對照以不接種的含8%桃膠的培養基為空白對照。發酵液經四層紗布過濾，6(TC烘乾至衡重稱量未分解桃膠重量，與發酵前添加量相比，計算桃膠分解率，結果如表1所示。表1不同菌株降解桃膠釋放還原糖含量tableseeoriginaldocumentpage8從表1可以看出，作為對照的四株現有微桿菌，對桃膠分解率僅有0.1%，而本發明的微桿菌A5對桃膠分解率有95%，說明本發明的微桿菌A5是一種新的微桿菌菌種，而且具有高效降解桃膠的能力。3.發酵液中粗酶的提取發酵液經濾布過濾後5000rpm離心30分鐘，得澄清的酶液，70%酒精沉澱，沉澱用加醋酸處理脫多糖，獲得粗酶製劑。4.桃膠分解酶系分析將上述粗酶直接進行SDS-PAGE電泳分析，電泳結果如圖1所示。從圖中可以看出，微桿菌A5分泌的降解桃膠酶，是一種複合酶，由兩種酶組成。實施例4微桿菌A5桃膠分解酶用於製備精緻桃膠多糖將原桃膠進行清洗，去除樹皮、泥土等雜質後，用清水進行浸泡，使其充分溶脹，加入實施例3中得到的，微桿菌A5生產的桃膠分解複合酶粗製劑，3(TC保溫24小時，間歇攪拌使反應均勻。將反應後的溶液5000rpm離心30min，去上清，通過DEAE-纖維素分子篩收集不同分子量多糖溶液，從而得到純淨的分子量均一的桃膠多糖溶液。採用進風溫度1S(TC，出風溫度9(TC的噴霧乾燥製得純淨的精製桃膠粉末。權利要求一種桃膠分解酶生產菌株，其特徵在於該菌株於已於2009年8月7日保存於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209174。2.權利要求1所述桃膠分解酶生產菌株的篩選方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)採用稀釋塗平板法對變質卡拉膠進行微生物分離，篩選出可分解卡拉膠的菌株；(2)將步驟(1)篩選到的菌株，進行不同濃度卡拉膠的分解試驗，篩選出卡拉膠分解力最強的菌株；(3)將步驟(2)篩選到的菌株，進行原桃膠分解試驗，篩選出桃膠分解力最強的菌株；(4)將步驟(3)篩選到的菌株進行產酶馴化，馴化過程中，桃膠的含量逐漸增加，最後得到對桃膠分解力較強的菌株，該菌株即為本發明所需的桃膠分解酶生產菌株。3.權利要求1所述桃膠分解酶生產菌株在製備桃膠多糖中的應用。全文摘要本發明公開一種桃膠分解酶生產菌株及其在製備桃膠多糖中的應用，該桃膠分解酶生產菌株屬於微桿菌，名稱為微桿菌A5，已於2009年8月7日保存於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209174。本發明的菌株可高效生產桃膠分解酶，將該分解酶用於原桃膠降解，即可得到富有經濟價值的桃膠多糖。利用本發明的菌株，可採用酶法生產桃膠，其水解周期短，產品的相對分子質量分布較窄，無環境汙染，容易控制。本發明提供一種新的、更環保、產品質量統一的生物法樹膠生產工藝，利於社會的可持續性發展，同時也將促進我國農業栽培的廢棄物深加工綜合利用開發，具備很廣闊的市場前景。文檔編號C12Q1/04GK101701198SQ200910193340公開日2010年5月5日申請日期2009年10月27日優先權日2009年10月27日發明者冉豔紅,戚彩娃,楊曼娜,陸俏穎申請人:暨南大學