一種多藥耐藥肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及檢測方法

2023-06-19 05:29:31

一種多藥耐藥肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種多藥耐藥肺癌動物模型的建立及檢測方法，建立方法是：a.首先進行細胞培養及鼠間接種傳代；b.鼠間接種傳代，建立模型；建立方法是：a.肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤生長狀況觀察；b.肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤形態學觀察；c.肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤耐藥性檢測；d.肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥基因mdr1和多藥耐藥相關蛋白基因mrp信使核糖核酸mRNA的半定量；e.肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達；本發明的優點是：肺癌裸鼠移植瘤模型耐藥性穩定，腫瘤表淺便於觀察，並體現完整的生物學特性，即具有人肺腺癌的組織結構和功能特徵，是較理想的多藥耐藥腫瘤模型。
【專利說明】一種多藥耐藥肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物藥理實驗【技術領域】，特別涉及一種多藥耐藥肺癌動物模型的建 立方法及檢測方法。

【背景技術】
[0002] 腫瘤的多藥耐藥（Multidrug Resistance, MDR)是導致肺癌化療失敗的主要原因， 也是肺癌治療急需解決的難題。據有關資料統計，在腫瘤年死亡率中，屬內在性多藥耐藥的 約佔61%，屬獲得性多藥耐藥的約佔33%，即90%以上的腫瘤患者死因與耐藥有關。肺癌MDR 形成機制很複雜，國內外對發生其進行了很多探索，因此，肺癌的多藥耐藥模型的建立很重 要。無胸腺裸鼠（Nude，簡稱裸鼠）目前已成為醫學生物學研究領域中不可缺少的實驗動物 模型。特別是在腫瘤學、免疫學、藥品與生物製品的安全性評價及有效藥品的篩選等實驗方 面，它有著特殊的價值。裸鼠的先天性T淋巴細胞免疫缺陷及近交系的特點，極大地減少了 個體差異，成為構建腫瘤模型較理想的載體。裸鼠移植瘤模型可以直接模擬人體內腫瘤的 自然生長過程，且能夠觀察腫瘤與宿主的相互作用。同時長期傳代方便，成功率高，是一種 研究腫瘤的重要方法。建立成功的裸鼠移植瘤模型，是進行藥物篩選的有利平臺。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的是建立耐藥性穩定的裸鼠肺腺癌移植瘤模型，為進行耐藥機制研究 及逆轉藥物篩選提供人源化動物模型，並可進一步拓展應用於腫瘤類重大疾病的診斷、防 治技術的轉化。本發明是這樣實現的；一種多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法： a、 首先進行細胞培養及鼠間接種傳代，人肺腺癌細胞株A549及耐藥細胞株A549/DDP， 常規傳代培養，取對數生長期的細胞備用； b、 鼠間接種傳代，建立模型，雌性近交系裸小鼠，4?5周齡，體重15g?17g，在無特 定病原體SPF級動物合格環境下飼養，自由攝取水分和食物，各實驗均在無菌超淨工作檯 中進行，無菌條件下，取對數生長期腫瘤細胞A549及A549/DDP，製備細胞懸液，裸鼠右腋下 接種0. 2ml/只，建立第一代人肺腺癌細胞A549和耐藥株A549/DDP裸鼠移植瘤模型；待裸 鼠皮下包塊長至約IOOmm3時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的A549、A549/DDP 瘤塊，置於玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有汙染，製備瘤細胞懸液，進 行細胞計數，裸鼠右腋下接種，建立第二代裸鼠模型；待裸鼠皮下包塊長至約IOOmm3時，脫 頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的A549、A549/DDP瘤塊，置於玻璃研磨器中，加入 RPMI-160培養基，抽樣證明沒有汙染，製備瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種，建 立第三代裸鼠模型；鼠間傳代至3代，每代6隻；用第4代裸鼠A549移植瘤組和A549/DDP 移植瘤組進行成模性檢測。
[0004] 按照上述的多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法建立的裸鼠肺癌多藥耐藥模型的 檢測方法： a、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤生長狀況觀察，第1?3代裸鼠均於移植後15±6天， 即9-21天左右出瘤，至3周左右直徑可長至5mm，第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤 成功率均為1〇〇%，平均潛伏期為7± 1.35天，即5. 65-8. 35天；平均每天生長速度為 102. 23±31. 66mm3,兩組瘤體積隨時間延長逐漸增大； b、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤形態學觀察，肉眼觀察：觀察第4代移植瘤見瘤體呈局部 結節樣生長，表面光滑，不易活動，收集移植瘤時見外觀呈黃白色，有血管生長分布，與周圍 組織邊界清晰，無粘連，剖面呈粉紅色，中央偶有出血壞死或液化，光鏡檢查：鏡下移植瘤呈 現中低分化的腺癌特徵，A549/DDP移植瘤則多呈實性團塊狀，呈橢圓形或長梭形，核大深 染，呈中度異形性，排列不整齊，核仁明顯。瘤細胞呈侵潤生長，壞死較少，間質有較多微血 管形成； c、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤耐藥性檢測，取裸鼠耐藥移植瘤，篩網法分離細胞， 對原代細胞與移植瘤細胞進行IC5tl檢測，原代A549細胞和A549/DDP細胞的IC5tl分別 為 24. I ii mol/L 和 335. 2 ii mol/L ;裸鼠 A549/nude 和 A549/DDP/nude 的 IC5tl 分別為 23. 8 ii mol/L和321. 4 ii mol/L，計算原代細胞和裸鼠移植瘤細胞的耐藥倍數，耐藥倍數= 耐藥細胞IC5tl /親本細胞IC5tl，分別為13. 9和13. 5,表明A549/DDP移植瘤細胞和原代細 胞對DDP的耐藥倍數無顯著差異，說明裸鼠移植癌耐藥性穩定； d、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥基因mdrl和多藥耐藥相關蛋白基因mrp信 使核糖核酸mRNA的半定量，逆轉錄-聚合酶鏈式擴增反應RT-PCR分析A549/DDP細胞 裸鼠移植瘤中多藥耐藥基因mdrl和多藥耐藥相關蛋白基因mrp的相對表達量分別為： 2. 079±0. 071、3. 503±0. 044,與A549裸鼠移植瘤相比，A549/DDP裸鼠移植瘤中多藥耐藥 基因和多藥耐藥相關蛋白基因的mRNA的相對表達量均顯者升1?/* <6.^7 ;提不在裸鼠耐 藥移植瘤中耐藥基因表達比較高，維持其耐藥性； e、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達，多藥耐 藥蛋白P-gp在細胞膜和細胞漿中表達，多藥耐藥相關蛋白MRP在細胞膜中表達；A549/DDP 移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達呈強陽性，可見大量較大的棕黃色 顆粒；統計學結果表明A549/DDP移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達 水平均顯著高於A549移植瘤組/7 < ft d
[0005] 本發明的優點是：肺癌裸鼠移植瘤模型耐藥性穩定，腫瘤表淺便於觀察，並體現完 整的生物學特性，即具有人肺腺癌的組織結構和功能特徵，是較理想的多藥耐藥腫瘤模型， 為研究逆轉肺腺癌的多藥耐藥提供了同人體來源、易重複的良好實驗動物體系，可以用於 肺腺癌耐藥機制和化療藥物篩選的研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0006] 圖1是本發明的流程圖； 圖2是A549/DDP裸鼠移植瘤組織形態觀察圖（蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察）； 圖3是裸鼠移植瘤組織多藥耐藥基因I (mdrl)的信使核糖核酸（mRNA)半定量表達 圖； 圖4是裸鼠移植瘤組織多藥耐藥相關蛋白基因（mrp)的信使核糖核酸（mRNA)半定量 表達圖；圖中，M為標尺，1為A549移植瘤，2為A549/DDP移植瘤。
[0007] 圖5是A549/DDP移植瘤多藥耐藥蛋白（P-gp)表達圖（免疫組織化學法，光鏡下觀 察）； 圖6是A549移植瘤多藥耐藥蛋白（P-gp)表達圖（免疫組織化學法，光鏡下觀察）； 圖7是A549/DDP移植瘤多藥耐藥相關蛋白（MRP)表達圖（免疫組織化學法，光鏡下觀 察）； 圖8是A549移植瘤多藥耐藥相關蛋白（MRP)表達圖（免疫組織化學法，光鏡下觀察)。

【具體實施方式】
[0008] -種多藥耐藥肺癌動物模型的建立及檢測方法： 1.裸鼠肺癌多藥耐藥模型的建立方法： a、 首先進行細胞培養及鼠間接種傳代。人肺腺癌細胞株A549及耐藥細胞株A549/DDP， 置於含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37°C、5%C02條件下培養。A549/DDP細胞培 養液中順鉬（DDP)的維持濃度為6 iimol/L。常規傳代培養，取對數生長期的細胞備用； b、 鼠間接種傳代，建立模型。雌性近交系裸小鼠（BALB/C-nu/nu)，4?5周齡，體重 15g?17g，在無特定病原體（SPF)級動物合格環境下飼養，自由攝取水分和食物，各實驗均 在無菌超淨工作檯中進行。無菌條件下，取對數生長期腫瘤細胞（A549及A549/DDP)，製備 細胞懸液，濃度為5 X IO7個/ml，裸鼠右腋下接種0. 2ml/只，建立第一代人肺腺癌細胞A549 和耐藥株A549/DDP裸鼠移植瘤模型。
[0009] 待裸鼠皮下包塊長至約IOOmm3時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的 A549、A549/DDP瘤塊，置於玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基(抽樣證明沒有汙染)，製備 瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種〇.2ml/只，30min內完成，建立第二代裸鼠模 型。
[0010] 待裸鼠皮下包塊長至約IOOmm3時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的 A549、A549/DDP瘤塊，置於玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基(抽樣證明沒有汙染)，製備 瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種〇.2ml/只，30min內完成，建立第三代裸鼠模 型。
[0011] 鼠間傳代至3代（6隻/代)。用第4代裸鼠A549移植瘤組和A549/DDP移植瘤組 進行成模性檢測。
[0012] 2.裸鼠肺癌多藥耐藥模型的檢測方法： a、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤生長狀況觀察，第1?3代裸鼠均於移植後15±6天 (即9-21天）左右出瘤，至3周左右直徑可長至5mm。第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤 成功率均為1〇〇%，平均潛伏期為（7±1. 35)天，（即5. 65-8. 35天）；平均每天生長速度為 (102. 23±31. 66) mm3。兩組瘤體積隨時間延長逐漸增大。

【權利要求】
1. 一種多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法，其特徵在於： a、 首先進行細胞培養及鼠間接種傳代，人肺腺癌細胞株A549及耐藥細胞株A549/DDP， 置於含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37°C、5%C02條件下培養；A549/DDP細胞培 養液中順鉬DDP的維持濃度為6 y mol/L ;常規傳代培養，取對數生長期的細胞備用； b、 鼠間接種傳代，建立模型，雌性近交系裸小鼠，4?5周齡，體重15g?17g，在無特定 病原體SPF級動物合格環境下飼養，自由攝取水分和食物，各實驗均在無菌超淨工作檯中 進行，無菌條件下，取對數生長期腫瘤細胞A549及A549/DDP，製備細胞懸液，濃度為5 X 107個/ml，裸鼠右腋下接種0. 2ml/只，建立第一代人肺腺癌細胞A549和耐藥株A549/DDP裸 鼠移植瘤模型；待裸鼠皮下包塊長至約100mm3時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完 好的A549、A549/DDP瘤塊，置於玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有汙染， 製備瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種〇. 2ml/只，30min內完成，建立第二代裸 鼠模型；待裸鼠皮下包塊長至約100mm3時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的 A549、A549/DDP瘤塊，置於玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有汙染，製備 瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種〇.2ml/只，30min內完成，建立第三代裸鼠模 型；鼠間傳代至3代，每代6隻；用第4代裸鼠A549移植瘤組和A549/DDP移植瘤組進行成 模性檢測。
2. -種按照權利要求1所述的多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法建立的裸鼠肺癌多 藥耐藥模型的檢測方法，其特徵在於： a、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤生長狀況觀察，第1?3代裸鼠均於移植後15±6天， 即9-21天左右出瘤，至3周左右直徑可長至5mm，第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤 成功率均為1〇〇%，平均潛伏期為7±1. 35天，即5.65-8. 35天；平均每天生長速度為 102. 23±31. 66mm3,兩組瘤體積隨時間延長逐漸增大； b、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤形態學觀察，肉眼觀察：觀察第4代移植瘤見瘤體呈局部 結節樣生長，表面光滑，不易活動，收集移植瘤時見外觀呈黃白色，有血管生長分布，與周圍 組織邊界清晰，無粘連，剖面呈粉紅色，中央偶有出血壞死或液化，光鏡檢查：鏡下移植瘤呈 現中低分化的腺癌特徵，A549/DDP移植瘤則多呈實性團塊狀，呈橢圓形或長梭形，核大深 染，呈中度異形性，排列不整齊，核仁明顯，瘤細胞呈侵潤生長，壞死較少，間質有較多微血 管形成； c、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤耐藥性檢測，取裸鼠耐藥移植瘤，篩網法分離細胞， 對原代細胞與移植瘤細胞進行IC5(I檢測，原代A549細胞和A549/DDP細胞的IC5(I分別 為 24. 1 ii mol/L 和 335. 2 ii mol/L ;裸鼠 A549/nude 和 A549/DDP/nude 的 IC5(I 分別為 23. 8 y mol/L和321. 4 y mol/L，計算原代細胞和裸鼠移植瘤細胞的耐藥倍數，耐藥倍數= 耐藥細胞IC5(I /親本細胞IC5(I，分別為13. 9和13. 5,表明A549/DDP移植瘤細胞和原代細 胞對DDP的耐藥倍數無顯著差異，說明裸鼠移植癌耐藥性穩定； d、 肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥基因mdrl和多藥耐藥相關蛋白基因mrp信 使核糖核酸mRNA的半定量，逆轉錄-聚合酶鏈式擴增反應RT-PCR分析A549/DDP細胞 裸鼠移植瘤中多藥耐藥基因mdrl和多藥耐藥相關蛋白基因mrp的相對表達量分別為： 2. 079±0. 071、3. 503±0. 044,與A549裸鼠移植瘤相比，A549/DDP裸鼠移植瘤中多藥耐藥 基因和多藥耐藥相關蛋白基因的mRNA的相對表達量均顯者升;提不在裸鼠耐 藥移植瘤中耐藥基因表達比較高，維持其耐藥性； e、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達，多藥耐 藥蛋白P-gp在細胞膜和細胞漿中表達，多藥耐藥相關蛋白MRP在細胞膜中表達；A549/DDP 移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達呈強陽性，可見大量較大的棕黃色 顆粒；統計學結果表明A549/DDP移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達 水平均顯著高於A549移植瘤組/7 < ft d
【文檔編號】G01N21/84GK104414771SQ201310369232
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】季旭明 申請人:季旭明