線蟲誘導型啟動子及其使用方法

2023-06-18 12:49:31 2

專利名稱:線蟲誘導型啟動子及其使用方法
線蟲誘導型啟動子及其使用方法
與相關申請的交叉引用
本申請要求2007年2月6日提交的美國臨時專利申請系列號 60/899,693的優先鬥又。
動子及其片段。本發明的啟動子可用於控制任一目的核酸在植物根中的轉 錄。尤其，本發明的啟動子可以用來控制編碼物質的核酸轉錄，其中所述 的物質破壞採食部位的形成或維持、破壞植物寄生線蟲的生長和/或繁殖， 賦予或改善植物對植物寄生線蟲的抗性或毒害植物寄生線蟲以減少作物破 壞。
發明背景
線蟲是以超過2，000種行栽作物、蔬菜、水果和觀賞植物的根、葉及 莖為食，造成世界範圍估計一千億美元作物損失的微小線蟲。多種寄生線 蟲物種感染作物植物，包括根癌線蟲(RKN)、形成胞嚢及形成損傷的線蟲。
以造成採食部位處^r艮癭形成為特徵的根癌線蟲具有相對廣泛的宿主範圍並
且因此對種類繁多的作物物種致病。形成胞嚢和形成損傷的線蟲物種具有 更有限的宿主範圍，不過依舊在易感作物中造成巨大損失。
致病性線蟲存在於美國各地，在南部和西部的溫暖溼潤地區及在沙壤 土中密度最大。大豆植物的最嚴重病蟲-大豆胞嚢線蟲(Heterodera glycines) 在1954年首次於美國的北卡萊羅納州發現。某些地區嚴重遭受大豆胞嚢線 蟲(SCN)侵染，以至於不採用控制措施，則大豆生產不再可能是經濟的。儘管大豆是受SCN侵襲的主要經濟作物，然而SCN寄生總計約50種宿 主，包括大田作物、蔬菜、觀賞植物和雜草。
線蟲損傷的跡象包括在炎熱時期矮化與葉子發黃及植物萎蔫。然而， 線蟲侵染可以引起嚴重產量損失，而無任何明顯的地上部分發病症狀。產 量減少的主要原因歸咎於地下的根損傷。受SCN感染的根矮縮或矮化。線 蟲侵染也可以減少根上固氮結節的數目，並且可以使根更易受其他土源性 植物病原體侵襲。
線蟲的生命周期具有三個主要階段卵、幼體和成體。該生命周期在 線蟲物種之間不同。例如，SCN的生命周期在最適條件下通常可以於24-30 日內完成，而其他物種可能經過長達一年或更長時間以完成生命周期。當 溫度和溼度水平在春季變得適宜時，蠕蟲形狀的幼體在土壤中從卵孵化出 來。僅幼體發育階段的線蟲能夠感染大豆根。
SCN的生命周期已經成為眾多研究的主題，並且因此是理解線蟲生命 周期的有用實例。在穿透大豆根後，SCN幼體通過根移動直至它們接觸維 管組織，此時SCN幼體停止遷移並開始採食。藉助口針，線蟲注射了調 節某些根細胞並將它們轉化成特化採食部位的分泌物。這些根細胞在形態 學上轉化成巨大的多核合胞體(或在RKN情況中為巨大細胞)，這種合胞體 被用作線蟲的營養物來源。主動採食的線蟲因此從植物竊取重要的營養物， 導致產量損失。當雌性線蟲採食時，它們膨脹並逐漸變得如此巨大，以至 於它們的身體突破根組織並暴露在根的表面。
在採食一段時間後，作為成體不膨脹的雄性SCN線蟲從根遷移至土 壤內並使膨大的雌性成體受精。雄性線蟲隨後死亡，而雌性線蟲仍與根系 統附著並繼續採食。膨大雌性線蟲中的卵開始發育，最初在身體外的團塊 或卵嚢(a mass or egg sac)中並隨後在線蟲體腔內發育。雌性成體的整個體 腔最終充滿卵，並且雌線蟲死亡。正是充滿卵的死亡雌線蟲身體才稱作胞 嚢。胞嚢逐漸釋放並游離存在於土壤中。胞嚢的壁變得極堅韌，從而為胞 嚢內所含大約200-400粒卵提供良好的保護作用。SCN卵在胞嚢內存活直 至適宜的孵化條件出現。儘管眾多的卵可以在頭一年中孵化，然而很多卵也會在保護性胞嚢內存活幾年。
線蟲可以依賴其自身力量在土壤中每年穿行僅幾英寸。然而，線蟲侵 染可以在多種方式下傳播相當遠的距離。可以移動受侵染土壤的任何事物， 包括農場機械、車輛和工具、風、水、動物和農場工人，能夠傳播這種侵 染。種子大小的土壤顆粒往往汙染收穫的種子。因此，當來自受侵染田地 的汙染種子在非侵染田地中播種時，可以傳播線蟲侵染。存在某些線蟲可 以通過鳥類傳播的證據。僅可以預防這些病因中的某些病因。
防治線蟲侵染的常規方法包括在線蟲侵染的土地中保持合理的土壤 養分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆蟲與雜草病害；使用消 毒措施，如僅在處理線蟲非侵染田地後才翻耕、播種和中耕線蟲侵染的田 地；在侵染的田地中工作後用高壓水或蒸汽徹底清潔設備；不使用在侵染 田地中生長的種子播種非侵染田地，除非這種種子已經得到正確地清潔； 輪作受侵染田地並且用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線蟲劑；和播種 抗性植物品種。
已經提出方法用於遺傳轉化植物以便賦予增加的植物寄生線蟲抗性。 美國專利號5，589，622和5,824,876涉及線蟲附著後在植物釆食部位內或其 附近特異性表達的植物基因的鑑定。美國專利號5,589,622和5，824，876公 開了從馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)感染的馬鈴薯根分離的8種 啟動子；沒有^Hf來自其他植物物種的線蟲誘導型啟動子。據稱這些啟動 子可用於指導有毒蛋白或酶特異性表達或指導針對靶基因或針對一般細胞 基因的反義RNA的表達。
美國專利號5,023,179 ^Hf命名為ASF-1的分離自CaMV啟動子的 啟動子增強元件，據稱其增強植物基因在根中的表達。
美國專利號5，750，386公開菸草(Nicotiana tabacum)RB7根特異性啟 動子的缺失片段，據稱其具有線蟲應答性。
美國專利號5,837,876公開從菸草分離並命名為TobRD2的根皮層特 異性基因啟動子。
美國專利號5，866，777公開了推遲線蟲採食結構形成的雙基因方法。第一個基因-芽孢桿菌RNA酶基因處於驅動至少在採食結構中表達的啟動 子控制下。第二個基因-芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因處於驅動在除所述採 食結構之外的全部植物細胞中表達的啟動子控制下。美國專利號5,866,777 中公開的採食部位特異性啟動子包括截短形式的A0,3TobRB7和rolC啟動子。
美國專利號5，955，646公開了基於源自根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露氨酸合酶基因和章魚鹼合酶基因的啟動子的嵌合調節區， 據稱其具有線蟲誘導性。
美國專利號6,005,092公開了菸草內切-l，4-P-葡聚糖酶(Ntce17)啟動子。
美國專利號6,262,344和6,395,963公開了從擬南芥分離的啟動子，據
稱其具有線蟲誘導性。
美國專利號6,448,471公開了來自擬南芥的啟動子，其對線蟲釆食部 位是特異性的。
美國專利號6,593,513公開了用擬南芥內切-l，4-P-葡聚糖酶基因(ce11) 啟動子控制下的芽孢桿菌RNA酶轉化植物以產生能夠破壞線蟲侵襲的植物。
美國專利號6,703,541公開了玉米過氧化物酶P7X基因及其啟動子的 克隆和分離。玉米過氧化物酶P7X啟動子被報導為線蟲誘導型的。
美國專利號6，906，241公開了與編碼殺線蟲或殺昆蟲蛋白質的異源核 酸組合的Ntcel7啟動子。
美國專利號7,078,589公開大豆Pyk20基因和啟動子的克隆與分離， 所述啟動子據稱將受SCN感染誘導並在維管組織中顯示強烈活性。
美國專利號7，196,247公開了大豆異黃酮合酶I的啟動子，所述啟動子 被報導為根特異的，並且在營養組織中是寄生蟲襲擊誘導型的。
美國專利號7，223,卯1公開了來自礴酸核糖甲醯甘氨脒核糖核苷酸合 酶(phosphoribosylformylglycinamidine ribonucleotide synthase)的啟動子 及其缺失片段，所述啟動子^皮報導為對線蟲感染應答。美國專利申請公開號2004/0078841公開擬南芥TUB-1、 RPL16A及 ARSK1啟動子和來自S宛豆(Pisum sativum)的PSMTA啟動子的啟動子 區，所述全部啟動子區據稱;l^艮特異性的。
美國專利申請公開號2004/0029167公開了來自菸草的II類咖啡酸O-甲基轉移酶基因的啟動子序列，據稱所述啟動子序列可應答於機械性或化 學性損傷或應答於致病體入侵而誘導。
WO 94/10320公開了來自菸草的A(UTobRB7啟動子片段及其與多 種基因 一起用於線蟲採食細胞特異性表達。
WO 03/033651 -^開了命名為SCP1、 UCP3和SUP的合成的線蟲調 節型啟動子序列。
WO 2004/029222及其美國同族專利-美國專利申請公開號 2005/0070697公開了來自大豆腺苷-5'-磷酸脫氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的 調節區，用於提高植物中的線蟲抗性。
上文提及的根特異性或採食部位特異性啟動子目前均未用在含有抗線 蟲轉基因的商品種子中。雖然對這類產品的需求久已承認，然而迄今無人 成功通過重組DNA技術開發抗線蟲植物。持續需求根特異性和/或線蟲採 食部位特異性啟動子以與編碼毒害植物寄生線蟲物質的轉基因組合。
發明概述
本發明提供適用於驅動第二多核苷酸在易感於線蟲侵襲的植物根中表 達的啟動子多核苷酸。本發明的啟動子多核苷酸特別用於產生抵抗線蟲侵 染的農業作物植物。
在一個實施方案中，本發明提供了包含分離的啟動子多核苷酸的啟動 子，所述啟動子能夠介導根優選的和/或線蟲誘導的表達，其中所述啟動子 多核苷酸選自a)具有SEQ ID NO:l中公開的序列的多核苷酸；b)包含 下述多核苷酸的核苦酸476到1476的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:l中公開的序列；c)與a)或b)的多核苷酸具有至少70。/。序列同一性的 多核苷酸;d)在嚴格條件下與a)或b)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和e)包含下述多核普酸的至少50個連續核苷酸、或至少IOO個連續核苷酸、或至 少200個連續核苷酸的片段的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:l 中公開的序列。
本發明還涉及包含本發明的分離的啟動子多核苷酸的表達盒和轉基因 植物，還涉及在作物中控制寄生線蟲侵襲的方法，其中所述方法使用重組 核酸構建體減少作物破壞，所述重組核酸構建體包含與下述核酸有效結合 的本發明的分離的啟動子多核苷酸，所述核酸編碼破壞植物寄生線蟲代謝、 生長和/或生殖的物質，賦予或改善植物對植物寄生線蟲抗性的物質，或對 植物寄生線蟲有毒的物質。
附圖概述

圖1:擬南芥基因座At5gl2170的啟動子多核苷酸的核酸序列(SEQ ID NO:l)。
圖2:大豆cDNA克隆50657480的核酸序列(SEQ ID NO:2)。 圖3:由大豆cDNA克隆50657480編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO:3)， 其中"*，，表示終止密碼子。
圖4: cDNA克隆50657480的微陣列數據。(N)中的N表示cDNA微 陣列測量的數量，ND表示在該研究中所述的實驗條件下不可檢出。名稱 "未處理的根，，表示下述全根組織aRNA (擴增的RNA)，其來自與經 SCN接種的區段同齡的未感染的根區段。名稱"非合胞體"表示全根組織 aRNA，其來自與不含有SCN或進食位點的感染區相鄰的被SCN感染的 根。名稱"合胞體"表示使用雷射捕獲顯微解剖(LCM)獲得的aRNASCN 合胞體樣品。
圖5:由擬南芥At5gl2170基因編碼的氨基,列(SEQ ID NO: 4)， 其中"*，，表示終止密碼子。
圖6:大豆cDNA克隆50657480編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)與 擬南芥At5gl2170基因編碼的氨基,列(SEQ ID NO: 4)的比對。
圖7:在實施例4中公開的大豆髮根測定中，雙元栽體pAW280的卩-葡糖酪酸糖苷酶表達模式。SCN接種後12天，對大豆胞嚢線蟲感染的發 根和對照未感染的髮根染色。使用以下的評分指標"-"表示無GUS染色， "+"表示弱GUS染色，"++"表示強GUS染色，"-/+"表示存在約25%的測 試林系在<25%被觀察的根組織中具有一定的維管GUS染色。
圖8:在實施例7中公開的大豆髮根測定中，雙元載體pAW280、 RTJ119和RTJ120的P-葡糖醛酸糖苷酶表達模式。SCN接種後12天，對 大豆胞嚢線蟲感染的髮根和對照未感染的髮根染色。使用以下的評分指標 "-"表示無GUS染色，"+"表示弱GUS染色，"++"表示強GUS染色，"-/+" 表示存在約25%的測試林系在<25%被觀察的根組織中具有一定的維管 GUS染色。
圖9:用於克隆啟動子多核苷酸的引物。
優選實施方案的詳述
本發明可以通過參考以下詳細描述的本發明優選實施方案及其中所包 含實施例而更容易地理解。除非另外il明，本文中所用術語將根據相關領 域技術人員的習慣用法加以理解。除了下文提供的術語定義外，分子生物 學中常用術語的定義也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics: classical and molecular,第五版，Berlin: Springer-Verlag; 和在Current protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等編者，Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.與John Wiley & Sons, Inc. (1998附錄) 中找到。
應當理解如本說明書及在權利要求
書中所用，"一種(a)"或"一個(an)" 可以意指一個或多個，這取決於該冠詞所用的上下文。因此，對"一種細胞" 的稱謂可以可以意指可以使用至少一種細胞。應當理解本發明不限於具體 核酸、具體細胞類型、具體宿主細胞、具體條件或具體方法等，因為這些 當然可以變化，並且其中的眾多4務改與變化對於本領域技術人員是顯而易 見的。還應當理解本文中使用的術語僅僅旨在描述具體實施方案並且不意 圖是限制性的。在本申請通篇範圍內，參考了多種出版物。全部這些出版物及這些出 版物中引用的那些參考文獻的公開內容通過引用方式完整地併入本申請，
旨在更充分地描述本發明涉及的本領域狀態。用於克隆、DNA分離、擴增 及純化，用於涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切酶等酶反應的 標準技術以及多種分離技術是本領域技術人員已知並且通常使用的那些技 術。眾多標準技術在Sambrook和Russell， 2001 Molecular Cloning,第三 版，Cold Spring Harbor, Plain view, New York; Sambrook等,1989 Molecular Cloning,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis等,1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu(編輯)1993 Meth. Enzymol. 218，第 I部分；Wu(編輯)1979 Meth Enzymol. 68; Wu等，(編輯)1983 Meth. Enzymol. 100和101; Grossman和Moldave(編輯)1980 Meth. Enzymol. 65; Miller(編輯)1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old和Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif 和 Wensink， 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover(編輯)1985 DNA Cloning第I和II巻，IRL Press, Oxford, UK; Hames和Higgins(編輯)1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK以及Setlow和Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods,第1-4巻,Plenum Press, New York中描述。
提供從其天然環境分離和/或純化的本發明啟動子多核苷酸，它們處於 基本上純的或均勻的形式，或者不含或基本上不含所述物種來源的其他核 酸。如本文中所用的"分離"核酸在通過重組技術產生時也基本上(在分離時) 不含其他細胞材料或培養基，或在化學地合成時基本上不含化學前體。本 發明的啟動子多核苷酸是分離的核酸。當在本文中使用時，術語"分離的" 包括全部這些可能。
術語"約"在本文中用來意指大約、大致、左右或處於......範圍。術語
"約"與數字範圍 一起使用時，它通過擴張邊界 於和低於所述數值而修飾該範圍。通常，術語"約"在本文中用來修飾某數值高於和低於所述值，即
在該數值之上或之下(較高或較低)達10%的偏差。
如本文中所用的術語"啟動子"或啟動子多核苷酸指與目的核苷酸序列
連接時能夠控制該目的核苷酸序列轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子一 般(儘管不必要)位於目的核苷酸的5'(例如上遊)(例如接近結構基因的轉錄 起始位點)，所述目的核苷酸向mRNA轉錄的受所述啟動子的控制，並為 用於啟動轉錄的RNA聚合酶和其他轉錄因子提供特異性結合位點。"組成 型啟動子"指這樣的啟動子，它能夠在植物整個或幾乎整個發育期期間於全 部或幾乎全部植物組織中表達該啟動子控制的可讀框或調節元件。"調節型 啟動子"指不以組成型方式而以時間和/或空間方式指導基因表達的啟動 子，並且包括組織特異性啟動子和誘導型啟動子。不同啟動子可以指導基
境條件下表達。"組織特異性啟動子，，指不在全部植物細胞中表達而僅在特 定器官(如根或種子)、特定組織(如胚或子葉)內的一個或多個細胞類型或特 定細胞類型(如葉薄壁組織或種子貯藏細胞)中表達的調節型啟動子。"誘導 型啟動子"指可以在一個或多個細胞類型中通過外部刺激如化學、光、激素、 脅迫或病原體開啟的那些調節型啟動子。
本文中使用的術語"線蟲抗性，，表示植物避免被線蟲感染、殺死線蟲 或阻礙、減少或終止線蟲發育、生長或繁殖的能力。這可通過主動過程(例 如通過產生對線蟲有害的物質)或被動過程(例如通過減少給線蟲的養分 或抑制由線蟲誘導的結構如合胞體或巨細胞的發育)實現。植物的線蟲抗 性水平可以以多種方式測定，例如通過計數在感染後能夠在植物上建立寄 生的線蟲，或通過測量感染後多個時間存在的線蟲發育階段，或通過測量 雄性和雌性線蟲的比例或產生的線蟲卵或胞嚢的數量。
術語"序列同 一性"或"同 一性"在兩個多核苷酸序列或多肽序列環境下 指這兩個序列中的這些位置，其中當所述序列在指定比較窗口範圍(例如全 局比對中的整個序列或在局部比對中的相似性區域)內為最大對應進行比 對時，相同的符號對歸集在一起。當序列同一性百分數用來指多肽時，可認識到的是不同 一的殘基位置經常因保守性胺基酸置換而不同，其中氨基 酸殘基被替換為具有相似化學屬性(例如電荷或疏水性)的其他胺基酸殘基 並且因此沒有改變分子的功能屬性。當序列因保守性置換而不同時，序列 同一性百分數可以向上調整以針對所述置換的保守性本質進行修正。將因 此類保守性置換而不同的序列稱為具有"序列相似性"或"相似性"。用於進 行這種調整的方法是本領域技術人員熟知的。 一般，這種方法包括將保守 性置換判定為部分匹配而非錯配，因而增加序列相似性的百分數。
如本文中所用，"序列同一性的百分數"或"序列同一性百分數"指通過 如此方式確定的值，即首先在全局或局部比較窗口中的兩個最佳比對序列 中在每個組成位置處註明相同的核酸鹼基或胺基酸殘基是否在這兩個序列 中出現，若出現，指定為匹配，或若不出現，則指定為不匹配。由於所述 比對通過優化匹配鹼基數目而建立，與此同時允許在任一位置處的錯配以
及允許引入任一大小的空位或空白區域，如此提高所述比對的顯著性A^ 量，因而這種計算確定了匹配條件存在的位置總數，並且隨後將這個數字 除以比較窗口內的位置總數，並且最後將結果乘以ioo以產生序列同一性 百分數。可以使用相同原理對蛋白質序列計算"序列相似性百分數"，其中 將保守性置換計算為部分不匹配而非完全不匹配。因此，例如，在給予相 同胺基酸評分i並且給予非保守性置換評分o的情況下，給予保守性置換 (M之間的評分。對保守性置換的評分可以從本領域已知的胺基酸矩陣例如
Blosum或PAM矩陣中獲得。
用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。可以使用數學算法實現兩 個序列之間同一性百分數或相似性百分數(對於蛋白質)的確定。此類數學 算法的優選、非限制性實例是Myers和Miller算法(Bioinformatics, 4(1):11-17， 1988)、 Needleman-Wunsch全局比對法(J. Mol. Biol" 48(3):443-53， 1970) 、 Smith-Waterman局部比對法(J. Mol. Biol" 147:195-197， 1981)、 Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS， 85(8): 2444 2448， 1988)、 Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J. Mol. Biol" 215(3):403-410， 19卯；PNAS， 90:5873-5877,1993)。可以使用這些數學算法的計算機實現以比W列來確定序列同 一性或鑑定同源物。
與美國專利申請系列號60/899,739同時提交的共同轉讓的美國專利申 請系列號60/899,739公開並要求保護稱作GM50657480的大豆cDNA，其 在本文中由SEQ ID NOs:2和3表示。如實施例2中所示，在SCN誘導的 合胞體中，GM50657480的表達4皮上調。如圖6中所示，GM50657480的 胺基酸序列(SEQ ID NO:3)顯示與At5gl2170的胺基酸序列(SEQ ID NO:4) 的顯著比對，指出兩種蛋白質是直向同源物。如實施例4中所證明的，當 與GUS報告基因處於有效連接中時，本發明的擬南芥啟動子多核苷酸 (SEQ ID NO: 1 )在被線蟲感染的大豆髮根中上調。
因此，本發明涉及具有SEQIDNO:l中公開序列的分離的啟動子多核 苷酸，或從具有SEQIDNO:l中公開序列的分離的啟動子多核苷酸得到的 最小啟動子多核苷酸片段，所述片段能夠驅動第二多核苷酸的根特異和/ 或線蟲誘導的表達。本文中使用術語"等同片段"或"最小啟動子多核苷 酸片段"是指能夠介導第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導表達的啟動子 多核苷酸片段。可通過去除非必需功能元件而不缺失關鍵的功能元件例如 關鍵的轉錄因子結合位點，獲得本發明的啟動子多核苷酸的等同片段。所 述啟動子多核苷酸序列縮小至必需的功能元件可以在體外通過試錯缺失突 變或在計算機上利用啟動子元件搜索途徑實現。對啟動子活性必需的區域 常常顯示為成簇的某些已知啟動子元件。此類分析可以使用可獲得的計算 機算法如PLACE("植物順式作用調節性DNA元件"；Higo 1999)、 BIOBASE 資料庫 "Transfac"(Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig; Wingender 2001)或資料庫PIantCARE(Lescot 2002)進行。 特別優選的是通過缺失編碼mRNA 5，-非翻譯區從而僅提供(未轉錄的) 啟動子多核苷酸區域而獲得的啟動子多核苷酸的等同片段。可容易地通過 本領域已知的方法(例如5，-RACE分析)確定5，-非翻譯區。因此，本發 明的一些啟動子多核苷酸是其他啟動子多核苷酸的等同片段。本發明特異 的最小啟動子多核苷酸片段包括但不僅限於，包含SEQIDNO:l中公開序 列的核苷酸476到1476的多核苷酸，下述多核苷酸，其包含具有SEQIDNO:l中^^開序列的啟動子多核普酸的至少50個連續核苷酸、或至少100 個連續核苷酸、或至少200個連續核苷酸、或至少300個連續核苷酸、或 至少400個連續核苷酸、或至少500個連續核苷酸的片段。
或者，本發明的啟動子多核苷酸包含分離的多核苷酸，所述分離的多 核苷酸在嚴格條件下與具有SEQ ID NO:l中公開序列的啟動子多核苷酸 雜交，或與從具有SEQIDNO:l中公開序列的啟動子多核苷酸獲得的最小 啟動子多核苷酸片段雜交。本文使用的嚴格雜交條件是公知的，包括例如 400 mMNaCl、 40 mM PIPES pH 6.4、 1 mM EDTA、 60。C雜交12-16小 時；然後在約65。C下在0.1。/。SDS、 0.1% SSC中洗滌約15-60分鐘。
本發明還涉及下述分離的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:l公開序列的核苷酸476到1476的多核苷酸雜交，其中啟動子多核苷 酸能夠驅動第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導的表達，並且在植物根中 由植物寄生線蟲感染誘導。本發明的啟動子多核苷酸還包含分離的啟動子 多核苷酸，所述啟動子多核苷酸與具有SEQIDNO;l中公開序列的多核苷 酸或從SEQ ID NO;l中公開序列獲得的最小啟動子多核苷酸片段至少 50-60%、或至少60-70%、或至少70-80%、 80-85%、 85%、 68%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、或至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一，所述啟動子多核苷酸能夠驅動第二多核苷酸的根特異和/ 或線蟲誘導的表達。多核苷酸序列比較的長度為至少50個連續的核苷酸， 或至少100個連續的核苷酸，或至少200個連續的核普酸，或至少500個 連續的核苷酸，長達序列的全長。在待比較的兩條序列不具有相同長度的 情況下，術語"序列的全長"是指較短序列的全長。
本文7^開的方法可用於分離SEQ ID NO:l的另外的最小啟動子多核 苷酸片段，所述片段能夠介導第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導的表 達。本發明還涉及本發明啟動子多核苷酸的"變體"或"衍生物"。特異 啟動子多核苷酸序列及其特異元件的衍生物可包括但不僅限於，序列的缺 失、單點或多點突變、具體限制性酶切位點的改變、功能元件的添加，或 分子修飾的其他手段。該修飾可以增強或不增強，或者可以改變或不改變所述啟動子多核苷酸的轉錄調節活性。例如，本領域技術人員可限定啟動 子多核苷酸內的功能元件例如啟動子元件(例如但不僅限於轉錄因子結合 位點)，並缺失任何非必需的功能元件。可修飾或組合功能元件，以針對 任何具體的應用提高本發明啟動子多核苷酸的利用或表達水平。
如上所述，也可以隨機製備然後測定本發明啟動子多核苷酸的缺失突 變體。根據該策略製備了一系列構建體，每個構建體含有啟動子多核苷酸 的不同部分(亞克隆)，然後篩選這些構建體的活性。篩選活性的一種合 適手段是將含有啟動子多核苷酸片段的啟動子多核苷酸構建體與可選擇或 可篩選標記物連接，並僅分離表達標記物基因的細胞。藉此鑑定了大量不 同的、經缺失的下述啟動子多核苷酸構建體，其仍然保留期望的活性或甚 至具有增強的活性。因此通過比較選擇的構建體鑑定了活性必需的最小啟 動子多核苷酸片段。該啟動子多核苷酸片段隨後可用於構建表達第二多核 普酸的載體，所述第二多核苷酸例如編碼外源基因。
在多核苷酸(例如啟動子多核苷酸)中誘變或產生缺失的方法是本領
域技術人員熟知的並且在例如通過引用方式完整併入本文的US 6,583,338 中披露。調節性序列變體的一個實例是通過從較大啟動子多核苷酸中的一 個缺失或多個缺失所形成的啟動子多核苷酸。有時候可以缺失啟動子多核 苷酸的5'部分直至接近轉錄起始位點附近的TATA盒而不消除啟動子活 性，如Zhu等(1995) The Plant Cell 7:1681-1689描述。除去部分多核苷酸
單向嵌套缺失。用於此目的的商業試劑盒以商標名Exo-Size.TM.(New England Biolabs， Beverly, Mass.)出售。生物活性變體也包括例如具有一個 或多個核苷酸置換、缺失或插入的本發明天然啟動子多核苷酸。
衍生物和變體也包括來自其他物種(如但不限於細菌、真菌和植物)的 同源物、旁系同源物和直向同源物。"同源物"是本領域中用來表示與參考 序列具有高度序列相關性的多核苷酸或多肽序列的遺傳學術語。這種相關 性可以如前所述通過確定兩個序列之間同 一性和/或相似性的程度進行量 化。屬於這個遺傳學術語的是術語"直向同源物"和"旁系同源物"。"旁系同源物"指在相同物種內功能上相似的多核苷酸或多肽。"直向同源物"指作為 另 一個物種中與所述多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。直向同 源基因優選地意指編碼直向同源蛋白質的基因。更具體地，術語"直向同源 物"指從一個物種中獲得的多肽或蛋白質，其是來自不同物種的多肽或蛋白 質的功能性對應物。直向同源物之間的序列差異是物種形成的結果。
本文使用的術語"等位基因變體，，是指含有多態性的多核苷酸，所述 多態性導致多核苷酸的核苷酸中的改變並存在於自然種群(例如植物物種 或變種)中。術語"等位基因變體"還表示含有多態性的啟動子多核苷酸，
群中。這類天然等位基因變體通常可導致多核苷酸中1-5%的差異，或編碼 的蛋白質中1 -5%的差異。可通過對大量不同植物中的目的多核苷酸進行測 序來鑑定等位基因變體，可通過使用例如雜交探針鑑定這些植物中相同的 啟動子多核苷酸、基因或遺傳基因座完成所述測序。啟動子多核苷酸中任 何和所有下述這類核酸變異旨在屬於本發明的範圍，所述核酸變異由天然 等位基因變異引起並且不改變啟動子多核苷酸的功能活性。基因的等位基 因變體可被用於克隆本發明啟動子多核苷酸的變體。藉此獲得的本發明啟 動子多核苷酸的變體可與SEQ ID NO: 1的序列或與SEQ ID NO: 1的核苷 酸476到1476的序列至少70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一，並與編碼下述多肽的基因天然相連，所述多肽與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所述序列至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%同 一。天然相連表示兩條多核苷酸是(例如植物基因組中)自然存在的連續 多核苷酸的部分，其中連接兩條序列的多核苷酸片段不長於3000bp、 2000 bp、 1000 bp、 500 bp、 200 bp、 100 bp或50 bp。優選地，本發明的啟動 子多核苷酸的變體在編碼下述多肽的直向同源基因上遊區域中，所述多肽 與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所述序列有至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一性。
根據本發明，本發明的分離的啟動子多核苷酸可處於與第二多核苷酸 的有效連接中，用於植物中第二多核苷酸的根特異和/或線蟲誘導的表達，從而改變該植物的表型。本文使用的術語"有效連接"、"有效地連接" 和"連接"是可以互換的，並且表示單個多核苷酸片段上啟動子和第二多 核苷酸的下述方式的功能連接，所述方式使得第二多核苷酸的轉錄由該啟 動子起始和介導。通常，有效連接的核酸是連續的。
任何第二多核苷酸可處於與本發明啟動子多核苷酸的有效連接中，以 達成第二多核苷酸的根特異或病原體誘導的表達。第二多核苷酸包括例如 可讀框、可讀框的部分、編碼融合蛋白的多核苷酸、反義序列、編碼雙鏈
RNA序列的序列、轉基因等等。第二多核苷酸可編碼昆蟲抗性基因，細菌 疾病抗性基因，真菌疾病抗性基因，病毒疾病抗性基因，線蟲疾病抗性基 因，除草劑抗性基因，影響穀粒組成或品質的基因，養分利用基因，真菌 毒素減少基因，雄性不育基因，可選擇標記物基因，可篩選標記物基因， 陰性可選擇標記物基因，陽性可選擇標記物基因，影響植物農學特徵(如 產率)的基因，環境脅迫抗性基因(例如賦予對乾旱、熱、寒冷、冷凍、 過溼、鹽脅迫或氧化脅迫的抗性或耐性的基因)，改善澱粉特性或數量、 油數量和品質、胺基酸或蛋白質組成的基因等等。
優選地，笫二多核苷酸編碼RNA，優選地編碼雙鏈RNA (dsRNA)或 反義RNA、 siRNA、 miRNA或其前體等等。
優選地，第二多核苷酸編碼RNA，優選地編碼雙鏈RNA (dsRNA)， 其總體或部分與下述植物基因或植物啟動子基本同一或同源，所述植物基 因或植物啟動子是線蟲進食位點的形成和維持所必需的，例如通過破壞或 妨礙合胞體或巨細胞的發育或完整性。在一個實施方案中，第二多核香酸 編碼dsRNA、反義RNA、 siRNA、 miRNA，其與植物啟動子互補並導致 植物啟動子的下調。或者第二多核苷酸可編碼破壞或妨礙植物寄生線蟲生 長和/或生殖的物質、賦予或改善對植物寄生線蟲的植物抗性的物質，或對 植物寄生線蟲有毒性的物質，例如蛋白質、dsRNA、反義RNA、 siRNA、 miRNA或其前體，從而減少作物破壞。根據本發明可使用編碼下述物質的 任何多核苷酸破壞植物寄生線蟲生長和/或生殖的物質、賦予或改善對植 物寄生線蟲的植物抗性的物質，或對植物寄生線蟲有毒性的物質。例如，第二多核苷酸可編碼下述雙鏈RNA，其與線蟲代謝、存活、變態或生殖必 需的寄生植物線蟲靶基因基本同一。或者，第二多核苷酸可編碼下述雙鏈 RNA，其與植物根的進食位點中線蟲存活、生長或生育力必需的植物基因 基本同一。
在本文中使用時，考慮比較RNA和DNA序列時尿嘧咬代替胸腺嘧，定， 術語"基本同一"和"對應於"表示dsRNA —條鏈的核苷酸序列與靶基 因的20或更多個連續核苷酸至少約80%-90%同一，更優選地，與耙基因 的20或更多個連續核苷酸至少約卯-95%同一，最優選地，與靶基因的20 或更多個連續核苷酸至少約95-99%同一或完全同一。示範性的植物寄生線 蟲靶基因公開於例如共同轉讓的共同未決的美國專利申請公開號
No.2005/188438中，其併入本文作為參考。
或者，為了進行線蟲控制，與本發明的啟動子多核苷酸處於有效連接 中的第二多核苷酸可編碼可讀框，優選地編碼蛋白質編碼基因。例如，第 二多核苷酸可編碼來自任何物種的任何可讀框。非限制性的例子是來自大 豆屬、擬南芥屬、苜蓿屬(AfW/cflgo)、埃希氏菌屬(Esc/^Wc/^tf)、芽孢桿菌 屬CS"c"7/"s)、才艮瘤菌屬(/^/z。6f7i附)或酵母屬(5Vicc/^n7附j;c"e"淨勿種。侈寸^(口， 第二核酸可編碼昆蟲抗性基因，細菌疾病抗性基因，真菌疾病抗性基因， 病毒疾病抗性基因，線蟲疾病抗性基因，除草劑抗性基因，影響穀粒組成 或品質的基因，養分利用基因，真菌毒素減少基因，雄性不育基因，可選 擇標記物基因，可篩選標記物基因，陰性可選擇標記物基因，陽性可選擇 標記物基因，影響植物農學特徵(如產率)的基因，環境脅迫抗性基因(例 如賦予對乾旱、熱、寒冷、冷凍、過溼、鹽脅迫或氧化脅迫的抗性或耐性 的基因)，改善澱粉特性或數量、油數量和品質、胺基酸或蛋白質組成的 基因等等。在一個實施方案中，可讀框編碼下述蛋白質，所述蛋白質在進 食位點中過表達時導致提高的線蟲抗性。線蟲抗性的分子機制可大幅變化， 取決於具體的策略。例如，可通過過表達對線蟲有毒性的基因來達成提高 的線蟲抗性，所述基因破壞線蟲進食位點的形成和/或維持，修飾對線蟲的 養分的可獲得性或遞送，提高植物防禦應答，或以任何方式對線蟲生殖有害。在另一實施方案中，基因編碼對線蟲有毒的蛋白質。例如，編碼微生 物毒素或其片段的多核苷酸，來自昆蟲的毒素或其片段例如美國專利號
5,457,178; 5,695,954; 5,763,568; 5,959,182中所述的那些等等適用於本發明 的該實施方案。
作物植物和相應的致病線蟲在《美國植物疾病索引》(美國農業部手冊 第165號，1960);《北美洲植物寄生線蟲物種分布》(線蟲學家學會，1985)和 《美國植物及植物產品上的真菌》(美國植物病理學會，1989)中列出。例 如，本發明所針對的植物寄生線蟲包括而不限於，胞嚢線蟲和根癌線蟲。 本發明所靶向的具體植物寄生線蟲包括而不限於大豆異皮線蟲、甜菜異皮 線蟲(Heterodera schachtii)、燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae)、水稻異皮 線蟲(Heterodera oryzae)、木豆異皮線蟲(Heterodera cajani)、車軸草異皮 線蟲(Heterodera trifolii)、馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)、馬鈴薯金線 蟲(G. rostochiensis)或菸草球異皮線蟲(Globodera tabacum)、南方根結線 蟲(Meloidogyne incognita)、花生才艮結線蟲(M. arenaria)、北方才艮結線蟲(M. hapla)、爪哇根結線蟲(M. javanica)、納西根結線蟲(M. naasi)、短小根結 線蟲(M.exigua)、起絨草莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、窄小莖線蟲 (Ditylenchus angustus)、相似穿孔線蟲(Radopholus simms)、柑橘穿孔線蟲 (Radopholus citrophilus)、多帶蟲累i走線蟲(Helicotylenchus multicinctus)、咖 啡短體線蟲(Pratylenchus coffeae)、 最短尾短體線蟲(Pratylenchus brachyurus)、 傷殘短體線蟲(Pratylenchus vulnus)、 彎曲短體線蟲 (Paratylenchus curvitatus)、玉米短體線蟲(Paratylenchus zeae)、 腎形小盤 3走線蟲(Rotylenchulus reniformis)、 4艮蓮花才以毛刺線蟲(Paratrichodorus anemones)、 較小擬毛刺線蟲(Paratrichodorus minor)、 Paratrichodorus christid、 麥津立鰻線蟲(Anguina tritici)、 Bidera avenae、 小麥衝艮癭線蟲 (Subanguina radicicola)、 塞氏紐帶線蟲(Hoplolaimus seinhorsti)、哥倫比 亞紐帶線蟲(Hoplolaimus Columbus)、 帽狀紐帶線蟲(Hoplolaimus galeatus)、 半穿刺小墊刃線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、 花生鞘線蟲 (Hemicycliophora arenaria)、 椰子細杆刃線蟲(Rhadinaphelenchuscocophilus)、 7K平對刺線蟲(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺線蟲 (Trichodorus primitivus)、異常珍珠線蟲(Nacobbus aberrans)、 貝氏滑刃 線蟲(Aphelenchoides besseyi)、 卡納亞才以鞘'線蟲(Hemicriconemoides kanayaensis)、克萊頓矮^f匕線蟲(Tylenchorhynchus claytoni)、 美洲劍線蟲 (Xiphinema americanum)、 瘥疫壞死線蟲(Cacopaurus pestis)等。
在一個實施方案中，被靶向的線蟲屬於誘導巨細胞或合胞體細胞的線 蟲科。誘導巨細胞或合胞體細胞的線蟲屬於長針線蟲科(Longidoridae)、毛 刺線蟲科(Trichodoridae)、異皮線蟲科(Heterodidae)、根結線蟲科 (Meloidogynidae)、 短體線蟲科(Pratylenchidae)或小墊刃線蟲科 (Tylenchulidae)。尤其是異皮線蟲科和根結線蟲科。
因此，在另一個實施方案中，目標線蟲屬於選自由偽根瘤線蟲屬 (Naccobus)、 仙人掌胞嚢線蟲屬(Cactodera)、 長形胞囊線蟲屬 (Dolichodera)、球異皮線蟲屬(Globodera)、異皮線蟲屬(Heterodera)、 Punctodera 、長4十線蟲線蟲屬(Longidorus)或才艮結線蟲屬(Meloidogyne)組 成的組中的一個或多個屬。在優選的實施方案中，目標線蟲屬於選自由偽 根瘤線蟲屬(Naccobus)、仙人掌胞嚢線蟲屬、長形胞嚢線蟲屬、球異皮線 蟲屬、異皮線蟲屬、Punctodera或根結線蟲屬組成的組中的一個或多個屬。 在更優選的實施方案中，目標線蟲屬於選自由球異皮線蟲屬、異皮線蟲屬 或根結線蟲屬組成的組中的一個或多個屬。在甚至更優選的實施方案，目 的線蟲屬於選自由球異皮線蟲屬或異皮線蟲屬組成的組中的一個或兩個 屬。在另一個實施方案中，目標線蟲屬於根結線蟲屬。
當靶向的線蟲是球形胞嚢線蟲屬(G7o^&m)時，靶向的物種可選自 蕃草屬球異皮線蟲(G". flc/^7/e"e)、蒿球異皮線蟲(( . a,tew/w'ffC 、 G".
(7.脂7/e/o/仏蘋果球異皮線蟲(G*.附fl//,、馬鈴 薯白線蟲((7./m/"由)、馬鈴薯金線蟲(G. m"oc/^附的、菸草異皮線蟲(G. ra6acM附)和G. Wrg/m'"e。在一個優選的實施方案中，革巴向的球形胞嚢線蟲 屬(G7M^/em)線蟲包括至少物種馬鈴薯白線蟲(G". /m//^i)、菸草異皮線蟲 (G". r"6flcw附)或馬鈴薯金線蟲((7. mstoc/^'e"s/"之一 。當乾向的線蟲是胞嚢線蟲屬(77etefw/c")時，物種可選自燕麥異皮線蟲(H. avenae)、胡蘿蔔異皮 線蟲(H. carotae)、鷹嘴豆異皮線蟲(H. ciceri)、十字花科異皮線蟲(H. cruciferae)、 H. delvii、褐藻異皮線蟲(H. dachista)、菲力普異皮線蟲(H. filipjevi)、 H. gambiensis、大豆異皮線蟲、豌豆異皮線蟲(H. goettingiana)、 蕎麥異皮線蟲(H. gradimi)、蛇麻異皮線蟲(H. humuli)、大麥異皮線蟲(H. hordecalis)、小麥異皮線蟲(H. latipons)、燕麥異皮線蟲(H. major)、苜蓿 異皮線蟲(H. medicaginis)、水稻異皮線蟲(H. oryzicola)、巴基斯坦異皮線 蟲(H. pakistanensis)、酸模異皮線蟲(H. rosii)、甘蔗異皮線蟲(H. sacchari)、 甜菜異皮線蟲、高粱異皮線蟲(H. sorghi)、車軸草異皮線蟲、蕁麻異皮線 蟲(H. urticae)、豇豆異皮線蟲(H. vigni)和玉米異皮線蟲(H. zeae)。在一個 優選的實施方案中，靶向的胞嚢線蟲屬線蟲包括至少物種大豆異皮線蟲、 燕麥異皮線蟲、木豆異皮線蟲、豌豆異皮線蟲、車軸草異皮線蟲、玉米異 皮線蟲或甜菜異皮線蟲之一。在一個更優選的實施方案中，靶向的線蟲包 括至少物種大豆異皮線蟲或甜菜異皮線蟲之一。在一個最優選的實施方案 中，靶向的線蟲是物種大豆異皮線蟲。
當靶向的線蟲是根結線蟲屬(Afe/wVfesj"e)時，耙向的線蟲可選自高粱 才艮結線蟲(M. acronea)、 M. arabica、花生才艮結線蟲(M. arenaria)、甘藍才艮 結線蟲(M. artiellia )、短尾根結線蟲(M. brevicauda)、山茶根結線蟲(M. camelliae)、哥倫比亞才艮結線蟲(M. chitwoodi)、咖啡才艮結線蟲(M. cofeicola)、 短小根結線蟲(M. esigua)、禾草根結線蟲(M. graminicola)、北方根結線蟲 (M. hapla)、南方根結線蟲、印度根結線蟲(M. indica)、海濱根結線蟲(M. inornata)、爪哇根結線蟲(M. javanica)、林氏根結線蟲(M. lini)、蘋果根結 線蟲(M. mali)、小頭根結線蟲(M. microcephala)、小突根結線蟲(M. microtyla)、納西根結線蟲(M. naasi)、薩拉斯根結線蟲(M. salasi)和泰晤士 根結線蟲(M.thamesi)。在一個優選的實施方案中，靼向的線蟲包括至少爪 哇根結線蟲、南方根結線蟲、北方根結線蟲、花生根結線蟲或哥倫比亞根 結線蟲。
可用本發明的啟動子多核苷酸轉化任何植物物種。例如，可用含本發明啟動子多核苷酸的核酸構建體轉化的植物包括但不僅限於來自以下屬的
植物，所述屬選自苜蓿屬(Medicago)、番茄屬(Lycopersicon)、芸苔屬 (Brassica)、香瓜屬(Cucumis)、痴屬(Solanum)、核杉^屬(Juglans)、衝帛屬 (Gossypium)、蘋果屬(Malus)、葡萄屬(Vitis)、金魚草屬(Antirrhinum)、 楊屬(Populus)、草莓屬(Fragaria)、擬南芥屬、雲杉屬(Picea)、辣椒屬 (Capsicum)、 藜屬(Chenopodium)、 菊屬(Dendranthema)、 牽牛屬 (Pharbitis)、木厶屬(Pinus)、豌豆屬(Pisum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍屬(Zea)、 小麥屬(Triticum)、小黑麥屬(Triticale)、黑麥屬(Secale)、黑麥草屬(Lolium)、 大麥屬(Hordeum)、大豆屬(Glycine)、黃杉屬(Pseudotsuga)、伽藍菜屬 (Kalanchoe)、甜菜屬(Beta)、向日葵屬(Helianthus)、菸草屬(Nicotiaim)、 南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬、 驢食草屬(Onobrychis)、車軸草屬(trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆 屬(Vigna)、橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬 (Manihot)、胡聲巴屬(Daucus)、蘿蔔屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛 茄屬(Atropa)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、菸草屬、碧冬 茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、 Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、萵 苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬、萱草 屬(Heterocallis)、 水仙屬(Nemesis)、 天竺葵屬(Pelargonium)、 稷屬 (Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、 毛蒗屬(Ranunculus)、千裡光屬 (Senecio)、 喇叭舌屬(Salpiglossis)、藍英花屬(Browaalia)、 菜豆屬 (Phaseolus)、 燕麥屬(Avena)和蔥屬(Alli腿)。
枝、科、屬或植物種中。可以從一個植物物種中分離的所述啟動子多核苷 酸的衍生物和變體優選地用在這樣的植物中，其中所述的植物與用於分離 所述啟動子多核苷酸的衍生物和變體的植物屬於相同的進化枝、科、屬或 種。因此，在一個實施方案中，所述植物是單子葉植物，優選是禾本科 (Poaceae)、 芭蕉科(Musaceae)、 百合科(Liliaceae)或鳳梨科(Bromeliaceae) 植物，優選是禾本科植物。因此，在又一個實施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍屬、小麥屬、稻屬、大麥屬、黑麥屬、燕麥屬、甘蔗屬(Saccharum)、 高粱屬(Sorghum)、狼尾草屬、狗尾草屬(Setaria)、稷屬、蟋蟀草屬 (EIeusine)、芒屬(Miscanthus)、短柄草屬(Brachypodhim)、羊茅屬(Festuca) 或黑麥草屬植物。當植物是玉蜀黍屬(Zefl)時，優選的物種是玉米(Z. w"w)。 當植物是小麥屬(7W"'CM附)時，優選的物種是普通小麥(r. aeWvw附)、斯佩 爾特小麥(r.s戸/toe)或硬粒小麥(r. d r"w)。當植物是稻屬(0^;w)時，優選 的物種是稻(O. MftV")。當植物是大麥屬(/^^Y/eM/W)時，優選的物種是大麥 (7/.vw/g re)。當植物是黑麥屬(&c"/e)時，優選的物種是黑麥(51. ""fl/e)。 當植物是燕麥屬(^vwfl)時，優選的物種是燕麥(A:ya"vfl)。當植物是甘蔗屬 (SflCC/m/WM)時，優選的物種是甘蔗(義^^",'"w"w)。當植物是高梁屬 (^SW^A"/M)時，優選的物種是蜀黍(51. v"/g"")、兩色蜀黍(51. 6/co/w)或蘇丹 草(S. sM^me"^)。當植物是狼尾草屬(屍e/m/se似附)時，優選的物種是御谷(屍. g/flwc /w)。當植物是狗尾草屬(&似〃'《)時，優選的物種是穀子(51. /似/Zca)。 當植物是黍屬(屍"w/cw/M)時，優選的物種是野生稷(屍.抓'//"""附)或柳枝稷(屍. v/rgfl《"附)。當4直物是糝屬(E7e"w'"e)時，優選的物種是糝子(E cw"cflwff)。 當植物是芒屬(7kfecfl/i^附)時，優選的物種是芒(Af. w'we附/s)。當植物是短 柄草屬OBmd^;/wrf/"w)時，優選的物種是二穂短柄草(及《fc似d^wi)。當植 物是羊茅屬(Fe""c")時，優選的物種是葦狀羊茅(F. arM"^mi/7W、紫羊茅 (F. r"Am)或草甸羊茅(F./7mte"^)。當植物是黑麥草屬(Z^/,'"附)時，優選的 物種是多年生黑麥草(丄./;e""we)或多花黑麥草(丄.ww似yZof"附)。或者植物 可以是小黑麥屬(7Wric0seca/e)。
或者在一個實施方案中，植物是雙子葉植物，優選地是豆科 (/^flcefle)、 痴科(So/fl冊ce"e)、 芸繭科(i mw/caceae)、 藜科 (CTiewo/^/aceae)、 菊科、 錦蔡科(Affl/mce"e)、 亞麻科 (丄,Vi"mie)、 大戟科(￡""/ /i0/^'flmjre)、 旋花科(Cbww/v /"mie)、 蕃蔽科 (/ o5Yice"e)、葫,科(CwcM由',amie)、山茶科(rAeacefle)、萏草科(J w6Zamie)、 梧桐科(5紐""//7|""^)或柑橘(0附)科的植物。在一個實施方案中，植物是 豆考牛(Ffl6"ce"e)、 痴科(Xo/flWflceae)或芸苫科CBm5"5iaicefle)的才直物。因jt匕，在一個實施方案中，植物是豆科(屍"6fl"^)，優選地是大豆屬(G(v"Vie)、豌 豆屬(屍&"附)、落花生屬(Jnic/^)、鷹嘴豆屬(C/cw)、蠶豆屬(KZd")、菜豆 屬(/^as^o/ws1)、羽扇豆屬(1—ww)、苜蓿屬(A/eWcflgo)或兵豆屬(Lens)。優 選的豆科(F"6""fle)物種是截形苜蓿(7kf. ^wiai似/tf)、紫苜蓿(Af. sW/v")、大 豆(G".附"jc)、婉豆(屍.s",/vw附)、花生(A /ij^^1)、鷹嘴豆(C flwW/"w附)、 蠶豆K /"6fl)、 菜豆(屍.y"/ga屍/s)、 白羽扇豆(丄w/;/"附"幼"5)、 黃羽扇豆 (X"/ /鼎s /她ms1)、 狹葉羽扇豆(Lupimis angustifolius)或兵豆 (^//""r&)。更優選的是大豆(G.附紅)和花生(A/13;/70ge")、紫苜蓿(iV/.sariva) 物種。最優選的是大豆(G.附ax)。當植物是茄科(So/tfmic^^)時，優選的屬 是痴屬(5W做m附)、番痴屬(Z^co/ 、 菸草屬(7V/cWa聽)或辣椒屬 (Cfl/w/cw附)。優選的痴科物種是馬鈴薯S".似Ae,05n附)、番痴(丄.e5xr"/e"似柳)、 菸草(7V: to6a"w附)或黃燈籠辣椒(C W/"e"w)。更優選的是馬鈴薯(X ,w^^w"附)。因此，在一個實施方案中，植物是十字花科(5mw/cac^ie)， ^尤選的是4以南芥屬(^/Yi6,V/o/^is)、 芸莒(5r"sw'ca)或蘿蔔屬(及a/;/i"""s)。 優 選的十字花科(i m^Zcfl"M)物種是擬南芥(A 、歐洲油菜(5.
m"/7附)、甘藍^6. 0/emcea)、芥菜C6.y朋cefl)或充青C6. r"戸)物種。更優選的
是歐洲油菜(及fl"/7附)物種。當植物是藜科(C^wo/w力'fl"fle)時，優選的屬
是甜菜屬Ce^")，優選的物種是甜菜(B. vM/g"Ws)。當植物是菊科(/4stemce"e) 時，優選的屬是向日葵屬(7^//朋溈""，優選的物種是向日葵(/T.朋fi""s)。 當植物是錦葵科(M"/v"ce"e)時，優選的屬是棉屬(Gm^/^"附)或秋葵屬 (J^/附mcA附)。當屬是棉屬((7仍5"j^"w)時，優選的物種是陸地棉(G. /^>^|似柳)或海島棉((7. ^frA^jfe"")，最優選的物種是陸地棉(G. A/ra"似附)。 秋葵屬(J^/附^c^附)的優選的物種是咖啡黃葵C4. "c"/ew似s)。當植物是亞 麻科(丄/聽"fl"時，優選的屬是亞麻屬(丄/""附)，優選的物種是亞麻(丄.
W5i'似,kS7'附"附)。當植物是大戟科(五m/7Ac6/tfCeffe)時，優選的屬是木薯屬
(Af"w幼W)、麻風樹屬(/fl^ /7")或蓖麻屬(/W"Vi"s)，優選的物種是木薯(Af. cscm/cm似)、麻風樹(/ c"rcfl^或蓖麻co附""/s)。 當才直物是牙走花科 (G wvo/vw/"ce"e)時，優選的屬是番薯屬(/po附e")，優選的物種是/. 6atoto 。當植物是薔薇科(及WflCMe)時，優選的屬是薔薇屬(/^^1)、蘋果屬(Affl/附)、 梨屬(/^T附)、李屬(屍/wi"S)、懸鉤子屬(及"6附)、茶薦子屬(W幼M)、越橘屬
(Fflc"'"/"附)或草莓屬(Fnigw,Vi),優選的物種是雜種荷蘭草莓CFmgfl〃Vi ;c flw"/io^ff)。 當植物是葫,科(Cwcw^/似feM)時，優選的屬是黃瓜屬 (C"(7ww's)、西瓜屬(Ow〃"s)或南瓜屬(C"cwr6/似)，優選的物種是黃瓜 (Ozc'w附/s 5^,/v"51)、 西瓜(C7,w〃fi51 /fl聽f""或西葫聲(C"cwr6/f" p印o)。 當植 物是山茶科(77^flce"e)時，優選的屬是山茶屬(G/附e肌")，優選的物種是茶 (C"附e〃/fl w'"e附/s)。
當植物是萏草科(/ w6/""fl^)時，優選的屬是咖啡屬
(Coj5^")，優選的物種是小果咖啡(c. w"6/c")或中果咖啡(c: c""印/^/yi)。當
植物是梧桐科(Ste/r"/,ViceM)時，優選的屬是可可樹屬(77i 6fwii")，優選 的物種是可可樹(r. MCflo)。當植物是柑橘屬(07r附)時，優選的物種是甜橙 (C s7"ms/51)、梓樣(C /Z附ow)、桔(C rC'cw/"似)、柚(C.附ox/附fl)和村橘物種
的雜種等等。
在另一個實施方案中，在暴露於線蟲刺激的植物根中誘導啟動子多核 苷酸。植物被植物寄生線蟲感染或處於被植物寄生線蟲感染過程中時，可 存在線蟲刺激。介導應答線蟲刺激的表達的啟動子多核苷酸也可以稱作線 蟲誘導型啟動子多核苷酸。涉及本發明的啟動子、啟動子多核苷酸、分離 的核酸或多核苷酸的術語"根優選的表達"表示主要在根組織中、尤其是 在根維管組織中表達。主要在根組織中表達表示，與相同量其他組織(例 如葉、莖或花組織)中產生的mRNA量相比時，特定量的根組織中在本發 明的啟動子多核苷酸控制下產生的mRNA量至少高10倍、50倍、100倍 或200倍。
本發明還涉及包含本發明啟動子多核苷酸的表達盒。該語境中"表達 盒"應當被廣義地理解為包含盒中含有的所有下述序列，所述序列可影響 目的核酸的轉錄和如果適用的話影響其翻譯。除了本發明的啟動子多核苷 酸外，本發明的表達盒還可包含促進啟動子多核苷酸功能的調節元件， 或允許在原核生物和/或真核生物中轉錄和/或翻譯的遺傳元件，和下遊(在 3'-方向中)調節元件，例如轉錄終止序列和多聚腺苷酸化序列。本發明表達盒的多種組件順序並有效地連接在一起。
因此，本發明的表達盒可包含能夠介導根優選和/或線蟲誘導的表達的 啟動子，所述啟動子包含啟動子多核苷酸，其中所述啟動子多核苷酸選自
以下多核苷酸a)具有SEQ ID NO:l中公開的序列的多核苷酸；b)包含 下述多核苷酸的核苷酸476到1476的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:l中公開的序列；c)與a)或b)的多核苷酸具有至少70%同一性的多核 苷酸；d)在嚴格條件下與a)或b)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和e)包含 下述多核苷酸的至少50個連續核苷酸、或至少100個連續核苷酸、或至少 200個連續核苷酸片段的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQIDNO:l中公 開的序列。在另一實施方案中，啟動子在被植物寄生線蟲感染的植物根中 被誘導。
可以任選地在本發明表達盒中包括的具體遺傳元件包括而不限於允許 在細菌中複製的複製起點，例如來自pBR322或P15A ori的ORI區；或 土壤桿菌T-DNA轉移所需要的元件例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界。 本發明表達盒的其他成分可以包括而不限於，額外的調節元件，例如增強 子、內含子、多接頭、多克隆位點、操縱基因、阻遏物結合位點、轉錄因 子結合位點等。示例性增強子包括來自CaMV35S啟動子、章魚鹼合酶基 因(Ellis等，1987)、稻肌動蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因(Callis， 1987)、 玉米矮縮I基因(Vasil 1989)、 TMV ft元件(Gallie, 1989)和非植物性真核 生物(例如酵母；Ma 1988)的啟動子的元件。示例性行植物內含子序列包括 來自Adhl、 bronze 1、肌動蛋白1、肌動蛋白2(WO 00/760067)的內含子 或蔗糖合酶內含子；見The Maize Handbook,第116章，Freeling和 Walbot編輯，Springer, New York(1994)。
病毒前導序列也可以增強本發明表達盒轉錄目的核酸。例如，來自煙 草花葉病毒(TMV)、玉米褪綠斑點病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的 前導序列已經證明有效增強表達。本領域已知的其他前導序列包括，但不 限於小RNA病毒前導序列，例如腦脊髓炎病毒(EMCV)前導序列；馬鈴 薯Y病毒屬前導序列、菸草蝕紋病毒(TEV)前導序列；MDMV(玉米矮花葉病毒)前導序列；人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)前導序列、來自苜蓿花
葉病毒衣殼蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻譯前導序列。
本發明的表達盒也包含轉錄終止元件或多聚腺苷酸化信號，示例性轉 錄終止元件包括來自根瘤土壤桿菌胭脂鹼合酶基因的那些轉錄終止元件 (Bevan， 1983)、來自根瘤土壤桿菌章魚鹼合酶基因的T7轉錄物的終止子 以及來自馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制物I或Il基因的3'末端。
將要被轉錄成RNA並任選地表達為蛋白質的第二多核苷酸插入本發 明的表達盒中，用於轉化進生物中。根據本發明，第二多核苷酸序列被置 於本發明啟動子多核苷酸的下遊(即3'-方向上)和轉錄終止元件的上遊， 與其共價連接。優選地，第二多核苷酸序列和本發明的啟動子多核苷酸之 間的距離不超過200鹼基對，更優選地不超過IOO鹼基對，最優選地不超 過50鹼基對。
也可通過將本發明的啟動子多核苷酸插入植物基因組中，來裝配本發 明的表達盒。這類插入可導致與基因組固有的目的核酸序列的有效連接。 作為本發明啟動子多核苷酸的轉錄調節特性的結果，這類插入允許目的核
酸在被線蟲誘導後優先在根組織中表達或過表達。插入可以是定向的或隨 機的。優選地，插入是定向的並通過例如同源重組實現。通過該步驟，可 以用本發明的啟動子多核苷酸完全或部分地替換天然的啟動子，從而修飾 內源基因的表達譜。
本發明的表達盒可被插入重組載體、質粒、粘粒、YAC(酵母人工染 色體)、BAC (細菌人工染色體)或適合轉化進宿主細胞中的任何其他載 體中。優選的宿主細胞是細菌細胞，尤其是用於克隆或儲存多核苷酸或用 於轉化植物細胞的細菌細胞，例如但不僅限於大腸桿菌(J^c/ien'c/i紐c o/i)、 根瘤土i裡桿菌(j. rw附e/iic/e附)和毛根土壤桿菌(/1. M/wg^iM)細胞和植物 細胞。當宿主細胞是植物細胞時，表達盒或載體可被插入被轉化的植物細 胞的基因組中。或者，表達盒或載體可保持在染色體外。本發明的表達盒 或載體可存在於植物細胞的核、葉綠體、線粒體和/或質體中。優選地，本
發明的表達盒或栽體被插入植物細胞核的染色體DNA中。本發明的表達盒可被轉化進植物中提供轉基因植物，所述轉基因植物 包含與本發明的啟動子多核苷酸有效連接的一個或多個多核苷酸。該實施
方案的轉基因植物包含下述啟動子，所述啟動子包含如SEQIDNO:l中公 開的啟動子多核苷酸序列或SEQ ID NO:l的最小啟動子多核苷酸片段。或 者，本發明的轉基因植物包含能夠介導根優選和/或線蟲誘導的表達的啟動 子多核苷酸，所述啟動子多核苷酸在嚴格條件下與下述啟動子多核苷酸雜 交，所述啟動子多核苷酸具有SEQ ID NO:l中公開的序列或SEQ ID NO:l 的最小啟動子多核苷酸片段。另外，本發明的轉基因植物包含能夠介導根 優選和/或線蟲誘導的表達的啟動子多核苷酸，所述啟動子多核苷酸與下述 啟動子多核苷酸具有至少70%的序列同一性，所述啟動子多核苷酸具有 SEQ ID NO:l中7>開的序列或SEQ ID NO:l的最小啟動子多核苷酸片段。 如本文中所用，術語"植物，，根據上下文可以理解為意指完整植林、植 物細胞、植物器官、收穫的種子及其子代。詞彙"植物"也指任一植物，尤 其種子植物，並且可以包括，但不限於作物植物。植物部分或植物器官包 括，但不限於莖、根、嫩枝、果實、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織區、 愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、微孢子、下胚軸、子葉、花葯、萼片、 花粉、非收穫的種子等。收穫的種子是指從生產種子的植物上取下的種子， 而非收穫的種子是指仍然與生產種子的植物相連的種子，例如其處於生長 或成熟階段。植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。所述植物可以源於選 自由玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、黑小麥、稻、甘蔗、柑桔樹、菠蘿、 椰子、香蕉、咖啡、茶、菸草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿蔔、芽 菜、番茄、馬鈴薯、棉花、菸草、茄子、胡椒、油菜(oilseedrape)、芸莒、 甜菜、巻心菜、花椰菜、緣花椰菜、萵苣、百樂M艮屬物種(Lotussp.)、蒺藜 苜覆(Medicagotruncatula)、多年生草、黑麥草和擬南芥組成的組中的屬。
製備。任何方法可被用於將重組表達載體轉化進植物細胞中，以產生本發 明的轉基因植物。轉化或轉染宿主細胞(包括植物細胞)的合適方法可見 於例如WO2006/024509 (PCT/EP2005/009366; USSN60/6060789)和上文Sambrook " a/.中，以及其他實驗室手冊例如Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44，々/^6""m'M附protocols, Ed: Gartland and Davey， Humana Press, Totowa， New Jersey中。轉化雙子葉植物的通用方法也公開 於例如美國專利號4，940，838; 5,464,763等等中。用於轉化特定雙子葉植物 例如棉花的方法公開於美國專利號5,004,863; 5，159，135和5,846,797中。大 豆轉化方法公開於美國專利號4,992,375; 5,416,011; 5，569，834; 5,824,877; 6,384,301和EP 0301749B1中。其他植物轉化方法公開於例如美國專利號 4,945,050; 5,188,958; 5，596，131; 5，981，840等等中。
轉化方法可包括直接和間接的轉化方法。合適的直接方法包括聚乙二 醇誘導的DNA攝入、脂質體介導的轉化(US 4,536,475)、使用基因槍的生 物射彈方法(Fromm ME W Bio/Technology. 8(9):833-9， 1990; Gordon-Kamm "fl/. Plant Cell 2:603， 19卯)、電穿孔、在含DNA的溶液中 溫育幹胚，以及顯孩i注射。在這些直接轉化方法的情況下，使用的質粒不 需要滿足任何具體的要求。可使用單一質粒，例如pUC系列、pBR322、 M13mp系列、pACYC184的質粒等等。如果要從被轉化的細胞再生完整 的植物，則另外的可選擇標記物基因優選地位於質粒上。直接轉化技術同 樣適用於雙子葉和單子葉植物。可以通過藉助於土壤桿菌的細菌感染(例 如EP 0 116 718 )、藉助於病毒載體的病毒幹擾(EP 0 067 553; US 4，407，956; WO 95/34668; WO 93/03161)或藉助於花粉(EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4，684，611)完成轉化。基於土壤桿菌的轉化技術(特別是對於雙子葉植 物而言)是本領域公知的。土壤桿菌菌林(例如根瘤土壤桿菌或毛根土壤 桿菌)包含質粒(Ti或Ri質粒)和T-DNA元件，所述質粒和元件在用土 壤桿菌轉染後被轉移至植物。T-DNA (轉化DNA )被整合進植物細胞的基 因組中。T-DNA可位於Ri-質粒或Ti-質粒上，或獨立地包含在所謂的雙元 載體中。土壤桿菌介導的轉化方法描述於例如Horsch RB C a/. (1985) Science 225:1229中。土壤桿菌介導的轉化最適合雙子葉^t物，但是也適合 單子葉植物。土壤桿菌對植物的轉化描述於例如White FF， Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants，第1巻，Engineeringand Utilization, S.D. Kung和R， Wu編輯，Academic Press, 1993， pp. 15畫 38; Jenes B Cfl/. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants，第1巻， Engineering and Utilization, S.D. Kung和R. Wu編輯，Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) A國Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225中。轉化可導致瞬時或穩定的轉化和表達。儘管本發明的
其尤其適用於作物植物細胞。
可使用已知的植物育種方法，將本發明的轉基因植物與以下雜交製備 種子類似的轉基因植物，或缺少與本發明啟動子多核苷酸有效連接的基 因的轉基因植物，或非轉基因植物。另外，本發明的轉基因植物可包括下 述另一轉基因植物和/或與之雜交從而在植物和/或其後代中產生轉基因"垛 疊"，所述另一轉基因植物包含與本發明的啟動子多核苷酸或另一啟動子 有效連接的一個或多個不同基因。然後種植種子，獲得雜交的能育轉基因 植物，其包含目的核酸和本發明的啟動子多核苷酸。雜交的能育轉基因植 物可具有通過母本或通過父本遺傳的具體表達盒。第二種植物可以是近交 的植物。雜交的能育轉基因植物可以是雜種。還包括在本發明中的是任何 這些雜交的能育轉基因植物的種子。本發明的種子可從能育的轉基因植物 收穫並用於栽培本發明的被轉化植物的後代，包括包含所述DNA構建體 的雜種植物4朱系。
也可以如下實現"基因垛疊"通過植物轉化將兩個或更多多核普酸 轉移進細胞核中。在該語境中，"基因"表示編碼全長蛋白質的多核苷酸 以及編碼RNAi構建體或全長蛋白質的結構域的多核苷酸。在轉化期間， 可順序地或同時將多個多核苷酸引入細胞核中。多個植物基因或目標病原 體基因可以通過使用靶定多個連接的部分目的序列的單個轉基因藉助沉默 機制、尤其RNAi進行下調。在各自啟動子控制下的多個垛疊基因也可以 過量表達以獲得想要的單個或多個表型。也可以將含有過量表達基因和受 沉默靶標的基因垛疊的構建體導入植物，從而產生單個或多個農學重要的 表型。在某些實施方案中，本發明的核酸序列可以與目的多核苷酸序列的任一組合垛疊以產生所需表型。所述組合可以產生具有多種性狀組合的植 物，所述性狀組合包括，但不限於抗病性、除草劑耐受性、產量增加、耐 寒性和耐旱性。這些垛疊的組合可以由任一方法產生，所述的任一方法包 括，但不限於通過常規方法或通過遺傳方法對植物進行雜交育種。若性狀 通過遺傳轉化進行堆疊，則目的多核苷酸序列可以按照任一順序依次或同 時組合。例如，若欲導入兩個基因，則這兩個序列可以包含在獨立的轉化 盒內或位於相同的轉化盒上。所述序列的表達可以由相同或不同的啟動子 驅動。
本發明還包括作物，所述的作物包括在農田中 一起栽種的多種本發明 轉基因植物。
本發明的轉基因植物可以用於控制作物中植物寄生線蟲侵染的方法
內，所述方包括以下步驟從包含表達盒的種子培育出所述作物，其中所 述的表達盒包含與編碼物質的第二核酸有效連接的本發明植物啟動子多核 苷酸，所述的物質^s皮壞所述植物寄生線蟲的代謝、生長和/或繁殖，改善植 物對所述植物寄生線蟲的耐受性或對所述植物寄生線蟲有毒，其中所述表 達盒穩定整合至植物細胞、植物和/或種子的基因組內。此類物質包括而不 限於，與對於線蟲存活、變態或繁殖必需的植物寄生線蟲的靶基因基本上 同一的雙鏈RNA;與維持線蟲採食部位所需的植物基因基本上同一的雙 鏈RNA;反義RNA、 siRNA、 miRNA或其前體、幹擾所述線蟲代謝、存 活、變態或繁殖的蛋白質，微生物毒素、來自昆蟲的毒素或幹擾所述線蟲 代謝、存活、變態或繁殖的任一毒素等。
以下實例不意圖限制本發明權利要求
書的範圍，而是意圖作為某些實 施方案的示例。所例舉方法中技術人員想到的任一變化將屬於本發明的範 圍。
實施例l:從擬南芥克隆SCN-誘導型啟動子
提取擬南芥(哥倫比亞生態型)基因組DNA。使用標準PCR擴增方 案，克隆對應於擬南芥基因座標記At5gl2170的、包含5，-非翻譯區的、ATG密碼子緊鄰上遊的1,476 bp (SEQ ID NO :l)基因組DNA區(推定的 啟動子序列)。對應於At5gl2170啟動子區的1,476 bp DNA片段顯示為 SEQ ID NO:l。 PLACE (National Institute of Agrobiological Sciences, Ibaraki， Japan)分析結果指出，在SEQ ID NO:l中啟動子序列3，端上遊300 bp區域中不存在TATA框。
實施例2:從大豆克隆At5gl2170-樣基因
使大豆栽培種Williams 82在瓊脂平板上萌發三天，然後轉移至萌發袋 中。 一天後，用大豆異皮線蟲3號小種的第二階段幼蟲(J2)孵育每個幼苗。 接種後六天，使用已知方法將新的根組織切成1 cm長的段、固定、包埋在 cryomold中並切片。通過擴大的細胞尺寸、增厚的細胞壁和稠密的細胞質 的特有形態識別合胞體細胞，並使用PALM顯微鏡(P.A丄.M. Microlaser Technologies GmbH, Bernried,德國)解剖入RNA提取緩衝液中。
使用已知方法提取總細胞RNA、擴增並用螢光標記。作為對照，從"非 -合胞體"和未經處理的對照根分離總RNA並進行相同的RNA擴增過程。 將擴增的RNA與專有的大豆cDNA陣列雜交。圖4中的表格總結了通過 cDNA微陣列測量的表達數據，所述cDNA微陣列針對所有三種細胞/組織 樣品(合胞體、SCN感染的非-合胞體和未經處理的對照根組織)中的基因 進行分析。基因表達的相對水平顯示為歸一化的信號強度(士標準差)。如 圖4中所述，大豆cDNA克隆GM50657480被鑑定為在SCN-感染的大豆 根的合胞體中^C上調。圖3描繪了大豆cDNA克隆GM50657480的胺基酸 序列(SEQ ID NO:3)。 GM50657480 cDNA序列(SEQ ID NO:2)被確定為不 是全長的，因為不存在ATG啟始密碼子並且根據圖6中所示GM50657480 的氨基餅列(SEQ ID NO: 3)與At5gl2170的氨基瞎列(SEQ ID NO:4) 的比對確定。
實施例3:全長啟動子活性的轉基因髮根測定
為了評價克隆的啟動子的表達活性，將SEQ ID NO:l的核苷酸1-1476克隆在GUS報告基因(細菌p-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson (1987) EMBO J. 6， 3卯1-3907))上遊，產生雙元載體"pAW280"。雙元栽體中的 植物可選擇標記物是由天然擬南芥AHAS啟動子驅動的來自擬南芥的乙醯 羥酸合酶(AHAS)基因的除草劑抗性形式(Sathasivan et al.， Plant Phys. 97:1044-50,1991)。
通過電穿孔(Cho et al" (1998) Plant Sci. 138， 53-65)將雙元載體 pAW280轉化進毛根土壤桿菌(A W/zo^wm) K599菌株中。在接種毛根土 壤桿菌之前，使來自大豆Williams 82 ( SCN易感)的種子萌發，切除子葉 並數次對近軸側造成創傷。將毛根土壤桿菌懸浮液接種在創傷表面上，並 在25。C、 16小時/天光照下，將接種過的子葉近軸側向上醉育三天。然後 將子葉轉移至MS平板上，所述平板含有羧苄青黴素(為了阻抑毛根土壤 桿菌生長)和l ARSENAL (滅草煙(imazapyr)， BASF Corporation, Florham Park, NJ )作為選擇劑。兩周後從受傷側i秀導出發# 。收集抗 ARSENAL並在選擇培養基上生長的根，將其轉移至相同組成的新鮮選擇 培養基上，並在25。C下黑暗中培養。收穫髮根並將它們在選擇培養基上培 養兩周後，將髮根在含羧節青黴素但是不含ARSENAL的MS培養基上傳 代培養。
通過用pAW280轉化產生若干種獨立的轉基因發才艮林系。傳代培養後 約三周，用大豆異皮線蟲3號小種J2接種轉基因髮根林系。大豆異皮線蟲 接種後十二天(DAI)，收穫髮根並使用5-溴-4-氯-3-P引咮基-p-D-葡糖醛酸 (x-Gluc)測定GUS基因的p-葡糖醛酸糖苷酶活性。在接種後的每個時間點， 也在GUS染色溶液中染色來自每個林系的未經接種的對照平板。然後在顯 微鏡下觀察根，以檢測GUS表達。對於每個轉基因抹系而言，觀察10個 隨機挑取的合胞體並記錄GUS表達強度。使用以下的評分指標"-，，表示 無染色，"+"表示弱染色，"++"表示強染色。使用10個計數的上捨入均值 (round-up average)確定林系合胞體中的GUS表達水平。另夕卜，也使用相 同的GUS評分指標記錄相同林系中其它根組織(例如愈傷組織、根尖、維 管系統、皮層和原基(primordial))的GUS表達水平"-"表示無染色，"-/+，，表示存在約25%的測試林系在<25%被觀察的根組織中具有一定的維管 GUS染色，"+"表示弱染色，"++"表示強染色。用pAW280轉化的林系的 結果在圖7中展示。GUS染色的結果指出對測試的大部分抹系而言， pAW280中的啟動子片段在12 DAI時在合胞體中顯示強GUS表達。相反， 其它根部分例如根尖、維管組織和根皮層中的GUS表達未被檢出、在林系 間高度可變或較弱。
實施例4:最小啟動子片段的轉基因髮根測定
使用基於SEQIDNO:l的引物和標準PCR擴增方案，從pAW280擴 增SEQ ID NO:l的鹼基476到1476所代表的1001 bp啟動子缺失片段和 SEQ ID NO:l的鹼基977到1476所代表的500 bp啟動子缺失片段。通過 標準瓊脂糖凝膠電泳驗證每種PCR產物的擴增DNA片段大小，並通過 Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen， Hilden,德國)提取DNA。將來自SEQ ID NO:l的啟動子缺失克隆至GUS報告基因上遊，分別產生雙元栽體 "RTJ119，，和"RTJ120"。雙元載體中的植物選擇標記物是由實施例3中所 述擬南芥AHAS啟動子驅動的突變的AHAS基因。如實施例3中所述，將 雙元載體pAW280、RTJ119和RTJ120轉化進毛根土壤桿菌K599菌林中， 產生轉基因髮根。用大豆異皮線蟲SCN3號小種J2接種轉基因髮根林系， 並如實施例3中所述測定GUS表達。
用pAW280、 RTJ119和RTJ120轉化的林系的結果列於圖8中。 RTJ119包含的SEQ ID NO:l的1001 bp最小啟動子片段賦予了合胞體中 線蟲誘導的表達。RTJ119中的合胞體染色強度不如在pAW280中觀察到 的強。RTJ120包含的SEQ ID NO:l的500 bp片段不賦予合胞體中線蟲誘 導的表達。
實施例5:全才直林GUS染色
通過轉化代表性構建體產生轉基因大豆全植林，以表徵整個植物生活 周期中根和全植林組織中響應線蟲感染的啟動子表達，所述轉基因大豆全植林包含與GUS報告基因有效連接的SEQ ID NO:l表示的啟動子序列或 其變體。大豆全植林中啟動子表徵的代表性方法包括但不限於以下描述。 測試轉基因大豆Tl種子的接合性(zygosity)，並使單拷貝事件萌發、在溫 室條件下培養，並針對葉、莖、花、胚和種皮組織中不同發育階段的GUS 表達進行取樣。另外，在接種和未接種的對照根中，在SCN感染之前和之 後的不同時間收穫根組織。針對每個事件測試多種植物，以測定GUS染色 分析中的一致趨勢。將收穫的樣品從植物切下並如實施例3中所述測定 GUS表達。然後觀察組織並對GUS染色的強度評分。
權利要求
1.包含分離的啟動子多核苷酸的啟動子，所述啟動子能夠介導根優選的和/或線蟲誘導的表達，所述啟動子多核苷酸選自如下多核苷酸
a)具有包含SEQ ID NO1的核苷酸1到1476的序列的多核苷酸；
b)多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO1中公開的序列的多核苷酸的核苷酸476到1476；
c)與a)或b)的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)在嚴格條件下與a)或b)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和
e)包含SEQ ID NO1的至少50個連續核苷酸、或至少100個連續核苷酸、或至少200個連續核苷酸的片段的多核苷酸。
2. 權利要求
1的啟動子，其中所述分離的啟動子多核苷酸具有包含 SEQ ID NO:l的核苷酸1到1476的序列。
3. 權利要求
l的啟動子，其中所述分離的啟動子多核苷酸包含SEQID NO:l的核苷酸476到1476。
4. 權利要求
l的啟動子，其中所述分離的啟動子多核苷酸與以下多核 苷酸有至少70%的序列同一性a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸；b) 包含SEQIDNO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
5. 權利要求
l的啟動子，其中所述分離的啟動子多核苷酸與以下多核 苷酸雜交a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸；b) 包含SEQ ID NO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
6. 包含權利要求
1的啟動子的表達盒。
7. 權利要求
6的表達盒，其中所述第二多核苷酸賦予植物選自以下的 性狀提高的產量、在脅迫條件下提高的存活、提高的營養品質、對植物 寄生線蟲的提高的抗性、改良的蛋白質含量和改良的油含量。
8. 權利要求
7的表達盒，其中所述第二多核苷酸通過編碼如下物質而賦予對植物寄生線蟲的提高的抗性a) 破壞植物寄生線蟲代謝、生長或生殖的物質，b) 對植物寄生線蟲有毒的物質。
9. 用表達盒轉化的轉基因植物，所述表達盒包含與第二多核苷酸有效 連接的分離的啟動子多核苷酸，其中a) 分離的啟動子多核苷酸選自i) 包含SEQ ID NO:l的核苷酸1到1476的多核苷酸；ii) 包含SEQIDNO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸；iii) 與i)或ii)的多核苷酸有至少70%序列同一性的多核苷酸；iv) 在嚴格條件下與i)或ii)的多核苷酸雜交的多核苷酸；和v) 包含SEQ ID NO:l的至少50個連續核苷酸、或至少100個連續核 苷酸、或至少200個連續核苷酸的片段的多核苷酸；並且b) 分離的啟動子多肽能夠介導根優選的或線蟲誘導的表達。
10. 權利要求
9的植物，其中所述植物是單子葉植物。
11. 權利要求
9的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
12. 權利要求
9的植物，其中所述植物選自玉米、小麥、大麥、高粱、 黑麥、黑小麥、稻、甘蔗、柑桔樹、菠蘿、椰子、香蕉、咖啡、茶、菸草、 向曰葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿蔔、芹菜、番茄、馬鈴薯、棉花、菸草、 茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔、甜菜、巻心菜、花椰菜、綠花椰 菜、萵苣、百樂財艮屬物種(Lotussp.)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、多 年生草、黑麥草和擬南芥。
13. 權利要求
9的植物，其中所述分離的啟動子多核苷酸包含SEQID N:l的核苷酸l到1476。
14. 權利要求
9的植物，其中所述分離的啟動子多核苷酸包含SEQID NO:l的核苷酸476到1476。
15. 權利要求
9的植物，其中所述分離的啟動子多核苷酸與以下多核 苷酸有至少70%的序列同一性a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸，或b) 包含SEQIDNO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
16. 權利要求
9的植物，其中所述分離的啟動子多核苷酸與以下多核 苷酸雜交a) 包含SEQIDNO:l的核苷酸l到1476的多核苷酸，或b) 包含SEQ ID NO:l的核苷酸476到1476的多核苷酸。
17. 賦予或提高植物中線蟲抗性的方法，其包括步驟a) 製備如權利要求
6所述的表達盒；b) 用步驟a)的表達盒轉化植物細胞；c) 再生轉化的植物細胞以產生轉基因植物，和d) 選擇與不含有所述表達盒的具有相同基因型的植物相比具有提高 的線蟲抗性的;f直物。
18. 權利要求
17的方法，其中所述有效連接的第二多核苷酸通過編碼 如下物質而提高植物對植物寄生線蟲的抗性a) 破壞植物寄生線蟲的代謝、生長或生殖的物質，b) 對植物寄生線蟲有毒的物質。
專利摘要
本發明提供了根特異和/或由寄生線蟲誘導的啟動子多核苷酸。本發明的啟動子可用於控制植物根中目的核酸的表達。
文檔編號C12N15/29GKCN101589144SQ200880002577
公開日2009年11月25日 申請日期2008年2月4日
發明者A·威格, R·阿申齊, R-G·甄, S·喬杜裡, Y·韓, 翔 黃 申請人:巴斯福植物科學有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan