一種臨床感染性疾病基因晶片製備設計方案的製作方法
2023-06-18 13:11:31 1
專利名稱：一種臨床感染性疾病基因晶片製備設計方案的製作方法
技術領域：
本發明確定了一種臨床診斷應用基因晶片的製備設計方案，屬於生物技術領域。
背景技術：
基因晶片技術是一種新興的生物技術，它在生物學各領域有廣泛的應用前景。臨床診斷是其應用領域之一。感染性疾病是臨床上最普遍的疾病，基因晶片具有替代現有診斷技術的極大潛力。應用於臨床的感染性疾病診斷基因晶片目前尚無產品面市。由於診斷晶片的特殊要求，作為基礎研究的表達譜晶片技術照搬於診斷基因晶片上，很難滿足診斷晶片的技術要求。另一方面，感染性病原物是人體的一種生物，它們在進化上有相當大的差異，因而可以找到與人類不同的特異DNA片段，這為建立感染性病原物的DNA晶片技術帶來便利。
發明內容
本發明根據感染性病原物的特點和臨床診斷的特殊要求，建立了一種臨床診斷應用基因晶片的製備設計方案，該方案為1.利用短的特異DNA片段(100-200bp)作為探針。該種探針的優點是(1)由於寡核苷酸序列雖然特異性較高，但其雜交條件要求嚴格，不同的探針在同一條件下進行雜交，很難找到一個使所有探針的雜交效果都一樣好的條件。而較長的DNA序列對雜交條件要求相對寬鬆，已建立的雜交條件對所有探針的雜交都合適。(2)寡核苷酸雜交對一個鹼基的突變都非常敏感，而病原物的變異相對較快，這就使得檢測技術的假陰性率較高，而DNA片段是檢測序列，個別鹼基的變異不會引起漏檢而引起假陰性。(3)較長的DNA序列作探針的缺點是遇到其他微生物或宿主的同源序列而導致假陽性。(4)寡核苷酸的製作成本較高，而DNA片段的成本相對較低。
2.設置多個對照位點。本方案設置對照位點，臨床使用時可將其中的幾個設為陽性，將另一部分位點設為陰性位點。這樣一方面避免偶然原因使單個陽性(或陰性)位點的檢測失誤，另一方面可為診斷時，設置陽性對照模板濃度梯度，配以適當的循環數，建立半定量檢測技術體系。
3.每種病原物設置多個檢測位點。為避免因不同患者病原物的差異而出現假陰性，對同一病原物選擇多個位點進行檢測，這樣可以減少因病原物的變異導致假陰性的可能性。
4.每個位點設置重複，重複次數為4.在晶片檢測操作中，會因洗脫，載片上的雜點，雜交液分布不均勻等，造成某個位點的假信號，或沒有信號。如果只有一個檢測位點，就會引起判斷失誤。每個位點有4個重複，上述的雜質信號，雜交不均勻等錯誤不可能同時在2個以上的位點發生。這樣就可以避免上述等原因導致的假陽性或假陰性。
5.點陣設計，儘可能地使對照和檢測位點數總和是某一個數的平方，將所有位點組成一個正方形矩陣，重複4次還是一個正方形矩陣。對照位點分別佔據4角，或中心，或對角線上，或形成菱形。每個位點的4個重複儘可能對稱。以5個檢測位點4個對照位點為例，點陣設計圖見圖1。
本發明具有成本低、操作簡便、檢測結果精確等優點。本技術方案既可用於臨床感染性疾病基因晶片製備，也適用於利用基因晶片技術進行所有以特異序列為檢測靶點的種群、類群和個體鑑定。
附圖1為為點陣示意圖。圖中4個對照位點，5個檢測位點的點陣設計圖。只有對照信號的雜交圖譜。
圖中2為只有對照信號的雜交圖譜。圖中4個對照位點和5個檢測位點組成一個正方形小矩陣，4個重複並成一個大矩陣，大矩陣也是正方形。每個位點的4個重複對稱分布。對照位點的I、III和IV形成對角線，而II形成菱形。
具體實施例方式本發明的實施按如下程序進行1.通過網絡搜索獲得病原物特異DNA片段，然後設計PCR引物並從臨床標本中克隆，測序。然後設計探針引物，使序列長度在100-200bp。
2.採用常規質粒DNA擴增，提取及純化方法擴增克隆的探針質粒，利用PCR方法擴增探針序列，並採用常規的PCR產物純化方法純化PCR產物。純化PCR產物即可用作晶片製備的探針。
3.按常規的方法配製探針點樣液(如3XSSC溶液)，用點樣儀製備DNA晶片，點陣按前述設計方案設計。
4.點樣後，在紫外交聯儀中交聯固定DNA探針，通常用紫外光強65-120mJ/cm2，交聯時間10-30分鐘。交聯固定後沸水煮2分鐘變性探針DNA，用甲基吡咯烷酮封閉，晶片製備完成。
權利要求
1.一種臨床感染性疾病基因晶片製備設計方案，該方案的特徵在於1.1選擇病原物特異的100-200bp短序列的PCR產物作為探針；1.2設置多個陽性對照，檢測時所加入的陽性對照位點模板濃度按幾何級數呈梯度，進行半定量檢測；1.3對同一病原物選擇多個位點進行檢測；1.4設置4個重複，3個以上位點有信號則為陽信。
全文摘要
本發明涉及一種臨床感染性疾病基因晶片製備設計方案，屬於生物技術領域。該方案為1.利用短的特異DNA片段(100－200bp)作為探針；2.設置多個對照位點；3.每種病原物設置多個檢測位點；4.每個位點設置4個重複，每個位點的4個重複儘可能對稱。本發明具有成本低、操作簡便、檢測結果精確等優點。本技術方案既可用於臨床感染性疾病基因晶片製備，也適用於利用基因晶片技術進行所有以特異序列為檢測靶點的種群、類群和個體鑑定。
文檔編號C12Q1/68GK1508263SQ02128068
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優先權日2002年12月18日
發明者譚德勇, 賴建華, 餘敏 申請人:雲南大學