鹿角蕨的無菌孢子萌發和試管育苗方法
2023-06-18 22:23:21 1
專利名稱：鹿角蕨的無菌孢子萌發和試管育苗方法
技術領域：
本發明涉及鹿角蕨的繁殖栽培方法，具體來說涉及採用無菌孢子萌發和試管育苗繁殖栽 培鹿角蕨的方法。
技術背景鹿角蕨又名麋角蕨、蝙蝠蕨、鹿角羊齒等，水龍骨科鹿角蕨屬(,h^ce/^/歷)植物，是 觀賞蕨中姿態最為奇特的一類，屬於附生性觀賞蕨。鹿角蕨的葉有二型，營養葉較小，呈圓 形、橢圓形或扇形，密貼於附生物之上，孢子葉形狀十分别致，形似梅花鹿角，葉面密被毛 絨，新生時為嫩綠色，成熟時轉為淺褐色，十分逗人喜愛。鹿角蕨在歐美的公園、植物園、 商店、居室、窗臺等地方的裝飾和布置十分流行，是室內觀葉植物中珍貴稀有的精品，特別 是室內立體綠化的好材料。若將鹿角蕨貼生於古老枯木或裝飾於吊盆，可點綴書房、臥室、 客室和窗臺，若作懸吊式或鑲掛式布置，雅致而充滿異國風情，更添自然景趣。鹿角蕨屬植 物全世界約有18種，原產於非洲、亞洲、大洋洲和南美的熱帶、亞熱帶雨林中，大多具有極 高的觀賞價值。我國僅重裂鹿角蕨(屍7at/cen'鵬附7h'c/^7)—種，屬於國家二級保護植物。 但目前，我國在大力引進國外各貴花卉的同時，己幵始對其它鹿角蕨品種的引進，並進行了 開發利用，己並受到越來越多的人喜愛，具有巨大的市場前景。鹿角蕨的繁殖可採用分株和孢子播種繁殖，但分株繁殖速度慢，繁殖係數低。目前，國 內、外未見對其進行大規模組織培養生產和專利申請的報導。 發明內容本發明目的在於提供一種新穎的、簡單而快速的鹿角蕨繁殖方法。本發明採用無菌孢子萌發和試管成苗能成功地進行鹿角蕨的快速繁殖，培養基成分獨特、 簡單，繁殖方法新穎、具有投入少，產出高的特點，實現了本發明的目的。 本發明的鹿角蕨繁殖栽培方法，包括以下步驟-(1) 孢子無菌萌發採集健壯生長的鹿角蕨(屍7a^ceh鵬)葉背的成熟孢子用70% 75%酒精浸泡10 30 s，取出置於0. 1% 0. 2%升汞溶液或1% 2%的次氯酸鈉溶液消毒10 15 min，無菌水洗後，接種到孢子萌發培養基上；在(25±1) 'C先暗培養2 3周，然後8 12 h/天、1500 2000 lx光照下，培養形成原葉體，所述的培養基每升中含有活性炭0.5 1 g， 椰子乳50 150 mL，赤黴素0. 1 0. 5 mg，瓊脂5 7 g，其餘為MS;(2) 配子體生長培養將步驟(1)的原葉體轉入配子體生長培養基，在(25±1) °C， 8 12 h/天、1500 2000 lx光照下培養，形成叢生葉狀的配子體，所述的培養基每升中含 有水解酪蛋白0. 1 0.3 g， 6-苄基嘌呤0.2 1.0mg，萘乙酸0. 1 0. 5mg，瓊脂5 7 g， 其餘為MS;(3) 授精形成合子將步驟(2)的叢生的葉狀的配子體先接種到液體配子體生長培養 基上，在(25±1) 。C， 8 12h/天、1500 2000 lx光照，50 100 r/min振蕩培養2 3天， 再將液體培養過的葉狀體接種到固體配子體生長培養基，在與上述相同的條件下，繼續培養 長出2倍體的孢子體植株，所述的液體配子體生長培養基每升中含有活性炭0.5 1 g，椰子 乳50 150mL，赤黴素0.1 0.5mg，其餘為MS，所述的固體配子體生長培養基每升中含有 水解酪蛋白O. 1 0.3 g， 6-苄基嘌呤0.2 1.0mg，萘乙酸0. 1 0. 5 mg，瓊脂5 7 g，其 餘為MS;(4) 孢子體增殖培養將步驟(3)中的孢子體小植株接種到綠球體誘導增殖培養基上， 在(25±1) 。C， 8 12 h/天、1500 2000 lx光照培養，在植株基部誘導形成綠球體，這些 綠球體在與上述相同的培養基上增殖，並形成小植株，所述的培養基每升中含有椰子乳100 150mL，蛋白腖l 2g， 6-苄基嘌呤0.2 1.0mg，瓊脂5 7 g,其餘為MS;(5) 生根培養將步驟(4)得到的小植株接種到生根壯苗培養基上，在(25±1) °C， 8 12 h/天、1500 2000 lx光照培養，形成帶根的健壯植株，所述的培養基每升中含有活 性炭0. 3 0. 5 mg，吲哚丁酸0. 1 0. 5 mg，瓊脂5 7 g，其餘為1/2 MS，所述的1/2 MS是 將MS中的大量元素減半，其它成分不變組成的培養基；(6) 出瓶移栽生根苗於70% 80%遮蔭的自然光下煉苗5 7天，將其由培養瓶中取出， 洗淨根部的培養基，栽培於水苔中，25 28°C， 80% 90%遮蔭，溼度60% 90%，保持通風， 植株恢復生長。步驟(1)中的鹿角蕨可以是該屬中的各種鹿角蕨，例如重裂鹿角蕨(/^"7Ce/^， ^Jic/ i_z. )、 二叉鹿角蕨(屍7a^Kce"'咖A_z'/i/rcat，)、大鹿角蕨(/^atyceri"/ 7 gra"ofe)、 長葉鹿角蕨6^7at/ceri"歷wa7i/"ch7入美洲鹿角蕨(Z^cari〃歷3"(//"〃777)、昆士蘭鹿角 蕨(屍7at/ceri鵬/w'7h'力等，所述的無菌水洗5 6次，在25土rC先暗培養2 3周，然後 8 12 h/天，1500 2000 lx光照下，再培養4 5周，形成原葉體；步驟(2)中培養4 5 周，形成大量叢生葉狀的配子體；步驟(3)中先接種到液體配子體生長培養基上，培養2 3天，以促進精子移動到頸卵器形成合子，再將液體培養過的葉狀體接種到固體配子體生長 培養基上，繼續培養3 4周，長出2倍體的孢子體植株；步驟(4)中培養6-8周，可以在 植株基部誘導形成大量綠球體；步驟(5)中培養4 6周，形成帶根的健壯植株；步驟(6) 培養1周後可見植株恢復生長，成活率80% 90%， 30-40天後可上盆栽培。上述培養基中的MS為國際通用的培養基，所述的1/2MS是將MS中的大量元素減半，其 它成分不變而形成的培養基，其成分和配製方法參看文獻(譚文澄、戴策剛主編.觀賞植物組 織培養技術.北京中國林業出版社，1991.)。本發明採用無菌孢子萌發和試管成苗能成功地進行鹿角蕨的快速繁殖，培養基成分獨特、 簡單，繁殖方法新穎、具有投入少，產出高的特點，是利用植物試管技術進行珍稀植物種苗
的規模化生產的高新生物技術，試管種苗移栽成活率達80% 90%。
具體實施方式
以下的實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。 實施例1:採集溫室栽培的重裂鹿角蕨(Wa^rer^歷ra〃ic力2'i Hook)健壯植株孢子葉背上的成 熟孢子，用70%酒精浸泡10 s，取出置於0.2%升汞溶液中消毒10 min ，無菌水洗5次後， 接種到孢子萌發培養基(每升中含有活性炭0.5g，椰子乳50mL，赤黴素0. lmg，瓊脂7 g, 其餘為MS)，在25X:先暗培養2周，然後每天12小時1500 lx光照下培養5周，形成原葉體。 將原葉體轉入配子體生長培養基(每升中含有水解酪蛋白0.1 g, 6-苄基嘌呤0.2 mg，萘 乙酸O. 1 mg，瓊脂7 g,其餘為MS)， 25°C，每天12小時1500 lx光照下培養5周，形成大 量叢生葉狀的配子體。將叢生的葉狀體接種到液體配子體生長培養基(每升中含有活性炭0. 5 g，椰子乳50mL,赤黴素0. lmg，其餘為MS)， 25°C，每天12小時1500 lx光照，50r/min 振蕩培養2天，以促進精子移動到頸卵器形成合子；將液體培養過的葉狀體接種到固體配子 體生長培養基(每升中含有水解酪蛋白0.2 g， 6-苄基嘌呤0.2mg，萘乙酸O. lmg，瓊脂7 g，其餘為MS),在與上述相同的條件下，繼續培養4周，長出2倍體的孢子體植株。將孢子 體小植株接種到綠球體誘導增殖培養基(每升中含有椰子乳100 mL，蛋白腖lg， 6-苄基嘌 呤0.2 mg，瓊脂7 g,其餘為MS), 25°C，每天12小時1500 lx光照，培養6周，可以在植 株基部誘導形成大量綠球體，這些綠球體在相同培養基上增殖，並形成小植株。將小植株接 種到生根壯苗培養基(每升中含有活性炭0. 5 mg，吲哚丁酸0. 1 mg，瓊脂7 g,其餘為1/2 MS)， 25°C，每天12小時1500 lx光照，培養6周，形成帶根的健壯植株。生根苗於70%遮蔭的自 然光下煉苗7天，將其由培養瓶中取出，洗淨根部的培養基，栽培於水苔中，25°C， 90%遮蔭， 溼度90%，保持通風，l周后可見植株恢復生長，成活率90%。 一個月後可上盆栽培。實施例2:採集溫室栽培的大鹿角蕨(/^st/ceri^^r朋^)健壯植株孢子葉背上的成熟孢子，用 75%酒精浸泡10 s，取出置於0. 1%升汞溶液中消毒15 min ，無菌水洗6次後，接種到孢子 萌發培養基(每升中含有活性炭lg,椰子乳150mL，赤黴素0.5mg，瓊脂5 g，其餘為MS)， 在24'C先暗培養3周，然後每天8小時2000 lx光照下培養4周，形成原葉體。將原葉體轉 入配子體生長培養基(每升中含有水解酪蛋白0.3g， 6-苄基嘌呤l.Omg，萘乙酸0.5mg， 瓊脂5g，其餘為MS)， 24°C，每天8小時2000 lx光照下培養4周，形成大量叢生葉狀的配 子體。將叢生的葉狀體接種到液體配子體生長培養基(每升中含有活性炭1 g，椰子乳150 mL， 赤黴素0. 5rag，其餘為MS)， 24°C，每天8小時2000 lx光照，100r/min振蕩培養3天，以 促進精子移動到頸卵器形成合子；將液體培養過的葉狀體接種到固體配子體生長培養基(每升 中含有水解酪蛋白0.3 g， 6-苄基嘌呤l.Omg，萘乙酸0.5mg，瓊脂5 g,其餘為MS)，在
與上述相同的條件下，繼續培養3周，長出2倍體的孢子體植株。將孢子體小植株接種到綠 球體誘導增殖培養基(每升中含有椰子乳150mL，蛋白腖2g， 6-節基嘌呤l.Omg，瓊脂5 g， 其餘為MS)， 24°C，每天8小時20000 lx光照，培養4周，可以在植株基部誘導形成大量綠 球體，這些綠球體在相同培養基上增殖，並形成小植株。將小植株接種到生根壯苗培養基(每 升中含有活性炭0.3 mg，吲哚丁酸0.5 mg，瓊脂5 g,其餘為1/2 MS) ， 24°C，每天8小時 2000 1x光照，培養4周，形成帶根的健壯植株。生根苗於80%遮蔭的自然光下煉苗7天，將 其由培養瓶中取出，洗淨根部的培養基，栽培於水苔中，28°C, 80%遮蔭，溼度60%，保持通 風，l周后可見植株恢復生長，成活率80%。 35天後可上盆栽培。 實施例3:採集溫室栽培的二叉鹿角蕨(/Vat/cen'鵬6i/"rc"鵬C. Chr.)健壯植株孢子葉背上的 成熟孢子，用70%酒精浸泡10 s，取出置於1.5%次氯酸鈉溶液中消毒10 min ，無菌水洗5 次後，接種到孢子萌發培養基(每升中含有活性炭0.5 g，椰子乳IOO mL，赤黴素0.2 mg， 瓊脂7 g，其餘為MS)，在26'C先暗培養2周，然後每天10小時1800 lx光照下培養5周， 形成原葉體。將原葉體轉入配子體生長培養基(每升中含有水解酪蛋白0.2g， 6-苄基嘌呤 0.5 mg，萘乙酸0.2 mg,瓊脂7 g (有？)，其餘為MS)， 26°C，每天10小時1800 lx光照 下培養5周，形成大量叢生葉狀的配子體。將叢生的葉狀體接種到液體配子體生長培養基(每 升中含有活性炭0.5 g,椰子乳100 mL,赤黴素0.2 mg，其餘為MS), 26°C，每天10小時 1800 1x光照，50r/min振蕩培養2天，以促進精子移動到頸卵器形成合子；將液體培養過的 葉狀體接種到固體配子體生長培養基(每升中含有水解酪蛋白0.2 g， 6-苄基嘌呤0.5 mg， 萘乙酸0.2mg，瓊脂6g，其餘為MS)，在與上述相同的條件下，繼續培養4周，長出2倍體 的孢子體植株。將孢子體小植株接種到綠球體誘導增殖培養基(每升中含有椰子乳100 inL， 蛋白腖lg， 6-苄基嘌呤0.5mg,瓊脂7g，其餘為MS)， 26°C，每天10小時1800 lx光照， 培養6周，可以在植株基部誘導形成大量綠球體，這些綠球體在相同培養基上增殖，並形成 小植株。將小植株接種到生根壯苗培養基(每升中含有活性炭0.5 mg，吲哚丁酸0.2 mg，瓊 脂6g，其餘為1/2MS), 26°C，每天10小時1800 1x光照，培養4周，形成帶根的健壯植株。 生根苗於80%遮蔭的自然光下煉苗7天，將其由培養瓶中取出，洗淨根部的培養基，栽培於 水苔中，25°C， 90%遮蔭，溼度80%，保持通風，1周後可見植株恢復生長，成活率85%。 40 天后可上盆栽培。
權利要求
1.鹿角蕨繁殖栽培方法，其特徵包括以下步驟(1)孢子無菌萌發採集健壯生長的鹿角蕨(Platycerium)葉背的成熟孢子用70％～75％酒精浸泡10～30s，取出置於0.1％～0.2％升汞溶液或1％～2％的次氯酸鈉溶液消毒10～15min，無菌水洗後，接種到孢子萌發培養基上；在(25±1)℃先暗培養2～3周，然後8～12h/天、1500～2000lx光照下，培養形成原葉體，所述的培養基每升中含有活性炭0.5～1g，椰子乳50～150mL，赤黴素0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其餘為MS；(2)配子體生長培養將步驟(1)的原葉體轉入配子體生長培養基，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照下培養，形成叢生葉狀的配子體，所述的培養基每升中含有水解酪蛋白0.1～0.3g，6-苄基嘌呤0.2～1.0mg，萘乙酸0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其餘為MS；(3)授精形成合子將步驟(2)的叢生的葉狀的配子體先接種到液體配子體生長培養基上，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照，50～100r/min振蕩培養2～3天，再將液體培養過的葉狀體接種到固體配子體生長培養基，在與上述相同的條件下，繼續培養長出2倍體的孢子體植株，所述的液體配子體生長培養基每升中含有活性炭0.5～1g，椰子乳50～150mL，赤黴素0.1～0.5mg，其餘為MS，所述的固體配子體生長培養基每升中含有水解酪蛋白0.1～0.3g，6-苄基嘌呤0.2～1.0mg，萘乙酸0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其餘為MS；(4)孢子體增殖培養將步驟(3)中的孢子體小植株接種到綠球體誘導增殖培養基上，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照培養，在植株基部誘導形成綠球體，這些綠球體在與上述相同的培養基上增殖，並形成小植株，所述的培養基每升中含有椰子乳100～150mL，蛋白腖1～2g，6-苄基嘌呤0.2～1.0mg，瓊脂5～7g，其餘為MS；(5)生根培養將步驟(4)得到的小植株接種到生根壯苗培養基上，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照培養，形成帶根的健壯植株，所述的培養基每升中含有活性炭0.3～0.5mg，吲哚丁酸0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其餘為1/2 MS，所述的1/2 MS是將MS中的大量元素減半，其它成分不變組成的培養基；(6)出瓶移栽生根苗於70％～80％遮蔭的自然光下煉苗5～7天，將其由培養瓶中取出，洗淨根部的培養基，栽培於水苔中，25～28℃，80％～90％遮蔭，溼度60％～90％，保持通風，植株恢復生長。
2. 根據權利要求1的鹿角蕨繁殖栽培方法，其特徵是步驟(1)中的鹿角蕨是重裂鹿角 蕨(f7aO"ceri〃歷,aJ力'c/w7 )、 二叉鹿角蕨(屍7atycerj'"/ff /^'f"rcat"/z7)、 大鹿角蕨(/^az^ceri"/ 7 ^ra/70fe )、 長葉鹿角蕨f屍7a t/ceri"邁 wa7A'/7ch'i J 、美洲鹿角蕨 (屍7at/ceri"/ 7 a"(///7t//77)或昆士蘭鹿角蕨(/7atycer/〃/Z7 Zw7力'i)。
3.根據權利要求1或2的鹿角蕨繁殖栽培方法，其特徵是步驟(1)中所述的無菌水洗 5 6次，在25士rC暗先培養2 3周，然後8 12h/天，1500 2000 lx光照下，繼續培養 4 5周，形成原葉體；步驟(2)中培養4 5周，形成叢生葉狀的配子體；步驟(3)中先 接種到液體配子體生長培養基上，培養2 3天，再將液體培養過的葉狀體接種到固體配子體 生長培養基上，繼續培養3 4周，長出2倍體的孢子體植株；步驟(4)中培養6-8周，在 植株基部誘導形成綠球體；步驟(5)中培養4 6周，形成帶根的健壯植株；步驟(6)培養 30-40天後可上盆栽培。
全文摘要
本發明涉及鹿角蕨的繁殖栽培方法，具體來說涉及採用無菌孢子萌發和試管育苗繁殖栽培鹿角蕨的方法。採集健壯生長的鹿角蕨屬(Platycerium)中各種鹿角蕨葉背的成熟孢子，經過孢子無菌萌發、配子體生長培養、授精形成合子、孢子體增殖培養、生根培養、出瓶移栽等步驟繁殖栽培鹿角蕨。本發明方法能成功地進行鹿角蕨的快速繁殖，培養基成分獨特、簡單，繁殖方法新穎，具有投入少，產出高的特點，是利用植物試管技術進行珍稀植物種苗的規模化生產的高新生物技術，試管種苗移栽成活率達80％～90％。
文檔編號A01G1/04GK101133704SQ20071003059
公開日2008年3月5日 申請日期2007年9月28日 優先權日2007年9月28日
發明者吳坤林, 曾宋君, 俊 段, 楓 鄭, 陳之林 申請人:中國科學院華南植物園