使用islet1作為標誌分離或產生幹細胞的製作方法

2023-06-18 22:05:31

專利名稱：使用islet1作為標誌分離或產生幹細胞的製作方法
技術領域：
本發明一般性地涉及體外擴增和增殖未分化的祖細胞，更具體地，涉及含有Isletl的未分化祖細胞(undifferentiated progenitor cellscontaining Islet1)。
背景信息先天性心臟病(Congenital heart disease)在所有出生缺陷中是最常見的(Hoffman and Kaplan，2002)。為了成功地預防先天性心臟病，或對先天性心臟病進行治療幹預，對其病原學的了解是極其重要的。為了達到這個目的，對具體的心臟細胞譜系的起源和它們之間的相互關係的理解是至關重要的。理解心臟祖先細胞(cardiac progenitors)的起源和性質，對於開發針對先天性心臟病和成人心臟病的心臟幹細胞治療來說也具有重要意義。最近的研究工作已經定義了心臟祖先細胞的兩個區(fields)，被稱為初級區，和次級區，或前心區(Kelly and Buckingham，2002)。據認為，初級心區(primary heart field)形成心臟的心房和心室，而認為次級區或前區(secondary or anterior field)形成流出道(outflow tract)。認為次級區在早期線性心管階段(early linear heart tube stage)位於心臟的前部和背部。有關心流出道不存在於線性心管中的最初的證據，來自在小雞胚胎中所進行的一系列體內譜系研究，這些研究由de laCruz和同事從1977起向前推進(de la Cruz，2000)。這些研究表明，在線性心管階段不存在流出道，但是沒有指出在後面的階段中，流出道來自何處。最近，由三個不同的實驗室所作的研究指出了流出道的起源，其中，兩個實驗室在小雞胚胎中進行研究，一個在小鼠胚胎中進行研究(Kelly et al.，2001；Mjaatvedt et al.，2001；Waldo et al.，2001)。這些研究結果表明，流出道中的一些細胞起源於靠近咽內胚層(pharyngealendoderm)的髒壁中胚層(splanchnic mesoderm)。這些實驗結果不能最終評價「次級」或「前」心區的貢獻大小和界線。已經用許多不同的方式對幹細胞進行了定義。然而，主要原則包括(1)自我更新，或能產生具有與原始的母細胞類似的特徵的子細胞(daughter cells)的能力；(2)單個細胞的多譜系分化(multi-lineagedifferentiation)；和(3)受損組織的體內功能重構。胚胎幹(ES)細胞——最初從小鼠獲得(Evans andKaufmann，1981)，最近從非人靈長類和人類胚泡獲得(Thomson，et al.，1998)——展示出所有三種特徵。ES細胞是多能細胞，源自胚泡的內細胞團，它可以在未分化的狀態下無限繁殖。小鼠和人ES細胞系都在培養中被連續保持，細胞倍增多於300次。在體外，當ES細胞被注射入胚泡時，ES細胞分化為所有的體細胞類型，並形成具有全部三胚層的成熟子代細胞(mature progeny cells)。最終，ES細胞的所有分化的子代細胞都是功能細胞，因為由四倍體胚胎互補作用(tetraploid embryocomplementation)產生的小鼠是活的。儘管ES細胞已經被從人類分離得到，但是它們在研究中的應用以及它們的治療潛力受到倫理考慮因素的阻礙。儘管成體幹細胞的自我更新和分化的程度低於ES中所看到的自我更新和分化的程度，多數成體幹細胞也能達到上面提到的幹細胞標準。研究得最透徹的成體幹細胞——造血幹細胞(HSC)(Weissman，2000)——進行著體內自我更新的細胞分裂，在單細胞水平分化成所有成熟血成分，並在機能上使得重度骨髓抑制的動物和人的骨髓予以恢復。其他成體幹細胞在更近時期才被定義，並因此，研究得不夠透徹。然而，神經幹細胞(NSC)(Gage，2000)，間充質幹細胞(MSC)(Jiang，et al.，2002)和表皮幹細胞(Toma，et al.，(2001)都達到這些基本標準。其他也被稱為幹細胞的細胞，如成血管細胞或內皮幹細胞(Rafii，et al.，1994)，除了它們僅分化成一種單一類型的細胞外，展示出所有必要的特點。過去幾年中，發表了許多文獻，它們指出來自一個給定組織的細胞可以有能力分化成一個不同組織的細胞。「幹細胞可塑性(Stemcell plasticity)」是一個新的術語，其已被用來描述最近觀察資料，即在出生後的成體幹細胞中，存在著比原先所期望的更大潛力。利用骨髓(BM)的大多數研究，或利用富集HSC的外周血的大多數研究，是基於性別錯配細胞(sex-mismatched cells)或者遺傳標記細胞的體內移植，供體細胞(donor cells)的檢測是基於Y-染色體或標記基因的存在。已經有了關於使用任一標記系統進行的、在供體細胞檢測中所涉及的陷阱的綜述(Tisdale and Dunbar，2002)。已經描述了下述分化作用，不但分化成造血細胞，而且分化成具有骨骼肌細胞(Gussoni，et al.，1999)、心肌細胞(Orlic，et al.，2001)、內皮細胞(Jackson，et al.，2001)、神經外胚層細胞(Brazelton，et al.，2000)特徵的細胞，和內胚層細胞(Krause，etal.，2001)，包括肝細胞。在這些研究的80％中，新鮮的BM細胞未經預前體外培養而被移植，這樣不能確定具有可塑性的細胞是否能夠進行自我更新的可能性。在大多數的這些研究中，未純化的細胞群或純化得到的部分同質性的細胞被移植，因此，使得無法研究分化細胞的無性繁殖起源或具有次級組織(second tissue)特性的細胞的起源組織。最後，這些研究，依賴於表型性狀，來確定分化為與起源組織不同的細胞的分化作用，但仍不得不證明次級組織的細胞具有那個譜系的功能性狀。因此，本領域需要新的且更好的方法，來體外擴增和增殖未分化的心臟祖細胞(undifferentiated cardiac progenitor cells)。該方法包括在足以使祖細胞生長的條件下，培養分離的未分化祖細胞，其中這些細胞表達Islet1。研究。
發明概述對缺少Islet1——一種LIM同源轉換域轉錄因子——的小鼠的分析已經顯示出心臟發育的一個新模式。Islet1敲除小鼠的心臟完全缺失流出道、右心室和大部分的心房。Islet1的表達和表達Islet1的祖先細胞的譜系追蹤表明，Islet1是未分化的心臟祖細胞群特有的標誌，其產生在isl 1突變體中發現為缺失的心臟節段。Islet1的功能是這些祖細胞形成心臟所必須的。在islet1突變體中，表達islet1的祖細胞在數量上逐漸減少，骨形態發生蛋白(BMPs)和纖維原細胞生長因子(FGFs)被下調。本文中描述的研究定義了兩個生心區(cardiogenic fields)，在它們中，一個表達並需要Islet，另一個則不是如此。這些研究的結果對於特定心臟譜系發育、心臟成環(cardiac looping)、左右不對稱性(leftright asymmetry)、心臟演變(cardiac evolution)和心臟幹細胞具有啟示意義。因此，在一種實施方案中，本發明提供了用於檢測幹細胞的方法，包括測定細胞中Islet1核酸的表達和表達產物。在另一種實施方案中，本發明提供了分離或富集幹細胞的方法，包括將細胞與對Islet1有反應性的試劑相接觸，並將反應陰性細胞和反應陽性細胞分離，從而分離或富集幹細胞。在又一種實施方案中，本發明提供了產生幹細胞的方法，包括將表達Islet 1的未分化祖細胞與激活或增強該細胞中Islet1表達的試劑相接觸，以便激活和增強Islet 1在該細胞中的表達。在再一種實施方案中，本發明提供了擴增和增殖未分化的心臟祖細胞的體外方法。該方法包括在足以使祖細胞生長的條件下，培養分離得到的未分化的祖細胞，該祖細胞表達Islet1。在該方法中，祖細胞足以生長的條件包括在物種特異性的心臟纖維原細胞的滋養層上培養細胞，或者在來自心臟的纖維原細胞的條件培養基中培養細胞。在另一種實施方案中，本發明提供了組合物，其是Islet1陽性幹細胞的富集群，相比起其他細胞類型，包括大於90％的Islet1陽性幹細胞。
附圖簡述

圖1是Islet 1的一個表達序列標籤(EST)的mRNA序列(SEQID NO1)。圖2是Islet 1(小鼠)的DNA序列，可以從GenBank獲得，編號NM_021459XM_354773(SEQ ID NO2)。
發明詳述已經發現，Islet1(SEQ ID NO2)是轉錄因子，是增殖著的心臟幹細胞所特有的一個標誌(FIG 2)。它是至今為止唯一已知的特異性表達在生心幹細胞(cardiogenic stem cells)中，而不表達在分化的心臟細胞中的基因。Islet1是生心幹細胞狀態的主調節子(master regulator)。該發現使得能夠使用islet1表達作為手段來分離內源性生心幹細胞，或產生生心幹細胞。Islet1也在其他祖細胞或「幹細胞」群中被表達，包括胰腺、神經嵴、主動脈-生殖腺-中腎區域(造血祖細胞或內皮祖細胞)和其他細胞類型的祖細胞或「幹細胞」群。該表達——與本文中描述的關於生心幹細胞的數據相一致，顯示了islet不但能標記生心幹細胞，而且也能標記其他多能幹細胞。還不知道有其他基因，它們在最早階段特異性地表達在未分化的生心性前體細胞(undifferentiated cardiogenic precursors)中。Islet1是這一細胞群的獨特鑑定者。Islet1也是這些前體細胞(precursors)幫助心臟發育所必需的。在islet1突變體中，通常源自表達islet1的祖細胞的生心譜系是不存在的。因此，Islet的獨特性在於，它在許多胚胎期不同的多能祖細胞中被表達。Islet是驅動幹細胞狀態的轉錄因子。利用islet1作為標誌，細胞可以從早期胚胎中被分離得到，與螢光標記的islet1抗體雜交，並通過FACS(螢光激活細胞分選術)對幹細胞進行分選。可替代地，基因(例如lacZ、GFP、cre)可以被插入到內源性islet1位點，並用作細胞鑑定或分選的基礎。生心幹細胞系可以通過單獨表達islet1而建立，或通過聯合表達islet1與Nkx2.5而建立，Nkx2.5是另一種轉錄因子，其在心臟祖細胞中被表達，也在分化的心臟細胞中表達。為了使這些生心性前體進行分化，通過遺傳學手段，或通過應用生長因子下調islet1的表達。其他幹細胞系能以類似的方式被創作，或者單獨表達islet1，或者islet1與對不同的譜系具有特異性的其他因子一起被表達，來創製多能細胞，其能分化成多個譜系，或特殊的譜系，這取決於遺傳或物理環境。大量的數據證實了這樣的結論，即islet1是分化之前的生心幹細胞的標誌。該發現導致形成這樣的想法，利用islet1作為工具，在胚胎、新生或成體階段，從各種實驗模式動物和從人中，分離生心幹細胞。可以獲得islet1抗體，以檢測這些細胞群；和使用已知的技術，可以創作在islet1位置插入有GFP的小鼠系。也已經確定，islet在主動脈-生殖腺-中腎區域被表達，該區域對於產生多能造血前體和內皮前體是至關重要的。由本文中描述的研究，若干利用這些幹細胞的治療用途由然而生。例如，本發明提供了方法，用於將不同的細胞類型轉化為生心幹細胞，用於治療用途，例如從心臟患者分離皮膚纖維原細胞或骨髓幹細胞，將這些細胞轉化為生心幹細胞，然後將轉化的細胞注射入患者。該方法可以被用於治療心臟病，包括心梗後疾病(post-infarct)、心力衰竭、缺血性心臟病。其他的應用包括，刺激在分化心臟內的常住生心幹細胞的增殖和/或分化，以修復心臟或改善心臟功能。分離的生心幹細胞可以用於治療藥物篩選，用於毒理學研究，和用於組織工程。在所有這些程序中，來自islet陽性幹細胞的其他不同的細胞譜系也可以被使用，具有對相關人類疾病的用途。本發明基於這樣的發現，兩種生心區的界線與之前期望的不同。一種祖先群表達islet1並將產生流出道、右心室、左心室細胞亞群和大部分的心房細胞。另一祖先群則不表達islet1，且將產生左心室的大部分和一些心房細胞。Islet1在未分化的前體中的特異性表達，也第一次使得能夠準確地觀察到islet1表達祖先群，並給予我們一個重要的手段，用於分離和表徵心臟幹細胞群。Islet1不但定義該幹細胞群，而且也是這些細胞幫助形成心臟所必須的，這為不同的心臟區域提供了第一個的遺傳證據。Islet1(Isl 1)敲除小鼠已被用來檢測運動神經元和胰腺發育的缺陷(Ahlgren et al.，1997；Pfaff et al.，1996)。isl 1純合無效的小鼠在大約ED9.5時，顯示出生長延遲現象，並在大約ED10.5時死亡。而雜合突變體存活下來，且無明顯的表型。儘管懷疑是血管畸形(Pfaff et al.，1996)，但純合突變體死亡的原因在這之前還未被陳述過。因此，查明了isl1-/-小鼠死亡的原因。當對ED9.0至ED9.5之間的純合無效(homozygous null)胚胎進行檢測時，發現嚴重異常的心臟。在總體形態學水平上，突變體心臟看上去由單個的、畸形的、未分裂的腔室組成。組織學分析確認了該印象。作為第一次嘗試去表徵突變體心臟內的細胞之腔室同一性，使用心腔室標記物來進行整體原位雜交分析(whole mount in situhybridization analysis)。心室肌球蛋白輕鏈2(MLC2v)mRNA特異性地標記心室細胞，和A/V連接細胞(Franco et al.，1999)。在這些階段，心房肌球蛋白輕鏈2(MLC2a)mRNA標記所有心肌細胞(Kubalak et al.，1994)。與針對MLC2v和MLC2a mRNAs的探針進行的雜交表明，單個腔室的前面部分內的細胞具有心室同一性，而單個腔室的後面部分中的細胞則不具有心室同一性，並因此可能具有心房同一性。許多轉錄因子區域性地表達於心臟中，一組這些轉錄因子被用於進一步研究isl 1突變心臟內的細胞同一性。在所研究的階段中，tbx5特異性地表達於心臟的後極中，在心房和左心室中(Bruneau et al.，1999)。在islet1突變體中，心臟的心房和心室部分都表達tbx5，這表示突變心臟的心室部分具有左心室同一性。EHand在左心室中被表達，但不在右心室中表達(Cross et al.，1995；Cserjesi et al.，1995；Thomas etal.，1998)。在isl1-/-胚胎中，EHand在整個心室組織中都被表達，這表示它具有左心室同一性，不具有右心室同一性，這與用tbx5探針獲得結果相一致。Tbx20在流出道和A/V通道中被高度表達(Carson et al.，2000；Kraus et al.，2001)。來自islet 1突變體的心臟在心室和心房的連接處表達tbx20，在它們的前端不表達tbx20，這表示無流出道。用msx2的探針獲得了與該結果一致的結果，msx2標記在ED8.5的心臟流出道。Islet1突變心臟的前部無msx2染色。這些數據，同從先前與MLC2a和MLC2v的探針所進行雜交獲得的結果一起，提示儘管存在左心室、AN通道和心房同一性的細胞，islet1突變體缺少流出道和右心室。從該分析推斷出，islet1突變體缺失完整的心臟分隔。此外，突變的心臟不能成環。該結論得到掃描電子顯微鏡分析的支持。令人感興趣的是，在ED 9.0(12體節對(somite pairs))時，isl 1突變體中的心臟原基類似於在ED 8.25(5體節對)時、在較早階段野生型胚胎中所見的心臟原基(Kaufman，1999)，這表示出心臟發育的中斷。在ED 9.5(22體節對)，野生型同胎仔(littermates)與它們的突變對等物的比較顯示，在突變子中不存在流出道和右心室，這與標記物分析一致。isl 1-/-小鼠嚴重的心臟表型使得人們去研究小鼠心臟發育的早期的isl 1表達。利用isl 1和MLC2a mRNAs的探針對ED7.25至ED8.75的胚胎進行單和雙整體原位雜交。後者是分化的生心性前體最早的標誌物之一。該整體原位雜交及隨後的切片分析(section analysis)表明，islet1決不與MLC2a共表達，相反，在緊靠的細胞群處被表達。在早期生心新月階段(cardiogenic crescent stages)，islet1表達細胞是在MLC2a表達細胞的中部和背部。隨著心管形成時，內臟間質中的islet1陽性細胞在它們的整個延伸範圍內，包括前面區域和後面區域，與MLC2a陽性細胞相鄰，其中內臟間質包括心繫膜並靠近前腸內胚層。Islet1不但在髒壁中胚層中被表達，也在腹前腸內胚層中被表達。儘管islet1不在分化的MLC2a陽性心肌前體中被表達，但是它在最近鑑定的心臟次級或前心區(secondary or anterior heart field)區域中，也就是咽區域的髒壁中胚層細胞中表達。最近的證據指出，小鼠心前區幫助形成流出道(Kelly and Buckingham，2002)。該發現——與islet1突變體中的心臟表型相一致——顯示出islet1表達細胞可能幫助形成心臟的流出道。為了研究該問題，進行isl 1表達細胞的譜系分析，這通過將islet-1-cre小鼠(Srinivas et al.，2001)和Rosa26-lacZ指示小鼠(Soriano，1999)雜交來進行。在該雜交的子代中，Cre-介導的切除使得lacZ基因處於普遍表達的Rosa26基因座的控制之下，使得通過針對β-半乳糖苷酶活性的染色方法從而對表達isl 1的細胞的命運進行跟蹤成為可能，既便是從內源性isl 1基因座而來的轉錄已被抑制。這一分析的結果是令人吃驚的，並且表明先前表達islet1的細胞對胚胎心臟具有實質性貢獻，包括位於流出道、右心室和心房中的大部分細胞，也有助於形成左心室的特殊區域。β-半乳糖苷酶陽性細胞也在心內膜內被觀察到，和在襯裡於主動脈弓動脈的內皮細胞中被觀察到，內皮細胞襯著主動脈弓動脈(aortic arch arteries)。多數的β-半乳糖苷酶陰性心肌細胞在左心室的腹側面和左心房的前腹區域被觀察到。觀察到，islet1-表達細胞貢獻了發育成為心臟的大部分細胞，該觀察結果與我們先前在isl 1純合突變體小鼠中對心臟表型所作的分析相一致，在該突變體小鼠中，整個心臟分割都缺失。缺失的結構表明，Islet1可能對於表達islet1的生心前體的增殖、存活和/或遷移是所必需的。為了致力於解決該問題，人們嘗試去檢測isl 1突變體和同胎幼崽對照中的isl 1表達細胞。儘管isl 1基因的靶向結構被刪除了第三外顯子，——第三外顯子包含第二LIM區域——isl 1 mRNA的5′端依然在突變體中被表達，這使得可以檢測突變體細胞中的islet1信使。然而，Islet蛋白是不能被檢測到的(Pfaff et al.，1996)。為了追蹤突變體和野生型胚胎中的isl 1表達細胞，用isl 1mRNA的探針，對ED8.5-ED10的胚胎進行整體原位雜交分析。這些分析的結果證明，儘管一些細胞仍然存在，但是在突變體中islet-表達細胞卻日漸減少。結合isl 1突變體的心臟表型，這些結果表明，Islet是細胞增殖和/或細胞存活所必需的。這些研究結果顯示，Islet1是生心前體增殖和存活所必需的細胞，也顯示，Islet1的下遊靶物質(downstream targets)調控該效應。兩個生長因子通道是骨形態發生蛋白(BMPs)和纖維原細胞生長因子(FGFs)，它們涉及脊椎動物和無脊椎動物心臟發育中的生心前體的生長和存活(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)。許多BMPs和FGFs已被描述為表達在胚胎區域，其與islet1-表達細胞相重疊，和/或臨近islet1-表達細胞，包括BMPs 2、4、6和7，和FGFs 4、8和10(Crossley andMartin，1995；Dudley and Robertson，1997；Kelly et al.，2001；Lyons et al.，1995；Niswander and Martin，1992)。為了測定是否這些BMPs和FGFs中的任何一個是Islet1作用的靶(目標，targets)，用這些生長因子基因的探針進行整體原位雜交。該分析的結果表明，在isl無效小鼠中，這些基因中的每一個的表達水平下降。在與islet1表達重疊的區域，這些生長因子中一些表達急劇下調或未被檢測到，包括BMP4、BMP7和FGF10的表達。這些基因可能是Islet的直接或間接目標。其他BMP和FGF基因的表達依然存在，但是在與islet1表達重疊的區域，表達區域減少，這與在islet1突變體中對islet1 mRNA的觀察結果相類似。該減少能反映出表達這些生長因子的細胞數量的減少。本文中描述的數據顯示，產生流出道的祖先也產生右心室和心房中的大部分細胞，和左心室內的細胞亞群。因此，之前描述的二級(secondary)或前心區是這些祖先群(progenitor population)的亞群，其以islet1表達為特徵。Islet1功能是這些細胞成為心臟所必需的。在缺乏Islet1時，其形成的心臟缺失正常情況下由islet1表達祖先所貢獻的分割(segments)。區別是，將產生大部分的左心室細胞和心房細胞亞群的祖先不表達islet1，並且能夠產生心臟細胞，其具有在缺失Islet1功能下的這些標識特徵。在islet1突變體中心臟的外觀和表徵，和islet1表達的分析和islet1祖先的原基分布作圖，已經導致產生新的心臟發育工作模式。在該模型中，在正中線的生心性中胚層的第一突出分隔(protruding segments)首先分化，不表達islet1，並將產生左心室和一些相鄰心房內的大部分的細胞。當Islet1表達祖先加入「初級」心臟分割時，它們遷入進來，同時日益增多地進行分化並下調islet1表達，以形成右心室、流出道和心房剩餘部分的大部分細胞。應該注意到，islet1表達祖先的很大數量的子代在左心室內、在與右心室的連接區域、在小梁內，和沿著向內彎曲的壁處被發現，微微向下延伸至左心室的背壁。在心臟發育的最早階段，當相鄰的間質與正分化的心肌相鄰時，islet細胞細胞遷入貫穿心肌的整個前部-後部區域中。在後面的階段中，islet祖先通過兩個區域遷移入心臟，這兩個區域保持與背體壁(dorsalbody wall)的內臟間質的連接。在前部，這是主動脈囊的區域；在後部，是心背繫膜(dorsal mesocardium)。前面利用分子標記對人心臟發育進行解剖學分析，表明心臟外間質——其通過心背繫膜遷移進來，形成心房和心房-心室分隔(Lamers and Moorman，2002)。對於初級心房七分隔(primary atrialseptem)前沿上的間質帽(mesenchymal cap)是否起源於該心臟外中胚層，或是否從墊狀內皮(cushion endothelium)衍生而來有爭論。利用islet1譜系分析，該問題現在可以最終解決了。此外，研究islet-衍生心肌細胞在心臟分隔中的作用將引起人們的注意。有趣的是，注意到islet-表達祖先的子代明顯分布於與發育傳導系統的標記相符的區域中，這表明該分布群在傳導系統發育中發揮主要作用(Rentschler et al，2002；Kondo et al，2003)。本文中描述的數據證明，Islet1不存在時，表達islet1的生心祖先未充分地幫助形成心臟，並且數量減少，這證明Islet1是這些祖先增殖和/或存活所必需的。Islet1祖先的大部分子代不存在於isl 1-/-突變體心臟中的觀察現象表明，Islet1也是遷移所必需的。當前體分化時，Islet1表達被下調，這表明在生心前體中，Islet的功能可能是維持未分化狀態所必需的，和/或可能與分化的狀態不相容。Islet1也是運動神經元中細胞存活中所必需的，但是在分化的細胞中表達並發揮作用(Pfaff et al.，1996)。在胰腺發育中，Islet1的功能在胰腺間質中和在分化的islet細胞中是所必需的(Ahlgren et al.，1997)。肌細胞分化之後的心臟生長導致人們認為，分化的肌細胞廣泛地增殖，導致心肌生長。表達islet1的前體遷移入心臟，表明該遷移也能導致心臟的某些生長。然而，在islet1突變體中，非-islet表達祖先發生分化，並進行擴張，這表明分化的前體的遷移和增殖在生心性生長中發揮作用。islet1突變體的心臟似乎沒有經歷成環形態形成(Loopingmorphogenesis)，是因為心室節段保持在心房節段之前。該觀察資料表明，islet1表達祖先遷移入心臟與成環形成發生過程密切相關。環形成發生過程(Looping morphogenesis)可能不但是心肌生長、而且是islet1-表達細胞遷入到心臟中的結果。除了在生心中胚層被表達外，islet1也在咽內胚層中表達，咽內胚層是已經被證明在心臟發育中發揮重要作用的組織(Lough et al，)。這產生這樣的可能性，在生心祖先中對islet的需求可能不是細胞自主的。進一步的實驗將直指該問題。本文中描述的研究證明，Islet1界定了生心區(cardiogenic fields)中的一個，並且是該一個生心區所必需的。也引起人們的興趣去了解可能類似地為其他的非islet表達區所必需的其他基因。在本文上下文中，應該注意到Nkx2.5敲除小鼠具有突變的心臟，該突變心臟具有流出道、右心室細胞和心房細胞(Harvey et al，1999；Tanaka et al，1999)。許多左心室同一性標記不存在，這表明不具有左心室同一性。這些觀察現象產生這樣的可能性，即Nkx2.5是由非islet表達祖先形成心臟組織所必需的。倘若islet1和kx2.5無效小鼠的表型形成鮮明對比，儘管Nkx2.5在Islet方式中明顯不是必需的，Nkx2.5也可能在islet-表達心臟區中發揮作用。產生islet1和Nkx2.5雙重突變的小鼠，可以用於評價這些可能性。已經顯示，在Nkx2.5敲除的小鼠中，islet1 mRNA表達被保留(未公布觀察結果)。如上所討論，Islet1陽性祖先(Islet1 positive progenitors)可以影響心臟成環形態形成(cardiac looping morphogenesis)。心臟成環作用的發生以左-右方向為特徵，流出道和右心室向右成環。左-右軸信息的微擾(Perturbation)導致心臟的內臟逆位，流出道和右心室向左成環。心房異構(Atrial isomerism)也可以產生。本文中描述的數據證明，流出道、右心室和大部分心房細胞衍生於islet-表達祖先細胞，這表明賦予這些前體的左-右信息將是左右心臟不對稱的關鍵的決定因素。遺傳標記的先前研究已經表明最初的左右軸信息保持於心房的排列中，但是在心室中被旋轉。也就是，「左」和「右」心室不是嚴格地與左和右體軸(body axis)相對應(Campione et al.，2001；Franco et al.，2000)。我們的發現，即左和右心室源於不同的生心區，給予這一個觀察資料更深層次的理解。有價值的是，依據islet祖先細胞群來重新檢測心臟的左右結構模式，以便研究涉及在細胞進入心臟之前將左右信息賦予這些細胞的基因，以及它們相對於其原始左-右方向定位、在心臟內的隨後定位。類似地，檢測賦予非-islet表達祖源的左右同一性，和在發育的心臟內的左右分隔的最終定位是有價值的。同源轉換區轉錄因子(homeodomain transcription factor)，pitx2，在左-右通道的下遊，在左外側中胚層中被特異性表達，並在後期發育中保持區域劃分狀態(Capdevila et al，2000)。最近分析證明，pitx2在生心新月體(cardiogenic crescent)的區域中被不對稱地表達，並且隨後在左心房而不是在右心房中被表達，也表達在流出道、右和左心室的不同部分中(Campione et al，2001)。非常感興趣的是，去研究pitx2在islet-表達祖先中的潛在的不對稱表達，並可能使用pitx2表達作為標誌去研究islet1-表達祖先所採用的遷移途徑。在這點上，在ED9.5，pitx2c不對稱性地表達在鰓弓和髒壁中胚層中，其與主動脈囊相鄰(Liu et al，2002)。Pitx2被敲除的小鼠無法存活下來，並展示出許多心臟表型，儘管心臟依然明顯向右成環(Capdevila et al，2000)。在islet1範例的上下文中，重新檢測pitx2無效表型，和左右心臟不對稱的其他組織是引人矚目的。缺少Islet導致表達islet的生心前體細胞數量減少，這表明可以擾亂生長因子信號(growth factor signaling)。因為FGF和BMP信號是心臟發生所必需的(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)，我們檢測了許多BMP或FGF生長因子的表達，這些生長因子在表達islet1的生心祖先中或與表達islet1的生心祖先相鄰的地方被表達。本文中描述的數據證明，每一檢測的生長因子選擇性地在與表達islet1的生心前體的相重疊的區域顯著被下調或減少。Islet1突變體顯示出，在fgf8表達區域中的總體減少，但它們的表型比起具有fgf8亞效等位基因所看到的表型更嚴重。敲除fgf4或fgf8的小鼠是早期胚胎致死型的。但是fgf8是亞效等位基因的小鼠在出生時死亡，這是由於心血管缺陷的緣故，包括流出道畸形(Abu-Issa et al.，2002；Feldman et al.，1995；Frank et al.，2002；Sun et al.，1999)。在islet1突變體中，fgf8表達實質上在islet1-表達生心前體中是不存在的。敲除fgf8的小鼠在出生時死亡，這歸因於它們的肺表型(Sekine et al.，1999)。然而，儘管明顯不如islet心臟表型嚴重，可能有未被描述過的心臟表型。BMP4和BMP7，以高度重疊的方式，被表達islet的生心前體共表達。BMP2和BMP6以與BMP4、BMP7不同方式表達，或以彼此不相同的方式被表達，但是它們的表達也與islet1的表達相重疊。在islet1突變體中，這些生長因子中的每一個的表達在與islet表達相一致的區域被大大減少或表現缺乏。對這些BMPs中的每個進行了敲除，對BMP6/7進行了雙敲除(Kim et al.，2001；Winnier et al.，1995；Zhang andBradley，1996)。這些突變體中的任何突變體都沒有重演islet突變體的心臟表型，這是由於在植入或原腸胚形成中的早期缺陷的緣故，或者，如果它們經受得住較早缺陷而存活下來，可能是功能性豐餘(functionalredundancy)的緣故。我們的結果表明，在islet突變體中的心臟表型可能全部或部分是或者FGF或者BMP或兩者信號缺陷的緣故。要將這些可能性辨別開來，將需要進一步的實驗，來將islet表達祖先中的這些信號通路去除。此外，islet突變體中的其他生長因子通路可能受到影響。考慮到許多實驗已經證明脊椎動物心臟從咽或腸中胚層演化而來(Haun et al.，1998；Park et al.，1998；Ranganayakulu et al.，1998)，islet1在咽和前腸區域的髒壁中胚層中的表達引人矚目。先前的數據已經證明，islet在小雞生心前體中被表達(Yuan and Schoenwolf，2000)。對於小鼠islet，存在islet的果蠅同系物，其在運動神經元發育中具有作用；並且吸引人的是，它在背脈管(dorsal vessel)中被表達(Thor and Thomas，1997)。非常令人感興趣的是去檢測islet在其他物種心臟發生中的作用，來獲得對心臟進化的更深的認識。結果可以表明，islet-表達祖先，用進化術語來說，是「初級的」。如果是這樣的話，它可能表明左心室是較晚的進化發育。令人感興趣的是，在斑馬魚中——其具有單個心室——，Dhand是存在的，Dhand是高等脊椎動物中的右心室的標誌物，然而未發現它的左心室中的對等物EHand的同源物ngelo，Lohr，Lee，Ticho，Breitbart，Yost，2000)。也許，在我們對islet在心臟發生中的作用的發現中，最令人興奮的方面之一是利用Islet1作為生心幹細胞狀態的標誌來進行預測。幹細胞可以定義為祖細胞，其增殖並產生許多不同的譜系。Islet1-表達細胞符合該定義，產生許多不同的心臟譜系。Islet1在分化之前的細胞中表達的獨特特性，將使得能依據islet1表達進行細胞分選。此外，Islet1在指令這些細胞增殖和/或存活中的作用表明，Islet1，與其他因子一起，可以被用於驅動生心幹細胞的狀態。基於上面描述的這些深思熟慮以及在證據A(Exhibit A)中所闡述的——其通過參考併入本文，我們成功地鑑定到了小鼠、鼠類和人類非-肌細胞培養物中的稀有細胞群(rare cell population)，其能夠在體外被擴增和繁殖。這些細胞不但分化成中胚層譜系，而且分化成神經外胚層。我們能夠顯示，能夠體外分化成至少兩個胚層的細胞能夠從嚙齒類動物和人心臟選擇出來。Islet-1(isl 1)，是一種LIM-同源轉換區轉錄因子，標識了這些未分化的祖細胞，並使該生心前體群在成體心臟中是現顯的。因此，這些細胞被命名為i-細胞(i-cells)。未分化的i-細胞的培養，如在下面實施例1中闡述的，揭示了生心前體群只能在無分化作用下進行培養，並且在種屬-特異性的心臟纖維原細胞的滋養層上衰老。類似的滋養細胞-依賴型(feeder-dependent)培養條件被用於分離小鼠和人ES細胞，且此類滋養層被證明對於將它們維持在未分化的狀態下是至關重要的(Donovanand Gearhart，2001)。對從心臟纖維原細胞獲得的飼養細胞或條件培養基(conditioned medium)的需求表明它們提供抑制多能祖細胞的分化或促進多能祖細胞自我更新的因子。具有這些特性的活性稱為i-細胞的分化-抑制活性(differentiation-inihibiting activity of i-cells)(DIAI)。對於鼠類ES細胞，白血病抑制因子(LIF)，其為有關白細胞介素-6的細胞因子家族的成員，可以替代對飼養細胞的需求(Nichols，et al.，1990)。為了抑制LIF受體信號組分的鼠類ES細胞分化激活作用，糖蛋白130(gp 130)是必要和充分的。然而，人ES細胞和心臟i-細胞似乎不需要LIF，以便用於阻斷分化作用和刺激自我更新(Thomson，et al.，1998)。直到現在，還沒有建立起這樣的體外培養條件，其允許多能的成體幹細胞擴增和繁殖。成體HSCs或NSCs(dult HSCs or NSCs)，在體內定義為長期再生細胞(long-term repopulating cells)，不能在培養物中被擴增，而不失去發育潛力(Weissman，2000)。但是最近的一個研究顯示，從骨髓得到的間質幹細胞，能夠在特定的條件下，在培養基中無限生長(Jiang，et al.，2002)。本發明也提供了細胞的組合物，包括富集的isl 1陽性幹細胞群。相比起其他細胞類型，該組合物優選含有大部分的或至少約90％isl 1陽性幹細胞。isl 1陽性幹細胞由任何心臟組織衍生而來，諸如從大鼠、小鼠或人的心臟組織。因為未分化狀態的表型特徵，已經發現i-細胞在細胞核中表達高水平的isl 1，和在胞質中表達高水平的巢蛋白(nestin)，巢蛋白是標誌未分化NSCs的中間絲。此外，細胞顯示出低水平地表達Nkx2.5和ES細胞轉錄因子oct-4，Nkx2.5是果蠅鐵匠基因(tinman)的同源框脊椎動物同系物。因此，這些標誌物可以被用於鑑定i-細胞。Isl 1對於運動神經元和胰腺發育是至關重要的(Pfaff，et al.，1996)。敲除isl 1的純合胚胎在大約ED 10.5死亡，這是由單心室的未分開的心臟-腔室以及流出道血管畸形所造成的(Cai，et al.，2003)。isl 1表達細胞的譜系分析揭示這些細胞在實質上有助於形成(substantiallycontribute)胚胎心臟，包括在流出道中的大部分細胞、右心室和兩心房(Cai，et al.，2003)。在新生兒和成體心臟中，isl 1表達的下調允許在心肌層看到生心前體。免疫組織化學顯示，在成體心臟中的isl 1表達細胞主要位於右心室、隔膜和心房中。在未分化的前體細胞中，isl 1在核中被高水平的表達，並在i-細胞分化期間被下調。Islet表達在體外和體內成為生心幹細胞群的標誌，並看上去是這些幹細胞分化和存活所必需的。在未分化狀態下，Nkx2.5也在i-細胞中被表達。該轉錄因子是脊椎動物心臟發育最早的標記物之一，並且對於心臟-限制性基因活性的調節是重要的。POU-域轉錄因子oct-4是多能ES細胞的分子標記物。Oct-4在原腸形成前期胚胎、早期卵裂-期胚胎(early cleavage-stageembryo)、胚泡內細胞團(inner cell mass)的細胞、和胚胎癌細胞中被表達。在成體動物中，oct-4僅在生殖細胞和間充質幹細胞中被發現(Rosner，et al.，1990)。在本發明中，新型心臟祖細胞群(progenitor population)已被發現、分離和鑑定。Isl 1表達標記這些生心幹細胞，並似乎是這些細胞分化狀態和存活所必需的。這些細胞對研究和理解心臟幹細胞分化和生長的信號通路，為先天性和成體心臟病的未來治療應用鋪平了道路。神經細胞或肌細胞中具有進一步分化作用的i-細胞中的基因靶向(gene targeting)，使得進行細胞生物學研究，而避免了與耗費時間的動物模型的複雜性相關的鬥爭。細胞培養的目標是開發明確的、並容易操作的實驗體系，其賦予克隆均勻性的優點和操縱外部環境的能力。而且，由於倫理上不能接受通過實驗的方式改變人種系，ES細胞轉基因路線對於涉及人基因操作的實驗是不可行的。在人i-細胞中進行基因靶向，使得在嚙齒類動物模型系統不能充分重演(recapitulate)人生物學或疾病過程的領域的重要應用成為可能。此外，I-細胞可以作為心臟和神經元細胞治療的供體組織的來源予以應用。早期的胚胎幹細胞對於以細胞為基礎的治療具有不利之處(i)轉化的數量和(ii)獲得特異性分化表型所需要的信號的複雜性。相反，發育中的i-細胞和來源於成體的心臟祖先細胞的表型分化避開了倫理上和免疫學上的約束。i-細胞的交叉-譜系轉化(Cross-lineage transformation)，為獲得更為靈活的組織來源提供了一個新的途徑，特別是從病人本身獲得自體移植物。i-細胞相比起ES細胞還有一個先進之處，在於這些前體細胞，在異種移植物中，比起初級胚胎肌細胞，具有較少的免疫原性，這就為克服來自非-人供體移植中的主要困難之一開闢了道路。本發明方法利用分離的單克隆抗體，該抗體特徵為特異性地結合Islet 1多肽並免疫沉澱Islet 1多肽。本領域已知的和本文中描述的任何合適的免疫測定形式，都可以被用於檢測Islet 1-表達細胞在不同的細胞群中的存在和/或對在不同的細胞群中的Islet 1-表達細胞進行定量。儘管可以使用任何類型的抗-Islet 1多肽抗體，如本文中描述的，其特異性結合Islet 1多肽，但是優選的是單克隆抗體。本發明對Islet 1多肽的免疫學測試，可以通過使用本領域已知的任何技術、以高通量形式被使用，諸如FASC篩選，下面將對其進行更加詳細地描述。適合於結合到本發明方法所使用的抗體上的可檢測標記物——包括高通量篩選形式方法，包括通過使用各種化學連接基團或雙功能肽接頭連接到抗體上的放射性標記物。末端羥基可以用無機酸進行酯化，例如32p磷酸或14C有機酸，或者以另外方式酯化，以便為標記物(label)提供連接基團(linking groups)。有意用作可檢測標記物的酶將首先是水解酶，特別地是酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。螢光化合物包括螢光素和它的衍生物，若丹明和其衍生物、丹磺醯(dansyl)、傘形酮、和諸如此類物質。化學發光劑(Chemiluminescers)包括螢光素和2，3-二羥酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)(例如鄰苯二甲基肼)和類似物。抗體也可以被附著到固體支持物上，其特別用於Islet 1多肽的免疫測定或免疫沉澱反應。此種固體支持物包括，但是不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯，例如蛋白G覆蓋的微量板或珠的孔。針對特異性表位或表位組合的抗體，這樣與Islet 1多肽特異性結合，將使得能篩選本文中描述的細胞群。通過使用此類單克隆抗體，可以利用各種篩選技術，並包括使用抗體-塗覆的磁珠的磁分離，用附著到固體基質(即板子)上的抗體「淘洗(panning)」和流式細胞分析術(參見例如美國專利5,985,660；和Morrison et al.，Cell，96737-49(1999))。在本發明方法中有用的抗體可以用任何本領域已知的方法測定其免疫特異性結合特性。可以使用的免疫測定包括，但不限於競爭性和非-競爭性測定系統，使用技術諸如蛋白質印跡、放射性免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「夾層」免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應(gel diffusion precipitin reactions)、免疫擴散測定、凝集測定(agglutination assays)、補體結合測定(complement-fixation assays)、免疫放射量測定、螢光免疫測定、蛋白A免疫測定諸如此類。此類測定是常規的並且是本領域熟知的(參見例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley Sons，Inc.，New York，其通過參考整體併入本文)。示範性的免疫測定方法在下面被簡要描述(但決不為了限制的目的)。免疫沉澱反應的方案一般包括在裂解緩衝液中裂解細胞群，裂解緩衝液諸如RIPA緩衝液(1％NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH 7.2，1％Trasylol)，補充以蛋白質磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、釩酸鈉)，將感興趣的抗體加入到細胞裂解物中，在4℃下，溫育一段時間(例如1-4小時)，將蛋白質A和/或蛋白質G瓊脂糖珠加入到細胞裂解物中，在4℃下溫育約1小時或更多時間，在裂解緩衝液中洗滌珠子，和將珠子重新懸浮於SDS/樣品緩衝液。例如通過蛋白質印跡分析可以測定感興趣的抗體免疫沉澱特定抗原的能力。本領域技術人員知道，關於這些參數可以被修改以增加抗體與抗原的結合作用和減少背景(例如，用瓊脂糖珠預先洗滌細胞裂解物)。對於涉及免疫沉澱反應方案的進一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley Sons，Inc.，New York at 10.16.1。蛋白質印跡分析一般包括製備蛋白質樣品；蛋白質樣品在聚丙烯醯胺凝膠中電泳(例如，8％-20％ SDS-PAGE，這取決於抗原的分子量)；將蛋白質樣品從聚丙烯醯胺凝膠轉移到膜上，諸如硝酸纖維素、PVDF或尼龍；在封閉溶液(例如，含3％BSA或脫脂奶粉的PBS)中封閉膜；在洗滌緩衝液(PBS-Tween 20)中洗滌膜；用在封閉緩衝液中稀釋的初級抗體(感興趣的抗體)對膜進行封閉；在洗滌緩衝液中洗滌膜；用在封閉緩衝液中稀釋的二級抗體(其識別初級抗體，例如抗-人抗體)對膜進行封閉，二級抗體偶聯到酶解基質(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)或偶聯到放射活性分子(例如32P或125I)上；在洗滌緩衝液中洗滌膜；並檢測抗原的存在。本領域技術人員將對這些參數是可以知曉的，它們被修改以增加被檢測到的信號和減少背景噪音(backgroundnoise)。對於關於蛋白質印跡分析方案的進一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley Sons，Inc.，New York at 10.8.1。ELISAs包括製備抗原，用抗原包被96孔微量板的孔，將偶聯有可檢測化合物諸如酶促基質(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)的感興趣的抗體加入到孔中，並溫育一段時間，並檢測抗原的存在。在ELISAs中，感興趣的抗體不必結合到可檢測的化合物上；相反，結合到可檢測化合物上的二級抗體(其識別感興趣的抗體)可以被加入到孔中。還有，代替用抗原包被孔，抗體可以被用來包被孔。在該情況下，在將感興趣的抗原加入到包被的孔中之後，結合到可檢測化合物上的二級抗體可以被加入。本領域技術人員知道，參數可以被修改以增加被檢測到的信號，以及也知道本領域已知的其他變化。對於關於ELISAs的進一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley Sons，Inc.，New York at 11.2.1。通過競爭性結合測定方法，可以測定抗體對抗原的結合親和力，以及抗體-抗原相互作用的解離率(off-rate)。競爭性結合測定的一個例子是放射性免疫測定，包括用感興趣的抗體，在增加數量的未標記抗原的存在下，溫育標記的抗原(例如，3H或125I)；並檢測結合到標記的抗原上的抗體。由用斯卡查德圖分析獲得的數據，能夠測定感興趣的抗體對特異抗原的親和力，和結合解離率。與二級抗體的競爭也能使用放射性免疫測定來確定。在這種情況下，在增加數量的未標記的二級抗體的存在下，用結合到標記的化合物(例如3H或125I)上的感興趣的抗體溫育抗原。用於本發明測定中的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體或它們的功能活性片段。針對islet 1多肽的單-或多-克隆抗體在合適的宿主動物中產生，這是通過使用本領域已知的常規技術、用免疫源性偶聯物對動物進行免疫而產生。單克隆抗體的製備方法已被如Kohler and Milstein，Nature256495-7，1975；和Harlow et al.，inAntibodiesa Laboratory Manual，page726(Cold Spring Harbor Pub.，1988)所公開，這些公開資料通過參考併入本文。簡言之，單克隆抗體可以通過下述方法獲得用包含本發明免疫原性偶聯物——上面已公開了它的製備——的組合物注射小鼠或其他小型哺乳動物，諸如兔，通過取出血清樣品確認抗體產物的存在，取出脾以獲得B淋巴細胞，將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，克隆該雜交瘤，篩選針對抗原產生抗體的陽性克隆，和從雜交瘤培養物中分離抗體。通過各種業已建立的技術，單克隆抗體可以從雜交瘤培養物中分離和純化得到。此種分離技術包括利用蛋白A-瓊脂糖的親合層析，大小排阻層析和離子交換層析。參見，例如Barnes etal.，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，inMethods in Mol.Biol.，1079-104，1992)。本發明的抗體也可以來自亞人類靈長類動物(subhumanprimate)抗體。在狒狒中產生抗體的通用技術可以參見例如Goldenberget al.，國際專利公布WO91/11465(1991)和Losman et al.，Int.J.Cancer，46310-314，1990。也能使用抗-獨特型技術(anti-idiotype technology)產生單克隆抗體，其模擬一個表位。例如，為第一單克隆抗體製備的抗-獨特型單克隆抗體，將在高變區具有結合區域，這是被第一單克隆抗體結合的該表位的「像(image)」。本發明中使用的術語「抗體(antibody)」包括完整的分子以及其功能片段，諸如Fab、F(ab′)2和Fv，它們能夠結合islet 1多肽，這些功能性抗體片段定義如下(1)Fab，是包含抗體分子的單價抗原-結合片段的片段，能夠通過用酶——木瓜蛋白酶消化整個抗體，產生一個完整的輕鏈和一個重鏈的一部分而製備得到；(2)Fab′，是抗體分子的片段，其通過用胃蛋白酶處理整個抗體，然後還原，產生完整輕鏈和部分重鏈而製備得到；每個抗體分子得到兩個Fab′片段；(3)(Fab′)2，是抗體片段，其通過用酶——胃蛋白酶處理整個抗體而製備得到，無需隨後的還原作用；F(ab′)2是兩個Fab′的二聚物，通過兩個二硫鍵固定在一起；(4)Fv，定義為遺傳工程片段，包含表達為兩條鏈的輕鏈的可變區和重鏈的可變區；和
(5)單鏈抗體(Single chain antibody，″SCA″)，是遺傳工程分子，包含輕鏈的可變區和重鏈的可變區，通過合適的多肽接頭連接，作為遺傳融合單鏈分子。製備這些片段的方法是本領域已知的。(參見如Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1988，通過參考，併入本文)。如本發明中所使用的，術語「表位(epitope)」指抗原上的任何抗原決定簇，抗體的互補位與其結合。抗原決定簇通常由分子的化學活性表面定群(grouping)諸如胺基酸或碳水化合物側鏈組成，通常具有特異性的三維結構特徵，以及特異性電荷特徵。本發明的抗體片段可以通過對抗體進行蛋白質水解作用製備，或通過在大腸桿菌中表達編碼該片段的DNA而製備得到。抗體片段可以通過常規的方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個抗體而獲得。例如，抗體片段可以通過用木瓜蛋白酶酶切抗體，給出稱為F(ab′)2的5S片段而生產得到。該片段可以進一步使用硫醇還原劑進行切割，和任選地，使用針對由二硫鍵切割產生的巰基基團的任意封閉劑，從而產生3.5S Fab′單價片段。可選擇地，使用木瓜蛋白酶的酶切，直接產生兩個單價Fab′片段和一個Fc片段。這些方法例如被Goldenberg，美國專利4,036,945和4,331,647，以及該專利包含的參考文獻所描述，這些專利通過參考整體併入本文。也參見Porter，R.R.，Biochem.J.，73119-126，1959。切割抗體的其他方法，諸如分離重鏈以形成單價輕-重鏈片段，對片段的進一步切割，或其他酶促的，化學的，或遺傳技術也可以被使用，只要片段能夠結合被完整抗體所識別的抗原就可以。Fv片段包括VH和VL鏈的締合體。該締合可以是非共價的，如Inbar et al.，Proc.Nat′l ilcad.Sci.USA692659-62，1972中所述。可選擇地，該可變鏈可以通過分子間二硫鍵連接或通過化學試劑諸如戊二醛進行交聯。優選地，這些Fv片段含有通過肽接頭連接的VH和VL鏈。這些單鏈抗原結合蛋白(sFv)通過構建包括編碼VH和VL區域的DNA序列的結構基因製備而得，其中VH和VL區域通過寡核苷酸連接起來。結構基因被插入到表達載體，其隨後被導入宿主細胞，諸如大腸桿菌。該重組宿主細胞合成單個多肽鏈，以連接肽連接兩個V結構域。產生sFvs的方法，由下述文獻描述，例如Whitlow and Filpula，Methods，297-105，1991；Bird et al.，Science242423-426，1988；Pack etal.，Bio/Technology111271-77，1993；和Ladner等美國專利4,946,778，其通過參考整體併入本文。抗體片段的另一種形式是編碼單個互補-決定區(CDR)的肽。CDR肽(「最小識別單位(minimal recognition units)」)可以通過構建編碼感興趣的CDR的基因而獲得。此類基因，例如通過使用聚合酶鏈反應，從抗體-產生細胞的RNA合成可變區而製備得到。參見例如Larrickand Fry，Methods，2106-10，1991。本發明方法使用單克隆抗體，該抗體以特異性結合islet 1多肽為特徵，其中，Islet 1多肽保留功能活性。產生單克隆抗體——其用於本發明方法來免疫捕捉Islet 1多肽——的雜交瘤細胞系可以從商業渠道獲得。下面的實施例旨在舉例說明本發明，而不是限制本發明。
實施例1實驗程序小鼠突變體產生islet無效突變體的方法已經在前面描述(Pfaff et al，1996)。敲除構建物剔除了編碼Islet 1第二個LIM結構域的外顯子。Islet1-cre小鼠通常由Thomas M.Jessell提供，且在之前已經被描述過(Srinivas etal，2001)。IRES-cre盒(cassette)被插入到編碼Islet1第二個LIM結構域的外顯子中，破壞islet基因的表達。
整體RNA原位雜交分析(Whole Mount in situ Hybridization)整體RNA原位雜交分析按照之前描述的方法進行(Wilkinson，1999)。有關所被使用的特異性RNA探針的參考文獻如下MLC2a(Kubalak et al.，1994)；MLC2v(O′Brien et al.，1993)；tbx5(Bruneau et al.，1999)；tbx20(未公開的結果)；BMP2、BMP6、BMP7、BMP4、BMP5(Kim et al.，2001；Lyons et al.，1995)；FGF4、FGF8和FGF10(Feldman etal.，1995；Sun et al.，1999)；EHand(Cross et al.，1995)；islet1(EST，GenBank編號AA198791)(SEQ ID NO2)；msx2(Liu et al.，1994)。利用異羥洋地黃毒苷配基和螢光素-標記探針進行雙RNA原位雜交，這些探針偶聯有鹼性磷酸酶(Roche Cat.#1277073，1685619)。染色反應採用如下物質進行採用CIP/鐵氰化物/氰亞鐵酸鹽，依據全球資訊網上的Janet Rossant’s實驗室方案網址(mshri.on.ca/rossant/protocols/doubleINsitu)和MagentaPhos-tet Red，依據全球資訊網上的Claudio Stem′s實驗室方案網址(sternlab.anat.ucl.ac.uk/INSITU)；或者，採用Fast Red(Roche Cat.No.1496549)和BCIP(鹼性磷酸酶的生色底物)；單獨地。溫育和染色以檢測第一抗體(抗-螢光素-AP，Roche Cat.No.1426338)之後，胚胎在65℃溫育1小時，以使得鹼性磷酸酶活性發生失活，並在溫育之前洗滌，與第二抗體溫育和染色以檢測第二抗體(抗-異羥洋地黃毒苷配基-AP，Roche Cat.No.1093274)。對於用Fast Red染色的胚胎，其中FastRed可溶於乙醇，製備冷凍切片。對於用BCIP/鐵氰化物/氰亞鐵酸鹽和MagentaPhos-tet Red染色的胚胎，製備石蠟切片，在乙醇中快速洗滌以最小化信號損失。
掃描電子顯微術可以利用心臟掃描電子顯微術(SEM)的標準程序(Pexieder，1986)。簡要地，將胚胎進行乙醇脫水作用，和由氟利昂113至氟利昂23的臨界點乾燥。乾燥的標本置於SEM管上，用300nm金進行離子噴濺，並在掃描電子顯微鏡中檢測。以標準取向(orientations)和放大倍數，拍攝SEM顯微照片。
實施例2未分化的I-細胞的培養要從鼠類心臟分離心臟祖先，所使用的方法類似於那些用於從成年器官分離心肌細胞的方法。在胰蛋白酶-消化狀態，i-細胞和心臟纖維原細胞具有類似的約35μm的細胞直徑，和在Percoll梯度上以同樣的組分(fractions)共純化。通過測試多個條件，開發得到I-細胞培養物，包括在纖連蛋白、膠原蛋白-型-IV或層粘連蛋白上的培養物。測試的培養基條件包括幾個濃度的胎牛血清(FCS)、表皮生長因子(EGF)、血小板源生長因子(PDGF-BB)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、骨形態發生蛋白(BMP)2+4、胰島素樣生長因子(IGF)1、sonic hedgehoc(Shh)和地塞米松，如下所闡述。種植有10個isl 1陽性細胞的96孔板中的約5-10％產生持續的生長培養物，這就表明100個i-細胞中只有約5-10個能夠引發i-細胞培養。幾個i-細胞群現在已經培養超過12倍的群體倍增。已經發現在心臟纖維原細胞的滋養層上或在由從心臟新鮮分離的纖維原細胞製成的條件培養基中，生心性前體群只能以無分化的或沒有細胞死亡的狀態培養。通過對心臟纖維原細胞去除條件培養基或從滋養層分離I-細胞，可以誘導I-細胞分化為肌細胞和神經細胞。經過5至10倍以上的群體倍增之後，形態和表型類似。I-細胞直徑約35μm，具有巨大的細胞核，無細胞質，以三維球體形式生長，總是附著到纖維原細胞滋養層。當分離和培養人組織心房的i-細胞時，獲得類似的結果。
實施例3單個I-細胞的體外分化接下來，通過加入細胞因子，測試從小鼠和大鼠心臟獲得的i-細胞的體外分化能力，其中，細胞因子依據對ES細胞分化成神經外胚層和中胚層已經作出的報導而選擇。分化作用要求，i-細胞必須被重新鋪板，無滋養層，i-細胞以約1-2×104細胞/cm2的濃度，處於不含血清但含有譜系-特異性細胞因子的培養基中。神經祖先細胞(Neuroprogenitors)可以用PDGF-BB擴增，並通過加入bFGF進行誘導分化(Palmer，et al.，1999)。在bFGF處理下，約45％的i-細胞獲得星形膠質細胞的形態和表型特徵，對膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)和神經元具有免疫組織化學陽性，其中神經元被染色成對神經絲200為陽性(NF-200)。肌細胞分化作用獲得這樣的細胞，該細胞在免疫組織化學實驗中對α-肌節肌動蛋白(sarcomeric actin)和α-輔肌動蛋白顯示出陽性信號。
實施例4從小鼠心臟分離出生後心臟祖細胞的分離方案將30至50個1天大的小鼠幼崽的心臟從胸部解剖出來，切成四片，在4℃下，不含Ca2+的HBSS(Hank′s balanced salt)溶液中洗滌3次。將心臟轉移入0.5mg/ml胰蛋白酶-HBSS溶液中，並在4℃下，在定軌搖床上預先消化過夜(～17小時)。將一半的胰蛋白酶溶液從預先消化的組織去除，剩餘部分用溫DMEM/M199細胞培養基(4∶1比率)以1∶1稀釋，所述培養基含有青黴素(100U/ml)/鏈黴素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/穀氨醯胺(2mM)。將組織在37℃下搖動3-4分鐘之後，將稀釋的胰蛋白酶從組織去除，將20ml的24U/mlII型膠原酶的HBSS溶液加入到組織溶液中。在37℃下，振蕩水浴中溫育2分鐘之後，棄去最初的膠原酶II型消化液，因為它主要含有血紅細胞和死亡的組織細胞。將該組織重新懸浮於12ml的新鮮II型膠原酶溶液中，並在37℃水浴中振蕩10分鐘。通過加入同樣體積的冷的DMEM/M199培養基，使得上清液失活，該DMEM/M199培養基含有10％的馬血清和5％的胎牛血清，將失活的上清液保存在冰上。組織重新懸浮和上清液失活作用再反覆進行3次，直到組織切片完全被消化。將來自消化液的上清液收集在一起，並以800rpm的轉速離心5分鐘。上清液含有大部分的心臟間充質細胞，而沉澱含有大部分的心臟肌細胞。第二次離心1500rpm，3分鐘之後，繼而將DMEM中的間充質細胞鋪板在塑料上20分鐘，DMEM含有青黴素(100U/ml)/鏈黴素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/穀氨醯胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分鐘之後，通過用PBS進行兩步嚴格的洗滌步驟，將未-附著的細胞從平板去除。將附著的心臟間充質細胞在37℃下，用5％CO2培養14-21天。在培養的第二天，當細胞匯合時，將培養基改換為DMEM/F12，DMEM/F12含有B27補體、2％胎牛血清、10ng/ml EGF。10天後，心臟祖群開始在心臟間充質細胞的滋養層頂部開始擴增。
實施例5從大鼠心臟分離出生後心臟祖細胞的分離方案將50個出生1-5天的大鼠幼崽心臟從胸部解剖出來，切成四片，在ADS緩衝液中洗滌2次，ADS緩衝液含有6.8g/l NaCl、4.7g/l HEPES、0.12g/lNaH2PO4、0.14g/lNaH2PO4H2O、1g/l葡萄糖、0.4g/lKCl、0.2g/lMgSO47H2O(pH調整為7.35)。將心臟切片在37℃下，攪拌瓶(stirflask)中，於ADS緩衝液中溫育15分鐘，ADS緩衝液含有膠原酶II型(115單位/ml)和胰酶(0.8mg/ml)。棄去第一消化物。將18ml的新鮮酶溶液加入到組織中，並37℃攪拌20分鐘。消化20分鐘之後，去除酶溶液，用6ml的新生小牛血清使之失活，將新鮮酶溶液加入到攪拌瓶中的組織切片中，並在37℃下再溫育20分鐘。將由第一個20分鐘消化得到消化物在1000rpm轉速下離心6分鐘，將沉澱重新懸浮於5ml的新生小牛血清，並在37℃下置於10％CO2。上面的步驟，從酶溶液的去除至沉澱重新懸浮，重複進行4次。將每次離心所得到的細胞懸浮液收集起來，並將收集液在1000rpm離心6分鐘。將沉澱重新懸浮於12ml的ADS緩衝液中。將細胞懸浮液層鋪在Percoll梯度(每一梯度2ml細胞)的頂部。每一Percoll梯度由頂部的4ml Percoll(1.06g/ml)和底部的3ml Percoll(1.08g/ml)組成。在緩慢加速和減速下，3000rpm離心30分鐘之後，上部的帶由心臟間充質細胞組成，界面處的中間帶由心臟肌細胞組成。用巴氏吸管收集間充質細胞。第二次離心(1500rpm，3分鐘)之後，繼而將DMEM中的間充質細胞塗布於塑料上20分鐘，DMEM包含青黴素(100U/ml)/鏈黴素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/穀氨醯胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分鐘後，通過用PBS進行兩步嚴格的洗滌步驟，將未-附著細胞從平板去除。將心臟間充質細胞在37℃下，用5％CO2培養14-21天。在培養的第二天，當細胞匯合時，將培養基改換為DMEM/F12，DMEM/F12含有B27補體、2％胎牛血清、10ng/mlEGF。10天後，心臟祖群開始在心臟間充質細胞的滋養層頂部開始擴增。
實施例6心臟祖細胞群表型細胞標記的FACS分析在上述實施例4和實施例5中，從出生後的小鼠和大鼠心肌膜分離得到的細胞的表型細胞標記物，分別用FACS分析鑑定。FACS分析顯示90％的細胞表達LIM同源轉換區轉錄因子islet1；～90％的細胞表達果蠅tinman同源物Nkx2.5；和30-40％的細胞共表達中間絲巢蛋白。
實施例7分化方案對於祖群的分化作用，細胞被重新鋪板(replated)，無間充質細胞滋養層，密度大約為2×104細胞/cm2，位於含有2％的胎牛血清和譜系-特異性分化試劑的培養基中。體外肌細胞分化用條件培養基實施，條件培養基富集逆轉錄病毒感染的NIH3T3細胞系的wntl 1，細胞系穩定表達和分泌wntl 1。在纖連蛋白包被的培養皿中，用wntl 1條件培養基，隨後用2.5ng/ml濃度的BMP2，以連續分化實驗方案處理細胞4.4天。然後，將分化的細胞在單細胞實驗中進行分析，以分析電生理情形下的通道電流(channelcurrents)和細胞內Ca2+瞬變。在層粘連蛋白和多溶素包被的培養皿中，用0.2uM全反式視黃酸(all-trans retinoic acid)和5μM毛喉素實施神經元細胞類型的體外分化，時間10-15天。脂肪細胞的體外分化是在塑料培養皿中，用10％的新生小牛血清和5％的胎牛血清實施。儘管本發明參考上述實施例而進行描述，應該理解的是，修飾和變化包括在本發明的精神和範圍內。因此，本發明僅由下述權利要求的限定。
參考文獻1.Abu-Issa，R.，Smyth，G.，Smoak，L，Yamamura，K.，and Meyers，E.N.(2002).Fgf8 is required for pharyngeal arch and cardiovascular development in the mouse，Development 129，4613-25.
2.Ahlgren.，U.，Pfaff,S.L.，Jessell，T.M.，Edlund，T.，and Edlund，H.(1997).Independent requirement for ISL 1 in formation of pancreatic mesenchyme and islet cells，Nature 385，257-60.
3.Brazelton，T.R.，et al.(2000).From marrow to brainexpression of neuronalphenotypes in adult mice.Science 290，1775-1779.
4.Brown，J.P.，et al.(1997)Bypass of senescence after disruption of p21CIPI/WAFIgene in normal diploid human fibroblasts.Science 277，831-834.
5.Bruneau，B.G.，Logan，M.，Davis，N.，Levi，T.，Tabin，C.J.，Seidman，J.G.，andSeidman，C.E.(1999).Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects inHolt-Oram syndrome，Dev Biol 211，100-8.
6.Cai，C.，et al.(2003).Islet1，a LIM-homeodomain transcription factor，redefinescardio genic fields and delineates a novel cardiac stem cell population.submitted.
7.Campione，M.，Ros，M.A.，Icardo，J.M.，Piedra，E.，Christoffels，V.M.，Schweickert，A.，Blum，M.，Franco，D.，and Moorman，A.F.(2001).Pitx2 expressiondefines a left cardiac lineage of cellsevidence for atrial and ventricular molecularisomerism in the iv/iv mice，Dev Biol 231，252-64.
8.Carson，C.T.，Kinzler，E.R.，and Parr，B.A.(2000).Tbx12，a novel T-box gene，is expressed during early stages of heart and retinal development，Mech Dev 96，137-40.
9.Clarke，D.，et al.(2000)Generalized potential of adult neural stem cells.Science288，1660-1663.
10.Cross，J.C.，Flannery，M.L.，Blanar，M.A.，Steingrimsson，E.，Jenkins，N.A.，Copeland，N.G.，Rutter，W.J.，and Werb，Z.(1995).Hxt encodes a basic helix-loop-helixtranscription factor that regulates trophoblast cell development，Development 121，2513-23.
11.Crossley，P.H.，and Martin，G.R.(1995).The mouse Fgf8 gene encodes a familyof polypeptides and is expressed in regions that direct outgrowth and patterning in thedeveloping embryo，Development 121，439-51.
12.Cserjesi，P.，Brown，D.，Lyons，G.E.，and Olson，E.N.(1995).Expression of thenovel basic helix-loop-helix gene eHAND in neural crest derivatives and extraembryonicmembranes during mouse development，Developmental Biology 170，664-78.
13.de la Cruz，M.V.，and Sanchez-Gomez，C.(2000).Straight Heart Tube.PrimitiveCardiac Cavities vs.Primitive Cardiac Segments.In Living Morphogenesis of the Heart，M.V.de La Cruz，and Markwald，R.R.，ed.(Boston，Basel，Berlin，Birkhauser)，pp.85-99.
14.Donovan，P.J.Gearhart，J.(2001).The end of the beginning for pluripotentstem cells.Nature 414，92-97.
15.Dudley，A.T.，and Robertson，E.J.(1997).Overlapping expression domains ofbone morphogenetic protein family members potentially account for limited tissue defectsin BMP7 deficient embryos，Developmental Dynamics 208，349-62.
16.Evans，M.J.Kaufmann，M.H.(1981).Establishment in culture of pluripotentialcells from mouse embryos.Nature 292，154-156.
17.Feldman，B.，Poueymirou，W.，Papaioannou，V.E.，DeChiara，T.M.，andGoldfarb，M.(1995).Requirement of FGF-4 for postimplantation mouse development，Science 267，246-9.
18.Franco，D.，Campione，M.，Kelly，R.，Zammit，P.S.，Buckingham，M.，Lamers，W.H.，and Moorman，A.F.(2000).Multiple transcriptional domains，with distinct left andright components，in the atrial chambers of the developing heart，Circ Res 87，984-91.
19.Franco，D.，Markman，M.M.，Wagenaar，G.T.，Ya，J.，Lamers，W.H.，andMoorman，A.F.(1999).Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflowtract myocardium in the developing rodent heart，Anat Rec 254，135-46.
20.Frank，D.U.，Fotheringham，L.K.，Brewer，J.A.，Muglia，L.J.，Tristani-Firouzi，M.，Capecchi，M.R.，and Moon，A.M.(2002).An Fgf8 mouse mutant phenocopieshuman 22q11 deletion syndrome，Development 129，4591-603.
21.Friedrich,G. Soriano，P.(1991)Promoter traps in embryonic stem cellsagenetic screen to identify and mutate developmental genes in mice.Genes Dev.5，1513.
22.Gage，F.H-(2000).Mammalian neural stem cells.Science 287，1433-1438.
23.Geiger，et al.(1998)Globin gene expression is reprogrammed in chimerasgenerated by injecting adult hematopoietic stem cells in mouse blastocysts.Cell 93，1055.
24.Gussoni，E.et al.(1999).Dystrophin expression in the mdx mouse restored bystem cell transplantation.Nature 401，390-394.
25.Haun，C.，Alexander，J.，Stainier，D.Y.，and Okkerna，P.G.(1998).Rescue ofCaenorhabditis elegans pharyngeal development by a vertebrate heart specification gene，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95，5072-5.
26.Hoffman，J.L.，and Kaplan，S.(2002).The incidence of congenital heart disease，JAm Coll Cardiol 39，1890-900.
27.Jackson，K.，et al.(2001).Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascularendothelium by adult stem cells.J.Clin.Invest.107，1395-1402.
28.Jiaug，Y.，et al.(2002).Pluripotency of mesenchymal stem cells derived fromadult marrow.Nature 418，41-49.
29.Joyner，A.L.，Ed.(1998)Gene targeting.A practical approach.Oxford UniversityPress，Oxford.
30.Kaufman，M.H.(1999).The Atlas of Mouse Development，Academic Press).
31.Kelly，R.G.，and Buckingham，M.E.(2002).The anterior heart-forming fieldvoyage to the arterial pole of the heart，Trends Genet 18，210-6.
32.Kelly，R.G.，Brown，N.A.，and Buckingham，M.E.(2001).The arterial pole ofthe mouse heart forms from Fgf10-expressing cells in pharyngeal mesoderm，Dev Cell 1，435-40.
33.Kim，R.Y.，Robertson，E.J.，and Solloway，M.J.(2001).Bmp6 and Bmp7 arerequired for cushion formation and septation in the developing mouse heart，Dev Biol235，449-66.
34.Kirby，M.L.(2002).Molecular embryogenesis of the heart，Pediatr Dev Pathol 5，516-43.
35.Kraus，F.，Haenig，B.，and Kispert，A.(2001).Cloning and expression analysis ofthe mouse T-box gene tbx20，Mech Dev 100，87-91.
36.Krause，D.S.，et al.001).Multi-organ，multi-lineage engraftment by a singlebone-marrow-derived stem cell.Cell 105，369-377.
37.Kubalak，S.W.，Miller-Hance，W.C.，O』Brien，T.X.，Dyson，E.，and Chien，K.R.(1994).Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedesseptation during murine cardiogenesis，Journal of Biological Chemistry 269，16961-70.
38.Liu，Y.H.，Ma，L.，Wu，L.Y.，Luo，W.，Kundu，R.，Sangiorgi，F.，Snead，M.L.，and Maxson，R.(1994).Regulation of the Msx2 homeobox gene during mouseembryogenesisa transgene with 439 bp of 5』flanking sequence is expressed exclusivelyin the apical ectodermal ridge of the developing limb，Mech Dev 48，187-97.
39.Lyons，K.M.，Hogan，B.L.，and Robertson，E.J.(1995).Colocalization of BMP 7and BMP 2 RNAs indicates that these factors cooperatively mediate tissue interactionsduring murine development，Mech Dev 50，71-83.
40.Mjaatvedt，C.H.，Nakaoka，T.，Moreno-Rodriguez，R.，Norris，R.A.，Kern，M.J.，Eisenberg，C.A.，Turner，D.，and Markwald，R.R.(2001).The outflow tract of the heartis recruited from a novel heart-forming field，Dev Biol 238，97-109.
41.Nichols，et al.(1990).Establishment of germ-line-competent embryonic stem(ES)cells using differentiation inhibiting activity.Development 110，1341-1348.
42.Niswander，L.，and Martin，G.R.(1992).Fgf-4 expression during gastrulation，myogenesis，limb and tooth development in the mouse，Development 114，755-68.
43.O』Brien，T.X.，Lee，K.J.，and Chien，K.R.(1993).Positional specification ofventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube，Proc NatlAcad Sci U S A 90，5157-61.
44.Orlic，D.，et al.(2001).Bone marrow cells regenerate infracted myocardium.Nature 410，701-705.
45.Palmer，T.D.，et al.(1999).Fibroblast growth factor-2 activates a latentneurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS.J.Neurosci.19，8487-8497.
46.Park，M.，Lewis，C.，Turbay，D.，Chung，A.，Chen，J.N.，Evans，S.，Breitbart，R.E.，Fishman，M.C.，Izumo，S.，and Bodmer，R.(1998).Differential rescue of visceral andcardiac defects in Drosophila by vertebrate tinman-related genes，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 95，9366-71.
47.Pexieder，T.(1986).Standardized method for study of normal and abnormalcardiac development in chick，rat，mouse，dog，and human embryos.，Teratology 33，91C-92C.
48.Pfaff，S.L.，Mendelsohn，M.，Stewart，C.L.，Edlund，T.，and Jessell，T.M.(1996).Requirement for LIM homeobox gene Isl 1 in motor neuron generation reveals a motorneuron-dependent step in interneuron differentiation，Cell 84，309-20.
49.Rafii，S.，et al.(1994).Isolation and characterization of human bone marrowmicrovascular endothelial cellshematopoietic progenitor cell adhesion.Blood 84，10-19.
50.Ranganayakulu，G.，Elliott，D.A.，Harvey，R.P.，and Olson，E.N.(1998).Divergent roles for NK-2 class homeobox genes in cardiogenesis in flies and mice，Development 125，3037-48.
51.Rosner，M.H.，et al.(1990).A POU-domain transcription factor in early stem cellsand germ cells of the mammalian embryo.Nature 345，686-692.
52.Sedivy，J.M. Dutriaux，A.(1999)Gene targeting and somatic cell genetic.Trends in Genetics 15，88-92.
53.Sedivy，J.M. Joyner，A.(1992)Gene targeting.WH Freeman Press.
54.Sekine，K.，Ohuchi，H.，Fujiwara，M.，Yamasaki，M.，Yoshizawa，T.，Sato，T.，Yagishita，N.，Matsui，D.，Koga，Y.，Itoh，N.，and Kato，S.(1999).Fgf10 is essential forlimb and lung formation，Nat Genet 21，138-41.
55.Soriano，P.(1999).Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporterstrain，Nat Genet 21，70-1.
56.Srinivas，S.，Watanabe，T.，Lin，C.S.，William，C.M.，Tanabe，Y.，Jessell，T.M.，and Costantini，F.(2001).Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFPand ECFP into the ROSA26 locus，BMC Dev Biol 1，4.
57.Sun，X.，Meyers，E.N.，Lewandoski，M.，and Martin，G.R.(1999).Targeteddisruption of Fgf8 causes failure of cell migration in the gastrulating mouse embryo，Genes Dev 13，1834-46.
58.Thonas，T.，Yamagishi，H.，Overbeek，P.A.，Olson，E.N.，and Srivastava，D.(1998).The bHLH factors，dHAND and eHAND，specify pulmonary and systemiccardiac ventricles independent of left-right sidedness，Developmental Biology 196，228-36.
59.Thomson，J.A.，et al.(1998).Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science 282，1145-1147.
60.Thor，S.，and Thomas，J.B.(1997).The Drosophila islet gene governs axonpathfinding and neurotransmitter identity，Neuron 18，397-409.
61.Tisdale，J.F. Dunbar，C.E.(2002).Plasticity and hematopoiesisCirce’stransforming potion？Curr.Opin.Hematol.9，268-273.
62.Toma，J.G.，et al.(2001).Isolation of multipotent adult stem cells from the dermisof mammalian skin.Nat.Cell.Biol.3，778-784.
63.Waldo，K.L.，Kumiski，D.H.，Wallis，K.T.，Stadt，H.A.，Hutson，M.R.，Platt，D.H.，and Kirby，M.L.(2001).Conotruncal myocardium arises from a secondary heartfield，Development 128，3179-88.
64.Weissman，L.L.(2000).Translating stem and progenitor cell biology to the clinicbarriers and opportunities.Science 287，1442-1446.
65.Wilkinson，D.G.，ed.(1999).In Situ HybridizationA Practical Approach，Second edition edn(Oxford University Press).
66.Winnier，G.，Blessing，M.，Labosky，P.A.，and Hogan，B.L.(1995).Bonemorphogenetic protein-4 is required for mesoderm formation and patterning in the mouse，Genes and Development 9，2105-16.
67.Yuan，S.，and Schoenwolf，G.C.(2000).Islet-1 marks the early heart rudimentsand is asymmetrically expressed during early rotation of the foregut in the chick embryo，Anat Rec 260，204-7.
68.Yutzey，K.E.，and Kirby，M.L.(2002).Wherefore heart thou？Embryonic originsof cardiogenic mesoderm，Dev Dyn 223，307-20.
69.Zhang，H.，and Bradley，A.(1996).Mice deficient for BMP2 are nonviable andhave defects in amnion/chorion and cardiac development，Development 122，2977-86.
權利要求
1.一種用於檢測幹細胞的方法，包括測定細胞中的Isletl核酸或表達產物的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述測定是免疫組織化學的。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述測定是包括測定IsletlmRNA的存在。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述幹細胞是生心幹細胞。
5.一種用於分離或富集幹細胞的方法，包括將一群細胞與對Isletl具有反應性的試劑相接觸，和將所述反應陽性細胞和反應陰性細胞分離開來，從而分離或富集幹細胞。
6.如權利要求5所述的方法，其中，所述幹細胞是生心幹細胞。
7.如權利要求5所述的方法，其中，所述試劑是被可檢測地標記的。
8.如權利要求7所述的方法，其中，所述標記物是螢光標誌。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述試劑是抗-islet 1抗體。
10.如權利要求8所述的方法，其中，所述分離或富集是通過螢光激活細胞分選分析法進行的。
11.一種用於產生幹細胞的方法，包括將表達Islet 1的未分化祖細胞與試劑接觸，以便激活或增強Islet 1在所述細胞中的表達，其中，所述試劑激活或增強Isletl在細胞中的表達。
12.如權利要求11所述的方法，其中，Islet 1表達的所述激活或增強導致所述細胞分化為中胚層或神經外胚層譜系。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述譜系是中胚層譜系。
14.如權利要求12所述的方法，其中，所述譜系是神經外胚層譜系。
15.如權利要求1所述的方法，其中，所述未分化祖細胞是嚙齒類動物的。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述嚙齒類動物細胞是非-肌細胞的心臟細胞。
17.如權利要求11所述的方法，其中，所述未分化祖細胞是人的。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述人細胞是非-肌細胞的心臟細胞。
19.如權利要求11所述的方法，其中，所述幹細胞是生心幹細胞。
20.一種擴增未分化生心祖細胞的細胞群、而不發生分化的體外方法，包括培養分離得到的未分化祖細胞，所述祖細胞在祖細胞足以生長的條件下表達Isletl，其中所述祖細胞足以生長的條件包括將該細胞培養在種-特異性心臟纖維原細胞的滋養層上或培養在來自心臟的纖維原細胞的條件培養基中。
21.如權利要求20所述的方法，其中，所述未分化祖細胞是非-肌細胞的細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其中，所述非-肌細胞是大鼠的、小鼠的或人的細胞。
23.一種組合物，包括Isletl陽性幹細胞的富集群，其包括大於90％的Isletl陽性幹細胞。
全文摘要
本發明提供了體外擴增和增殖未分化的祖細胞的方法，更具體地，提供了體外擴增和增殖含有Islet1的未分化祖細胞的方法，Islet1是增殖中的心臟幹細胞顯然特有的一個標誌，本發明描述了用於分離幹細胞群的方法，以及用於刺激未分化的祖細胞擴增和增殖而不發生分化的方法，例如，以提供心臟修復或改善心臟功能。
文檔編號C12Q1/68GK1768133SQ200480008937
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月2日 優先權日2003年1月31日
發明者S·M·埃文斯, J·陳, C·蔡, A·莫雷蒂, K·R·近, K-L·勞格維茨 申請人:加利福尼亞大學董事會