丹參酮ⅱa的新用途
2023-06-18 17:17:21
丹參酮ⅱa的新用途
【專利摘要】本發明涉及丹參酮ⅡA在製備皮膚癌治療藥物中的應用。本發明將多個劑量的丹參酮ⅡA在人角質形成細胞系接受長波紫外線的照射後加入細胞培養基中，研究不同劑量丹參酮ⅡA在長波紫外線引起的損傷細胞中誘導細胞凋亡的作用。該項發明建立在實驗性細胞損傷模型的基礎上，為研究皮膚癌細胞凋亡的信號通路機制及研發治療皮膚癌的天然產物藥物提供了依據。
【專利說明】丹參酮II A的新用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及丹參酮II A在製備皮膚癌治療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]皮膚癌分為皮膚黑素瘤和非黑素瘤性皮膚癌。在白色人種的發病率居各種腫瘤之首，隨著臭氧層被破壞，亞洲人的發病率也在增加。紫外線是引起皮膚癌的最主要原因，促進被紫外線損傷和癌變的皮膚細胞凋亡是預防和治療皮膚癌的有效手段之一。
[0003]為了模擬因 紫外線引起的皮膚損傷或者癌變，前人建立了不同皮膚細胞在長波紫外線(UVA)或者中波紫外線(UVB)下的損傷模型。其中UVB因其能量較高，能大幅度的損傷皮膚細胞，但是因其波長短，在臭氧層中大部分被吸收，所以到達地面的UVB甚少。而UVA相對能量較低，但是因其波長較長，大部分穿透大氣層到達地表，甚至在陰天和室內也有大量的UVA照射到人的皮膚上。角質形成細胞是皮膚表層最主要的細胞，其健康程度直接影響著其他皮膚細胞的功能和狀態。始於1988年建立起來的人永生化角質形成細胞HaCaT經常用於皮膚類藥品的藥理研究，是很好的正常角質形成細胞的替代物，具有普通角質形成細胞的形態和表皮分化能力，並且在普通狀態下沒有腫瘤生成趨勢。我們利用UVA和HaCaT細胞來建立皮膚細胞光損傷模型，可模擬皮膚癌的發病機制，為篩選新型預防治療皮膚癌的藥物提供良好的研究載體。
[0004]丹參酮II A是從傳統中藥丹參根中提取的菲醌類衍生物，分子式為C19O3H2tl,經常用於心絞痛的治療，改善胸悶和缺氧後引起的心肌代謝紊亂，在皮膚病方面，也只用於痤瘡的治療。丹參酮II A對多種腫瘤細胞具有殺傷、誘導分化和凋亡的作用。有關研究也表明其可以抑制肝癌細胞的增殖、誘導乳腺癌細胞的凋亡，在肺癌細胞中，丹參酮II A可以提高凋亡基因的表達水平、降低抑制凋亡基因的表達水平，從而達到治療肺癌的目的。然而其在皮膚癌預防和治療方面的應用卻沒有。因傳統中藥越來越被現代人所推崇，其中提取的天然產物將具有廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種丹參酮II A在製備治療皮膚癌天然藥物中的應用。
[0006]本發明將丹參酮II A在UVA照射後加入HaCaT細胞的培養基中，24小時後用細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)檢測細胞活性。結果證明，相比單獨用丹參酮II A和單獨用UVA照射的細胞，在UVA照射過後加入丹參酮II A的細胞其活性大大降低，並且不同濃度的丹參酮II A均可以有效的加劇UVA誘導的細胞活性下降。
[0007]本發明將丹參酮II A加入HaCaT細胞的培養基中，24小時後用UVA照射細胞並在30分鐘後提取細胞總蛋白並用Western Blotting法檢測凋亡相關信號通路蛋白(p38和JNK)的磷酸化水平。結果證明，相比單獨用丹參酮II A處理和單獨用UVA照射的細胞，加入丹參酮II A並照射UVA的細胞其p38和JNK的磷酸化水平有較大的提高。
[0008]本發明新穎之處和優點在於:1)UVA損傷模型建立方法簡單；
2)UVA損傷模型的建立為皮膚癌的預防和治療提供了有效的研究平臺；
3)丹參酮IIA易於獲取，有利於新藥規模化生產；
4)丹參酮IIA被人們所熟知，易於推廣；
5)丹參酮IIA經多年臨床檢驗，毒副作用小。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為不同濃度的丹參酮II A對細胞活力的影響。
[0010]圖2為不同濃度的丹參酮II A促進2 J/cm2的UVA誘導的細胞凋亡；
圖3為不同濃度的丹參酮II A促進2 J/cm2的UVA誘導的胞內磷酸化p38和磷酸化JNK的表達；
圖4為不同濃度的丹參酮II A促進20 J/cm2的UVA誘導的細胞凋亡。
【具體實施方式】
[0011]實施例 一:不同劑量丹參酮II A加速2 J/cm2的UVA誘導的細胞凋亡
HaCaT細胞培養在DMEM完全培養基(DMEMW 10%滅活胎牛血清，100 U/mL青黴素和100mg/mL鏈黴素)於37°C、5% CO2常規培養，待細胞鋪滿培養瓶底部時，細胞以0.25%胰酶消化並按1:3傳代並接種於12孔板，待細胞完全融合時進行實驗。丹參酮II A溶於二甲基亞碸，用DMEM完全培養基稀釋到所需濃度。HaCaT細胞更換常規完全培養基為含有不同濃度丹參酮II A的完全培養基，繼續在37°C、5% CO2的條件下培養24小時。用DPBS衝洗2次並棄去DPBS，每個孔加入0.5 mL混有CCK8的完全培養基(CCK8:DMEM =1:10)於37°C、5% CO2常規培養2小時後每個孔吸取100 μL上清至96孔板，在450 nm的波長下讀取吸光值，詳情見圖1。選取無細胞毒性的低濃度丹參酮II A進行後續實驗。
[0012]融合後的細胞分為對照組、僅UVA處理組、丹參酮II A和UVA共同處理組。照射前棄去培養基，用DPBS漂洗2次；重新向所有孔中加入0.5 mL DPBS。2 J/cm2的UVA照射時，細胞培養板距紫外燈管15 cm並置於紫外輻照儀內部中央。對照組和僅丹參酮II A處理組用錫箔紙蓋住，照射後DPBS由加有不同濃度丹參酮II A (8.5、17、34μΜ)的完全培養基替換並繼續培養24小時。用DPBS衝洗細胞2次，棄去DPBS後每個孔加入0.5 mL混有CCK8的DMEM完全培養基(CCK8:DMEM =1:10)於37°C、5% CO2常規培養2小時後每個孔吸取100 μL上清至96孔板，在450 nm的波長下讀取吸光值並計算其相對細胞活力。詳情見圖2。
[0013]結果發現，丹參酮II A可以加劇UVA照射後細胞活力的下降，並且隨著濃度的升高細胞活力隨之降低。經8.5 μΜ的丹參酮II A處理過的細胞對比僅UVA照射組,細胞活力沒有顯著差異；經17 μΜ的丹參酮II A處理過的細胞對比僅UVA照射組，細胞活力下降了 20% ；經34 μΜ的丹參酮II A處理過的細胞對比僅UVA照射組，細胞活力更是下降了 33%。丹參酮II A可以有效的促進被UVA損傷的細胞凋亡。
[0014]實施例二:不同劑量丹參酮II A促進2 J/cm2的UVA誘導的胞內磷酸化p38和磷酸化JNK的表達
HaCaT細胞培養在DMEM完全培養基(DMEM加10%滅活胎牛血清，100 U/mL青黴素和100 mg/mL鏈黴素)於37°C、5% CO2常規培養，待細胞鋪滿培養瓶底部時，細胞以0.25%胰酶消化並按1:3傳代並接種於12孔板，待細胞完全融合時進行實驗並分為對照組、僅丹參酮
II A處理組、僅UVA處理組、丹參酮II A和UVA共同處理組。照射前24小時在對應細胞組
內加入8.5、17、34μΜ丹參酮II Α，照射前棄去培養基，用DPBS漂洗2次；重新向所有孔中加
入0.5 mL DPBS。2 J/cm2的UVA照射時，細胞培養板距紫外燈管15 cm並置於紫外輻照儀內
部中央。對照組和僅丹參酮II A處理組用錫箔紙蓋住，照射後DPBS由完全培養基代替，繼
續培養30分鐘後提取總蛋白並用蛋白質印跡法檢測磷酸化及總p38、JNK信號通路蛋白，詳
情見圖3。印跡圖像用軟體Image J分析灰度值,並用Ρ_ρ38/ β -actin、P-JNK/ β -actin和
P-Erk/ β -actin衡量其磷酸化水平,其中β -actin為肌動蛋白，作為內參。具體如下表:
【權利要求】
1.丹參酮II A在製備皮膚癌治療藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/58GK104013633SQ201410244254
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】翁新楚, 史維剛 申請人:上海大學