誘導t細胞死亡的表位的製作方法

2023-06-07 10:47:01

專利名稱：誘導t細胞死亡的表位的製作方法
誘導T細胞死亡的表位
本申請是申請日為2005年05月11日，申請號為200580023402. 2 (國際申請號為PCT/US2005/016441)，名稱為「誘導T細胞死亡的表位」的發明專利申請的分案申請。相關的申請本申請要求2004年5月11日提交的美國臨時申請系列號60/570，161的優先權，作為參考將其內容完整地在此弓IA。背景在治療自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病和T細胞來源的癌症中控制不需要的免疫應答是關鍵的。通過免疫抑制或通過免疫耐受性的誘導可以限制過度侵襲性的T細胞的活性。細胞凋亡被認為涉及維持免疫系統的適當功能和除去不需要的細胞，例如過度侵襲性的 T 細胞(Kabelitz 等(1993) Immunol Today 14, 338-340 ;和 Raff (1992)Nature356,397-399)。概述本發明涉及誘導T細胞死亡的表位。這些表位可用於，尤其是，選擇結合這些表位的化合物。這樣的化合物在治療涉及過度侵襲性T細胞的疾病中是有用的。這種疾病的實例包括自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病和T細胞來源的癌症。在一個方面，本發明的特徵是分離的表位的三維構象。在活化的T細胞上的所述表位與配體的結合誘導細胞的死亡。這種表位被表示為(I)X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO :I)，其中X1 是 Tyr、Trp、His 或 Met ;X2 是 Asp;X3 是 Ser、Phe、Pro、Glu 或 His ;X4是在動物中天然產生的任何胺基酸；以及X5 是 Pro、Tyr、His 或 Trp ;(2) X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID NO : 2)，其中X6 是 Asp;X7 是 Tyr、Met、Asn、Trp 或 Phe ;X8 是 Phe 或 Leu;X9 是 Pro;以及Xltl 是 Glu;或者 (3) X11-X12-X13-X14 (SEQ ID NO : 3)，其中X11 是 Pro ；X12 是 Met ；X13 是 Glu 或 Ser ;以及X14 是 He。任何如上所述的表位可以是，例如，多肽、兩個多肽的相互作用區域、糖(carbohydrate)部分、糖蛋白，或它們的任何構象的、功能的等同物。
在另一個方面，本發明的特徵是含有X1-X2-X3-X4-X5' X6-X7-X8-X9-X10,或Xn-X12-X13-X14的分離的多肽。在活化的T細胞上的所述多肽與配體的結合誘導該細胞的死亡。在一個實施方案中，所述多肽含有4到400個胺基酸(例如，4和400之間的任何整數，包括 4 和 400)。例如，所述多肽可以是 X1-X2-X3-X4-XJSEQ ID NO I), X6-X7-X8-X9-X10(SEQID NO 2) ,X11-X12-X13-X14(SEQ ID NO 3)、或 SEQ ID NO :4,6-18 和 20-22 的任何一個。
「分離的表位」或「分離的多肽」是指基本上不含天然相關的分子的表位或多肽，即，它是至少75% (例如，75%和100%之間的任何數，包括75%和100% )的乾重純度的。可以通過任何適當的標準方法，例如，通過柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析來測定純度。本發明的分離的表位或多肽可以從天然來源純化、通過重組DNA技術或通過化學方法來製備。在另一個方面，本發明的特徵是與上述表位之一結合的新的化合物。所述化合物可以是任何類型的分子，包括抗體，例如單克隆抗體。本發明的化合物可以用於檢測本發明的表位和用於誘導活化的T細胞的死亡。製備抗體的方法也處在本發明的範圍內。所述方法包括向受試者施用有效量的上述表位(例如，多肽)之一。所述抗體可以用於檢測本發明的表位或用於誘導活化的T細胞的死亡。本發明特徵還在於鑑定誘導活化的T細胞死亡的候選化合物(例如，單克隆抗體)的方法。所述方法涉及用測試化合物接觸本發明的表位並測定所述測試化合物是否與表位結合。如果測試化合物與表位結合，它就是誘導活化的T細胞死亡的候選物。本發明進一步的特徵在於通過用本發明的化合物接觸活化的T細胞來誘導活化的T細胞死亡的方法。在另一個方面，本發明特徵在於藥物組合物，其含有藥學上可接受的載體和(I)本發明的表位，例如多肽，或(2)與所述表位結合的化合物。本發明提供了用於治療涉及過度侵襲性T細胞的疾病的組合物和方法，所述疾病例如自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病和T細胞來源的癌症。在以下附隨的說明中將闡述本發明的一個或多個實施方案的細節。根據詳細的說明，本發明的其他特徵、目的和益處將更為明顯。本發明還涉及如下方面I.由X1-X2-X3-X4-X5表示的分離的表位的三維構象，其中在活化的T細胞上的所述表位與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X1 是 Tyr、Trp、His 或 Met ;X2 是 Asp ；X3 是 Ser、Phe、Pro、Glu 或 His ;X4是任何胺基酸；和X5 是 Pro、Tyr、His 或 Trp。2.包含X1-X2-X3-X4-X5的分離的多肽，其中在活化的T細胞上的所述多肽與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X1 是 Tyr、Trp、His 或 Met ;X2 是 Asp ；
X3 是 Ser、Phe、Pro、Glu 或 His ;X4是任何胺基酸；和X5 是 Pro、Tyr、His 或 Trp。3.項2的多肽，其中所述多肽長度是5到1500個胺基酸。4.項3的多肽，其中所述多肽長度是5到150個胺基酸。5.項4的多肽，其中所述多肽長度是5到15個胺基酸。6.項2的多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NO 4和6_13。7.項2的多肽，其中所述多肽是X1-X2-X3-X4-Xp8.抗體，其與具有項I的三維構象的表位結合併且誘導活化的T細胞死亡。9.項8的抗體，其中所述抗體是單克隆的。10.製備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有項I的三維構象的表位。11.鑑定誘導活化的T細胞的死亡的候選化合物的方法，所述方法包括使化合物與具有項I的三維構象的表位接觸，其中所述化合物與所述表位的結合表明所述化合物是誘導活化的T細胞死亡的候選物。12.項11的方法，其中所述化合物是抗體。13.項12的方法，其中所述化合物是單克隆抗體。14.誘導活化的T細胞的死亡的方法，所述方法包括使活化的T細胞與項8的抗體接觸。15.藥物組合物，包括具有項I的三維構象的表位和藥學上可接受的載體。16.藥物組合物，包含項2的多肽和藥學上可接受的載體。17.藥物組合物，包含項8的化合物和藥學上可接受的載體。18.由X6-X7-X8-X9-Xltl表示的分離的表位的三維構象，其中在活化的T細胞上的所述表位與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X6 是 Asp ；X7 是 Tyr、Met、Asn、Trp 或 Phe ;X8 是 Phe 或 Leu ；X9 是 Pro;和Xltl 是 Glu。19.包含X6-X7-X8-X9-Xltl的分離的多肽，其中在活化的T細胞上的所述多肽與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和
X6 是 Asp ；X7 是 Tyr、Met、Asn、Trp 或 Phe ;X8 是 Phe 或 Leu ；X9 是 Pro;和Xltl 是 Glu。20.項19的多肽，其中所述多肽長度是5到1500個胺基酸。21.項20的多肽，其中所述多肽長度是5到150個胺基酸。22.項21的多肽，其中所述多肽長度是5到15個胺基酸。
23.項19的多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NO :14_18。24.項19的多妝,其中所述多妝是X6-X7-X8-X9-X1(l。25.抗體，其與具有項18的三維構象的表位結合併且誘導活化的T細胞死亡。
26.項25的抗體，其中所述抗體是單克隆的。27.製備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有項18的三維構象的表位。28.鑑定誘導活化的T細胞的死亡的候選化合物的方法，所述方法包括使化合物與具有項18的三維構象的表位接觸，其中所述化合物與所述表位的結合表明所述化合物是誘導活化的T細胞死亡的候選物。29.項28的方法，其中所述化合物是抗體。30.項29的方法，其中所述化合物是單克隆抗體。31.誘導活化的T細胞的死亡的方法，所述方法包括使活化的T細胞與項25的抗體接觸。32.藥物組合物，包括具有項18的三維構象的表位和藥學上可接受的載體。33.藥物組合物，包含項19的多肽和藥學上可接受的載體。34.藥物組合物，包含項25的抗體和藥學上可接受的載體。35.由X11-X12-X13-X14表示的分離的表位的三維構象，其中在活化的T細胞上的所述表位與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X11 是 Pro;X12 是 Met ；X13 是 Glu 或 Ser ;和X14 是 He。36.包含X11-X12-X13-X14的分離的多肽，其中在活化的T細胞上的所述多肽與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X11 是 Pro ；X12 是 Met ；X13 是 Glu 或 Ser ;和X14 是 He。37.項36的多肽，其中所述多肽長度是4到1500個胺基酸。38.項37的多肽，其中所述多肽長度是4到150個胺基酸。39.項38的多肽，其中所述多肽長度是4到15個胺基酸。40.項36的多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NO :20_22。41.項36的多妝,其中所述多妝是Xn-X12-X13_X14。42.抗體，其與具有項35的三維構象的表位結合併且誘導活化的T細胞死亡。43.項44的抗體，其中所述抗體是單克隆的。44.製備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有項35的三維構象的表位。45.鑑定誘導活化的T細胞的死亡的候選化合物的方法，所述方法包括使化合物與具有項35的三維構象的表位接觸，其中所述化合物與所述表位的結合表明所述化合物是誘導活化的T細胞死亡的候選物。46.項45的方法，其中所述化合物是抗體。47.項46的方法，其中所述化合物是單克隆抗體。48.誘導活化的T細胞死亡的方法 ,所述方法包括使活化的T細胞與項42的抗體接觸。49.藥物組合物，包括具有項35的三維構象的表位和藥學上可接受的載體。50.藥物組合物，包含項36的多肽和藥學上可接受的載體。51.藥物組合物，包含項42的抗體和藥學上可接受的載體。詳細說明本發明基於出乎意料的發現，通過新的誘導T細胞死亡的表位的接合，T細胞可以被誘導經歷細胞凋亡和被耗盡。對於治療與過度的或不需要的T細胞介導的免疫應答或T細胞增殖相關的病症，耗盡活化的T細胞是特別有用的。例如，耗盡活化的T細胞可以引起降低或消除與自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細胞來源的癌症相關的不需要的T細胞活性或增殖。因此，本發明的特徵是分離的表位的三維構象。在活化的T細胞上配體與表位的結合誘導細胞的死亡。所述表位由X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14表示。例如，使用如 Duggan 等，(1995) J Med Chem. 38 :3332-41 和 Toogood(2002) J MedChem. 45 1543-57 中描述的計算機模擬程序，可以確定 X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14的三維構象。構象、功能等效物的表位可以根據X1-X2-X3-X4-XpX6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14的二維構象來設計，使用本領域已知的方法來製備，並通過例如以下實施例中描述的方法來測試它們涉及誘導活化的T細胞死亡的能力。參見，例如，Barbas 等(2001)Phage display. A laboratory manual. CSHL Press ；Parmley等(1998)Gene 73, 305-318 ;Scott 等(1990)Science 249,386-390 ；美國專利申請No. 20030049252A1 ；W0 03/013603A1 ；0sborne (1996) Curr Opin Immunol 8:245-248;Lin 等(I"7) J. Immunol. I58，598-6。3 ;Zhang 等(I995)Nature 377,348-350 ；Lai 等(1995)Eur J Immunol 25，3243-3248 ;Mollereau 等(1996) J Immunol 156，3184-3190 ;和Gribben 等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92,811-815。如在此使用的，「活化的T細胞」是比未活化的T細胞具有更高的擴增頻率、速率或幅度的T細胞。細胞的「死亡」包括程序化的細胞死亡，即，細胞凋亡。當用藥物處理的細胞群體展現出比未處理的細胞群體更高的死亡率時，該藥物「誘導細胞死亡」。例如，根據annexin V染色和FACS分析測定的，當用單克隆抗體ml28-9F9、ml52_15A7或ml66_43B6處理時，與未處理的細胞相比，經歷了細胞凋亡的體外活化的T細胞的百分比是約兩倍(參見以下實施例)。本發明特徵還在於含有X1-X2-X3-X4-Xp X6-X7-X8-X9-X10 或 X11-X12-X13-X14 的分尚的多肽。所述多肽可用於鑑定誘導活化的T細胞死亡的化合物。這種化合物與活化的T細胞表面上表達的多肽的結合誘導細胞死亡。進一步的，通過與細胞表面多肽競爭內源性的誘導死亡的配體，游離多肽(即，不在細胞表面上表達的那些)可以抑制不需要的細胞的死亡。所述多肽的長度或序列可以根據這些用途來變化。本發明的多肽可以作為，例如，分離的T細胞表面蛋白、合成多肽或重組多肽來獲得。為了製備重組多肽，可以將編碼它的核酸與編碼融合夥伴(partner)的另一個核酸連接，所述融合夥伴例如，穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6x-His表位標記或M13基因3蛋白。產生的融合核酸在適合的宿主細胞中表達可以通過標準方法分離的融合蛋白。可以進一步處理分離的融合蛋白，例如通過酶消化，來除去融合夥伴並獲得本發明的重組多肽。
本發明的表位或本發明的多肽可用於在動物(用於製備抗體)或人(用於治療疾病)中產生抗體。在動物中製備單克隆和多克隆抗體及其片段的方法是本領域已知的。參見，例如，Harlow 和 Lane, (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, New York。術語「抗體」包括完整的分子及其片段,例如Fab、F(ab' )2、Fv、scFv (單鏈抗體)和dAb (結構域抗體；Ward,等(1989) Nature, 341, 544)。這些抗體可用於檢測表位，例如，鑑定與表位結合的化合物(見下文)。能誘導活化的T細胞死亡的抗體對於治療諸如自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細胞來源的癌症的疾病也是有用的。一般地，本發明的表位，例如，多肽，可以與載體蛋白，例如KLH偶聯，與佐劑混合，並注入到宿主動物中。然後可以通過肽親和層析來純化該動物中產生的抗體。通常採用的宿主動物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。可用於提高免疫應答的各種佐劑取決於宿主物種，包括弗氏佐劑(完全的和不完全的)，礦物凝膠例如氫氧化鋁，表面活性物質例如溶血卵磷脂，普盧蘭尼克多元醇類(pluixmic polyol)，聚陰離子，肽，油乳劑，鑰孔血藍素，和二硝基酚。有用的人佐劑包括 BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和 Corynebacterium parvum。抗體分子的異質性群體(heterogeneous populations)多克隆抗體存在於被免疫受試者的血清中。針對特定抗原的抗體勻質群體單克隆抗體可以使用標準雜交瘤技術來製備(參見，例如，Kohler等(1975)Nature 256,495 ;Kohler等(1976)Eur J TmmunoI 6,511 ；Kohler 等(1976)Eur J Immunol 6,292 ;和 Hammerling等(1981)Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ) 特別地,可以通過為了在培養物中通過連續細胞系產生抗體分子的任何技術來獲得單克隆抗體，例如在Kohler等(1975)Nature 256，495和美國專利No. 4，376，110中描述的；人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等(1983) ImmunolToday 4，72;Cole 等(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80，2026，和 EBV 雜交瘤技術(Cole等(1983)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp.77-96)。這樣的抗體可以是任何免疫球蛋白類型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，和它們的任何亞類。可以體外或體內地培養產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤。在體內生產高滴度單克隆抗體的能力使之成為特別有用的製備方法。此外，可以使用為了產生「嵌合抗體」而開發的技術。參見，例如，Morrison等(1984) Proc Natl Acad Sci USA 81,6851 ;Neuberger等(1984) Nature 312,604 ;和 Takeda等(1984) Nature 314:452。嵌合抗體是一種分子,其中不同的部分來自不同的動物物種，例如，具有來自鼠單克隆抗體的可變區和人免疫球蛋白恆定區的那些抗體。或者，可以修改為了製備單鏈抗體而描述的技術(美國專利No. 4，946，778和4，704, 692)來製備單鏈Fv抗體的噬菌體庫。通過經由胺基酸橋連接Fv區的重鏈和輕鏈片段來形成單鏈抗體。此外，可以通過已知的技術來產生抗體片段。例如，這種片段包括但不限於，可通過抗體分子的胃蛋白酶消化而產生的F(ab' )2片段，以及可通過還原F(ab' )2片段的二硫鍵產生的Fab片段。抗體也可以通過本領域已知的方法來人源化。例如，具有期望的結合特異性的單克隆抗體可以被商業地人源化(Scotgene, Scotland ；and Oxford Molecular, Palo Alto,Calif.)。完全人的抗體，例如在轉基因動物中表達的那些，處在本發明的範圍之內(參見，例如，Green 等(1994)Nature Genetics 7，13 ;和美國專利 No. 5，545，806 和 5，569 ，825)。本發明進一步特徵在於與本發明的表位結合併誘導活化的T細胞死亡的新化合物。例如，可以根據表位的三維構象，使用計算機模擬程序來設計這種化合物，並使用本領域已知方法來合成。也可以通過如下所述的庫篩選來鑑定該化合物。測試化合物可以使用本領域已知的組合庫方法中的許多方法的任何一種來獲得，這些庫包括肽文庫、類肽文庫(具有肽的功能性、但帶有對酶降解有抗性的新的非肽骨架的分子的庫)、空間可定址的(spatially addressable)平行固相或液相庫、通過去裙合或親和層析選擇獲得的合成庫、「一珠一化合物」的庫、和抗體庫。參見，例如，Zuckermann等(1994)J Med Chem 37，2678-85 ;Lam(1997)Anticancer Drug Des 12，145;Lam 等(1991)Nature 354,82 ;Houghten 等(1991)Nature 354,84 ;和 Songyang 等(1993)Cell 72,767。用於分子庫合成的方法的實例可在本領域中找到，例如=DeWitt等(1993)PNASUSA 90，6909 ;Erb 等(1994) PNAS USA 91，11422 ;Zuckermann 等(1994) J Med Chem 37，2678 ;Cho 等(1993) Science 261,1303 ;Carrell 等(1994)Angew Chem Int Ed Engl 33，2059 ;Carell 等(1994) Angew Chem Int Ed Engl 33,2061 JPIGallop 等(1994) J Med Chem37，1233。化合物的庫可以存在於溶液中(例如，Houghten (1992) Biotechniques 13,412-421)、或珠子(Lam(1991)Nature 354,82-84),晶片(Fodor(1993)Nature 364，555-556)、細菌(美國專利 No. 5，223，409)、芽孢(美國專利 No. 5，223，409)、質粒(Cull等(1992)PNAS USA，89，1865-1869)或噬菌體(Scott 和 Smith(1990)Science 249，386-390 ；Devlin(1990)Science 249，404-406 ;Cwirla 等(1990)PNAS USA 87,6378-6382 ；Felici (1991) J Mol Biol 222，301-310 ;和美國專利 No. 5，223，409)上。為了鑑別誘導活化的T細胞死亡的候選化合物，用本發明的表位接觸測試化合物，評估所述化合物與表位的結合。如果測試化合物與表位結合，它就是誘導活化的T細胞死亡的候選物。按各種方法進行篩選分析。例如，一種方法包括將表位(或含有表位的分子，例如，多肽或融合蛋白)或測試化合物錨定在固相上，並在反應結束時檢測固相上形成的表位-測試化合物複合物。實際上，微量滴定板可以方便地用作固相。可以通過非共價的或共價的連接來固定錨定元件。非共價連接可以僅通過用錨定元件(anchor component)的溶液包被固體表面並使平板乾燥來實現。或者，特異於錨定元件的固定化抗體(例如，單克隆抗體)可用來將錨定元件固定到固體表面。將非錨定元件添加到包被有錨定元件的固體表面。在反應完成後，在一定條件下除去非錨定元件的未結合部分(例如，通過洗滌)，從而任何形成的複合物仍保持固定在固體表面上。可以按多種方式完成這些複合物的檢測。當非錨定元件被預先標記時，檢測到固定到固體表面上的標記指示了複合物形成。當非錨定元件沒有預先標記時，可使用間接標記來檢測表面上形成的複合物，例如，使用特異於非錨定元件的抗體(該抗體隨後可以用例如標記的抗Ig抗體直接標記或間接標記)。或者，可以在液相中進行反應。例如，使用特異於表位(或含有表位的分子)或測試化合物的固定化抗體，來從未結合的元件(component)中分離複合物。然後，例如使用特異於其他元件的標記的抗體來檢測複合物。通過使用以下實施例中描述的方法或本領域已知的任何其他方法來確定化合物誘導活化的T細胞死亡的能力，可以驗證候選化合物。驗證的化合物可用於誘導活化的T細胞的死亡，和用於治療諸如自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細胞來源的癌症的疾病。
本發明提供了誘導活化的T細胞死亡的方法，例如，通過在體外使活化的T細胞與本發明的化合物接觸，或通過向有需要的受試者施用有效量的本發明的化合物。需要治療的受試者可被鑑定為患有以過度或不需要的T細胞介導的免疫應答為特徵的病症或存在該風險，例如，患有自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細胞來源的癌症的患者。這種方法可以單獨地或者與其他藥物或治療共同地進行。術語「治療」被定義為向受試者施用組合物，目的是治癒、減輕、解除、矯正、防止或改善失調、失調的症狀、繼發於失調的疾病狀態或趨於失調的傾向。「有效量」是能夠在治療的受試者中產生醫學上期望的結果，例如上述結果的組合物的量。要治療的示例性疾病包括但不限於糖尿病、關節炎(包括類風溼性關節炎、青少年類風溼性關節炎、骨關節炎和牛皮癬關節炎)、多發性硬化、腦脊髓炎、重症肌無力、全身性紅斑狼瘡、自體免疫甲狀腺炎、皮炎(包括特異反應性皮炎和溼疹性皮炎)、牛皮癬、Sjogren氏綜合症、Crohn氏病、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、I型糖尿病、炎症性腸疾病、潰瘍性結腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡(cutaneous lupuserythematosus)、硬皮症、陰道炎、直腸炎、藥疫、麻風病翻轉反應、麻風的結節性紅斑、自體免疫葡萄膜炎、變態反應性腦脊髓炎、急性壞死出血性腦病、自發性的雙側漸進性感覺神經性的聽力喪失、再生障礙性貧血、純紅細胞貧血、自發性血小板減少、多軟骨炎、Wegener氏肉芽腫病、慢性活動性肝炎、Stevens-Johnson綜合症、自發性口炎性腹瀉、扁平苔癬、Graves氏病、結節病、原發性膽汁肝硬變、後葡萄膜炎(uveitis posterior)、間隙肺部纖維化、移植物抗宿主病、移植的情況(包括使用異源或異種組織的移植)例如骨髓移植、肝臟移植、或任何器官或組織的移植、變態反應例如特異反應性過敏、AIDS和T細胞瘤例如白血病或淋巴瘤。在體內途徑中，治療組合物(例如，含有本發明的表位、本發明的多肽或本發明的化合物的組合物)被施用給受試者。一般地，表位、多肽或化合物被懸浮在藥學上可接受的載體(例如，生理鹽水)中，並口服地、或通過靜脈內輸注、或皮下、肌肉內、鞘內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣管內或肺內地注射或植入來施用。所需的劑量取決於給藥途徑的選擇；配方的性質；受試者的疾病的性質；受試者的大小、體重、表面積、年齡和性別；施用的其他藥物；以及主治醫師的判斷。適合的劑量在
0.01-100. Omg/kg的範圍內。考慮到可用組合物的變化和各種給藥途徑的不同效率，所需劑量的廣泛變化是預期的。例如，預計口服施用比靜脈內注射需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可以使用本領域充分了解的、用於優化的經驗性規則來調整。將組合物封裝在適合的遞送載體中(例如，聚合的微粒或可植入裝置)可以提高給藥的效率，特別是對於口服給藥。含有藥學上可接受的載體和有效量的本發明的化合物的藥物組合物也處在本發明的範圍內。該藥物組合物可用於治療如上所述的疾病。藥學上可接受的載體包括溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑，以及等滲劑和吸收延遲劑。 本發明的藥物組合物可以使用常規方法被配製為用於不同給藥途徑的劑型。例如，它可以被配置為用於口服施用的膠囊、軟明膠膠囊劑(gel seal)或片劑。膠囊可以含有任何標準的藥學上可接受的材料，例如明膠或纖維素。片劑可以根據常規程序通過壓縮組合物與固體載體和潤滑劑的混合物來配製。固體載體的實例包括澱粉和糖膨潤土(sugarbentonite)。組合物也可以以含有粘合劑，例如乳糖或甘露醇、常規填料和製片劑的硬殼片劑或膠囊劑的形式來施用。可以通過胃腸外途徑施用藥物組合物。胃腸外劑型的實例包括活性劑的水溶液、等滲鹽水或5%葡萄糖，或其他公知的藥學上可接受的賦形劑。環糊精或其他增溶劑是熟悉本領域的人員公知的，可以用作用於治療劑給藥的藥物賦形劑。可以在體外和體內評估本發明的組合物的效力。參見，例如，以下的實施例。簡要地，可以在體外測試該組合物誘導活化的T細胞死亡的能力。對於體內研究，可以將組合物注射到動物(例如，小鼠模型)中，然後獲取它的治療效果。根據該結果，可以確定合適的劑量範圍和給藥途徑。以下的具體實施例被認為僅僅是說明性的，無論如何不是對所公開的其餘部分的限定。不需進一步的詳細描述，相信本領域的技術人員可以根據在此的說明將本發明利用到最大程度。此處引用的全部出版物作為參考將它們完全地引入。製備小鼠脾細胞懸液將小鼠脾臟浸泡在8ml的Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)中，用無菌蓋玻片輕輕地切碎，轉移到15ml離心管(Costar)，在200x g下離心5分鐘。棄去上清液，通過輕敲管壁將細胞團粒重懸浮在殘餘的緩衝液中。通過添加Iml的RBC裂解緩衝液(0.6M NH4CIjO. 17MTris-base, pH 7. 65)裂解汙染紅細胞(RBC)，隨後在室溫下孵育2min,用9ml的HBSS快速中止。將細胞在200x g沉澱5分鐘，洗滌兩次，重懸浮在RPMI培養基中。用血細胞計(Cambridge Scientific Inc.)和臺盼藍排斥測定混合物中細胞的濃度和存活力。製備抗T細胞、誘導凋亡的單克隆抗體通過用Concanovalin A活化的人T細胞免疫小鼠來產生誘導T細胞凋亡的單克隆抗體，並篩選它們結合活化人T細胞以及隨後誘導T細胞的細胞凋亡的能力。根據Kohler和Milstein ((1976)Euro J Immunol 6,511-519)的公知的細胞融合方法產生分泌期望抗體的雜交瘤來製備單克隆抗體。根據這些方法產生的三個雜交瘤分泌單克隆抗體，分別稱為ml28-9F9、ml52-15A7和ml66_43B6，其能在體外誘導T細胞的細胞凋亡。將每個雜交瘤的濃縮的培養物上清液在20000x g旋轉10分鐘，用結合緩衝液(0. IM醋酸鈉，pH 5.0)以I : I的比例稀釋上清液。用3-5ml的結合緩衝液洗滌蛋白G柱(約Iml床體積(bed volum))三次。將澄清的培養物上清液加載到蛋白G柱上，收集流通物並再加載到柱上。然後用6-10ml結合緩衝液洗滌柱，用5ml洗脫緩衝液(0. IM甘氨酸-HCl，pH 2.8)從柱上洗脫結合的抗體。每個級分含有Iml洗脫的抗體，通過將每Iml級分與50微升IM的Tris-HCl、pH 7. 5混合來將洗脫的級分調節到中性pH值。集中含有抗體的級分，相對2升PBS、pH 7. 4透析三次，每次透析三小時。根據Bradford描述的方法使用Bio-Rad蛋白質分析(BIO-RAD，Hercules, CA)來測定抗體樣品中的蛋白濃度。通過單克隆抗體誘導活化人T細胞的死亡將活化的T細胞(參見上面)重懸浮在含有5ng/ml的IL_2的RPMI培養基中至5x IO5 細胞 /ml 的終濃度，並用對照 Ig、ml28-9F9、ml52-15A7 或 ml66_43B6 處理。公知的是誘導T細胞死亡的抗體能夠用做治療劑來治療T細胞相關的疾病，例如移植排斥、自體免疫疾病和過敏症。針對人T細胞產生了三種單克隆抗體，檢查了這些單克隆抗體誘導活化人T細胞的細胞凋亡的能力。將含有由雜交瘤細胞系ml28-9F9、ml52-15A7或ml66-43B6分泌的單克隆抗體的培養物上清液分別與未活化的人T細胞(第0天)或體外活化的人T細胞(第7天)孵育6小時。孵 育後細胞用annexin V染色，進行FACS分析。設門於(gated)CD3陽性細胞以確定體外活化的人T細胞或靜息人T細胞的計數。凋亡的細胞是annexin V染色陽性的。表I概述了在所有掃描的T細胞中凋亡的T細胞的百分比。出人意料地，由雜交瘤細胞系ml28-9179、ml52_15A7和ml66_43B6分泌的單克隆抗體誘導了體外活化的人T細胞的死亡但不影響未活化的人T細胞。這種誘導活化的T細胞的細胞凋亡而不影響靜息T細胞的能力是細胞凋亡途徑的獨特特徵，並且是靶向T細胞介導的疾病的治療試劑的支配性特徵。表I凋亡的T細胞的百分比
權利要求
1.由X1-X2-X3-X4-X5表示的分離的表位的三維構象，其中在活化的T細胞上的所述表位與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X1 是 Tyr> Trp> His 或 Met ；X2 是 Asp ；X3 是 Ser、Phe> Pro、Glu 或 His ; X4是任何胺基酸；和 X5 是 Pro、Tyr> His 或 Trp0
2.包含X1-X2-X3-X4-X5的分離的多肽，其中在活化的T細胞上的所述多肽與配體的結合誘導所述細胞的死亡，和X1 是 Tyr> Trp> His 或 Met ；X2 是 Asp ；X3 是 Ser、Phe> Pro、Glu 或 His ; X4是任何胺基酸；和 X5 是 Pro、Tyr> His 或 Trp0
3.權利要求2的多肽，其中所述多肽長度是5到1500個胺基酸。
4.權利要求3的多肽，其中所述多肽長度是5到150個胺基酸。
5.權利要求4的多肽，其中所述多肽長度是5到15個胺基酸。
6.權利要求2的多肽，其中所述多肽選自SEQID NO :4和6_13。
7.權利要求2的多肽，其中所述多肽是X1-X2-X3-X4-X515
8.抗體，其與具有權利要求I的三維構象的表位結合併且誘導活化的T細胞死亡。
9.權利要求8的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
10.製備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有權利要求I的三維構象的表位。
全文摘要
本發明涉及誘導T細胞死亡的表位，具體地，涉及誘導細胞死亡的表位和含有所述表位的多肽。還公開了誘導活化的T細胞死亡的化合物、製備針對所述表位的抗體的方法、鑑定與所述表位結合的化合物的方法、誘導活化的T細胞死亡的方法和含有所述化合物的藥物組合物。
文檔編號C07K5/107GK102617708SQ20121007929
公開日2012年8月1日 申請日期2005年5月11日 優先權日2004年5月11日
發明者張重男, 林榮華 申請人:艾比吉諾米克斯合作公司