小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法以及所構建的轉化體系的製作方法

2023-06-07 10:55:21 1

專利名稱：小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法以及所構建的轉化體系的製作方法
技術領域：
本發明涉及小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法以及利用該方法所構建的轉化體系。
本發明採用普通小球藻作轉化受體。普通小球藻(Chlorella vulgaris)屬於單細胞綠藻。它的體積小，直徑約3～5μm，能在固體培養基上生長，並可以象細菌一樣，劃線分出單克隆藻落，理論上認為來源於同一個細胞，因此轉化後的細胞用直接挑取單克隆藻落的方法就可以選出轉化體，無需經過高等植物必需的再生培養，極大地簡化了轉化培養體系。它的生活周期比一般高等植物短很多。通常，單克隆藻落接入20ml培養液中，50～60小時就可得到約108個/ml的藻液。普通小球藻屬自養型生物，生命力強，對培養基的要求不高，少量的無機鹽就可維持其正常生活；對光照強度，光照時間的要求也不嚴格，暗環境下同樣可以分裂增殖，與正常條件下培養的細胞無顯著性差異。小球藻屬於真核生物。來源於真核生物的外源基因在小球藻中能夠被糖基化，醯基化或者其它轉錄後修飾，呈現與天然蛋白一樣的活性。更重要的是，單細胞的小球藻是微藻中首先被開發利用的種類之一，其培養方式已由開放池培養發展為生物反應器中連續培養。
小球藻的營養價值相當高。蛋白質含量約佔50～80％，組成這些蛋白質的胺基酸中至少有十種在動物體內不能合成，而且含量豐富，約為總蛋白質的42％。脂類的含量高，用不同的培養方法，其含量有變動，幅度為20～85％。大多數脂類是不飽和脂肪酸，還含有一些微量不常見的脂肪酸。它所含的糖類物質同其它植物相比較，纖維素含量少，葡萄糖和果糖含量多，易於吸收。同時，它的維生素含量也很豐富，經測定，維生素A，B1，B2和煙酸的含量是同等重量的某些蔬菜的五倍到五十幾倍。通過這些數據，我們不難看出，小球藻是一種具有經濟價值的生物，可作為飼料，肥料，而且是潛在的未來食品和醫療保健用品。本發明中將工程抗體基因轉入小球藻，把工程藻大量繁殖擴增，那麼在收穫工程抗體的同時還可以從小球藻中得到其它有用的蛋白質、脂肪酸和維生素類營養物質，達到綜合利用的效果。
藻類基因工程的研究開展得比高等植物晚許多。八十年代初期，研究者依據轉化高等植物所獲得的經驗，嘗試著將外源基因轉入藻類。萊茵衣藻(Rochaix JD，1982；Leung WC，1985；Debuchy R，1989；Mayfield SP，1990；Hall LM，1993)、傘藻(Neuhaus A，1986)、小球藻(Jarvis EE，1991；Dawson HN，1997；Hawkins RL，1999)、紅藻(Cheney DP，1992；Kubler JE，1994)、硅藻(Dunahay TG，1995)、褐藻(秦松，1994)陸續成為了轉化對象。採用的轉化方法大體上與轉化高等植物類似，有原生質體PEG法、電擊法、基因槍法、微注射法等等。經過近二十年的努力，人們對藻類遺傳背景的認識深入了，許多藻類的轉化體系也已初步建成，可以在實際應用過程進一步中加以完善。
藻類遺傳轉化體系的建立是很有意義的。作為新興的模式生物和其他生物類別相比較，其特有的長處是和原核生物表達系統相比，它能夠進行翻譯後修飾，保持外源蛋白的天然性狀；和哺乳動物表達系統相比，它操作簡單，生長迅速，周期短，對生活環境要求不高，還可用發酵技術大批量生產，成本低；和酵母細胞表達系統相比，它能利用其它真核生物的啟動子，因此啟動子可選擇範圍大。更優越的是，細胞內含物豐富，營養價值高。可以用它作為生物反應器來生產藥用外源蛋白或其它有用蛋白。
然而，在植物轉基因工作中經常碰到外源基因不易整合到染色體基因組，或整合後表達不穩定和與預期結果不一致的現象時有發生，如插入基因的拷貝數，含多個插入基因時表達水平反而低；又如含強啟動子的外源基因，在轉化體中有時不表達或表現出內源基因失活；或具有相同啟動子的兩種外源基因，相繼轉化同一植物，結果先轉入的基因失活；或正義、反義DNA的轉入，使內源基因失活等，目前稱之為轉基因沉默現象。造成這些現象的原因目前已發現有1.DNA甲基化作用這一作用本是細胞整個生活周期中重要的調控機制。當外來基因剛進入細胞時，胞內限制酶會通過識別DNA甲基化程度來判斷該基因是自己的或非己的，進而降解非己DNA達到穩定自身DNA結構的目的。如果外源基因僥倖逃避過這一監視系統而整合入染色體組，又由於外源基因鹼基組成與插入位點處原有鹼基組成的不一致，破壞了原有染色體的組織結構，則細胞中類似於細菌限制修飾系統會進行識別並將之甲基化，結果導致外源基因轉錄受抑制，表達被阻斷而失活。在工作中常表現為用Southern Blot能檢測到外源基因的完整插入，而在細胞水平或個體水平上卻檢測不出外源基因的表達產物。再用對甲基化敏感的限制性內切酶分析，可發現外源基因已被甲基化。
2.外源基因拷貝數的影響大多數轉基因植物中發現，外源基因多拷貝地整合入基因組DNA，往往導致外源基因失活。究其原因，可能是多個拷貝的外源基因發生異位配對，形成DNA三鏈或四鏈結構，致使染色體局部構型改變，增加了異染色質化的可能性所致(Howard-Flander P，1984)。
3.反式失活作用當採用相同的啟動子引導不同的外源基因時。外源基因的表達並不象預計的一樣高。這一現象曾讓研究人員迷惑不解。後來，人們推測這一現象的發生可能是因為相同的啟動子競爭資源有限的轉錄因子，引起轉錄水平降低從而影響到外源基因的翻譯水平。這一推測於1996年被Park等人所證明(Park YD，1986)。通常反式失活是由啟動子區域內的一段同源序列引起，已有報導指出，啟動子區域內90bp的同源序列就足以抑制兩個基因的表達水平(Vaucheret H，1993)；反式失活引起的基因表達抑制的程度還與其在宿主染色體中的位置相關(NeuhuberF，1994)。因此，採用非同源的啟動子引導不同外源基因是避開反式失活最直接的方法。
4.共抑制現象 共抑制現象最早在矮牽牛上發現(Mol et al.1989，Napoli et al.1990，van der Krol et al，1990)，將編碼矮牽牛查爾酮合成酶的Chs基因轉入開深色花的矮牽牛中，結果42％的轉基因植株開全白花或雜色花，即外源和內源Chs基因的表達均受到抑制。這一現象產生的機制與反式失活相似，也是由同源序列引起，然而兩者卻存在顯著性差異。由共抑制引起的基因失活，核內Chs mRNA表達量仍高，只是在細胞質中mRNA才被降解，抑制發生在轉錄之後。對這一現象的解釋有三種不同的假說。第一種假說來自Tanzer(Tanzer MM，1997)，他認為mRNA的降解過程發生於細胞質中。同時，Lee證明多聚核糖體是mRNA降解所必需的(Lee KY，1997)。第二種假說來自Cornelissen，認為反義RNA加速了mRNA的降解過程(Cornelissen M，1989)。在此基礎上人們提出了第三種假說特定類型mRNA特異性降解是由於缺乏特異tRNA而引起的轉譯未成熟終止(Murray EE，1991)。
5.染色體位置效應人們發現外源基因進入細胞後常常呈現不同的表達強度，有的超出正常值，有的與正常值相近，有的表達很少或幾乎完全受抑制。研究人員推測，這些意外的表達結果主要由於外源基因整合入細胞染色體的位點及臨近DNA順式作用元件的影響所致，即染色體位置效應。1990年，Raya al Shawi證實了這一推斷。他將MUP啟動子引導下的HSV-TK基因轉化小鼠時發現，大部分轉基因小鼠在外分泌腺中能檢測到HSV-TK活性及其mRNA。但是編號為64的轉基因小鼠系卻沒有HSV-TK蛋白表達。為弄清HSV-TK的不表達是因為基因本身的原因，如點突變、DNA斷裂、重組等，還是因為受到HSV-TK插入染色體位點的微環境影響所致，他將64系中外源片段重新轉化小鼠。結果證明，HSV-TK在外分泌腺的不表達是緣於染色體位置效應(Raya al-showi，1990)。
同時期，在研究由人β-珠蛋白基因家族突變引起的廣譜遺傳病的過程中，科學家們幸運地發現，遠離β-珠蛋白基因上遊50kb及下遊30kb的區域對β-珠蛋白基因家族的表達起著關鍵性的作用。當這一「微位點」引入載體後，轉基因小鼠中外源基因不依賴於整合位點，呈現依賴於拷貝數的組織特異性表達(Grosveld F，1987)。這一抗拒位置效應的區域是紅細胞特異的DNase I超敏位點，稱為位置控制區(LCR)。LCR的發現為基因治療β-珠蛋白基因家族突變造成的遺傳病解決了一大難題，為外源基因在生物體內排除位置效應幹擾，進行穩定表達提供了一則可行性方法。另一種能抗拒位置效應的順式作用元件稱核基質附著區(MAR)或染色體骨架附著區(SAR)。電鏡下觀察染色體的高級結構是一簇一簇的突環。每一突環被認為是一個結構域，每個結構域中的一個基因或多個基因在調控或功能上是明確相關的。因此，理論上認為，如果外源基因兩端帶有MARs，如人載脂蛋白B(apoB)的MARs(Kalos M，1995)，就構成了一個結構域，可以免受相鄰結構域中順式作用元件的影響，按照自己應有的方式表達蛋白。但是，研究表明，來自雞、豌豆、酵母或菸草的MARs不能抗拒某些位點上外源基因的反式失活(Vaucheret H，1998)。
Dnase I超敏位點大多數是轉錄調控元件，所以人們猜測，除了LCRs和MARs外，某些DNase I超敏位點可能具有相似的抵抗臨近DNA順式元件的作用。Chung等人提出，雞β-珠蛋白5』端DNase I超敏位點可以在紅細胞中充當絕緣子，在果蠅中保護外源基因免受位置效應的影響(Chung J，1993)。
除了採用某些具絕緣作用的DNA區域來消除位置效應外，定向替換或同源重組是保證外源基因穩定表達的另一有效方法。Le Mouellic H用E.coli的lacZ替換下Hox-3.1，利用Hox-3.1原有的ATG及整套轉錄翻譯系統，得到了與體內Hox-3.1相似表達量的lacZ蛋白(Le Mouellic H，1990)。但是要實現定向替換並不是件容易的事情，一不小心就可能破壞蛋白移碼框，翻譯出錯誤蛋白。同源重組雖然在理論上可行，但是實際操作起來卻很被動，不可控因素太多，目前多採用較長的同源序列來保障同源重組的發生是較有效的措施。
消除上述影響的對策當前已可以採用一些辦法針對不同的影響進行消除。可直接使用去甲基化試劑，如5-氮胞苷(5-azacytidine)來逆轉(Zhu Zhen，1991)外源DNA甲基化，或通過有性雜交(Scheid OM，1991)、嫁接(van Slogteren GMS，1984)、體外培養(Scheid OM，1991)以及改變外界生存環境(Meyer P，1994)等改變外源DNA甲基化程度。用農桿菌轉化法轉入外源基因，可避免多拷貝插入；或儘量選擇完整單拷貝插入事件；構建表達載體時避免同源序列，其中包括啟動子、結構基因及標記基因中的序列。另外，採用定點整合方式如同源重組或核骨架結合序列(MAR)等，可有效減少多拷貝插入、反式失活、共抑制現象以及染色體位置效應的發生。
本發明採用同源重組方法來克服轉基因植物後代中出現的上述意外事件，並通過構建同源重組載體達到此目的。同源重組表達載體是指外源基因的表達載體中，含有一段核苷酸序列與受體細胞染色體組DNA中的某一段序列相同，當該表達載體進入受體細胞後這兩段序列之間發生同源重組，外源基因整合到受體細胞染色體組中的特定部位，獲得穩定表達。這一方法最大限度地保證外源基因以單拷貝的方式整合入受體細胞基因組，同時通過同源整合，也可以儘量避免外源基因的甲基化和染色體位置效應的幹擾。
本發明採用的是小球藻硝酸還原酶基因作為同源序列，其原因有第一，小球藻中硝酸還原酶基因是活性表達的單拷貝基因。如果外源基因同源重組進硝酸還原酶基因位點就可以保證至少有一個拷貝的外源基因能夠活性表達。第二，硝酸還原酶基因可以作為篩選標記基因來判斷同源重組事件是否發生。因為同源重組事件發生後，硝酸還原酶基因被破壞，轉基因藻不能利用硝酸鹽，所以野生型小球藻能在以硝酸鹽為唯一氮源的培養基上生長，硝酸還原酶缺陷型小球藻則不能。
另外，本發明採用三種不同的啟動子(PGK，CaMV35S和Ubi)分別啟動兩個選擇標記基因和目的基因，以求進一步避免外源基因之間發生重組而出現反式失活，導致基因不表達。
本發明構建的同源重組表達載體中含有三種選擇標記基因。首先是由PGK啟動子驅動的磷酸新黴素轉移酶(neo)基因，用G418作選擇壓力。小球藻對多種抗生素都有耐受性，但對G418敏感，這是通過抗性初步篩選轉基因小球藻的良好基因；其次是由CaMV35S啟動子驅動的綠色螢光蛋白(GFP)酶基因，在長波紫外線照射下GFP發出綠色螢光，可在活體條件下對轉化體進行確定；第三是硝酸還原酶基因缺陷型，由於該基因的缺失，轉基因藻細胞不能在含硝酸鹽的培養基上生長，只能利用氨態氮作唯一氮源，因此只需挑選只在含氯化氨的培養基上生長，不能在含硝酸根的培養基上生長的藻落即可。
本發明的另一個目的是提供一種能優質、高產、價廉地生產外源有用目的蛋白(如工程抗體)的小球藻株系。同時小球藻內的其它營養成分也還可以分類提取綜合利用。
本發明的另一目的是提供一個能使外源基因定向的，單拷貝同源整合的、便於篩選的質粒載體，供低等真核藻類植物轉化之用。
本發明提供了一種小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法，該方法包括a.將小球藻硝酸還原酶基因和外源基因表達盒進行連接，使該外源基因表達盒的兩端分別連有小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列，從而構建一種可以轉化小球藻的同源重組表達載體；b.使用所構建的同源重組載體轉化小球藻；c.篩選並繁殖發生了同源重組的小球藻。
在本發明的方法中，對於可以轉化小球藻的骨架載體沒有特別的限制，例如可以是pBCGP35ab，或者pBluescriptSK(+/-)。所述的外源基因可以是任何一種需要表達的外源基因，例如抗膀胱癌單鏈抗體的基因。
在本發明的方法中，為了便於轉基因藻的篩選，所述的外源基因表達盒中最好還含有綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。
在本發明的方法中，所述的外源基因表達盒位於小球藻硝酸還原酶基因之中，其一端含有小球藻硝酸還原酶基因的3′端序列，另一端含有小球藻硝酸還原酶基因的5′端序列。所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度最好分別為3.6kb和3.0kb。例如所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度分別為SEQ ID NO1和SEQ IDNO2所示的序列。
在本發明的方法中，所述小球藻藻種可以為普通小球藻或者橢圓小球藻。
本發明還提供了一種小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系，其特徵在於，在該小球藻的基因組中編碼硝酸還原酶的基因中插入了一種外源基因表達盒。
在本發明的所述的轉化體系中，所述的外源基因可以為抗膀胱癌單鏈抗體的基因。所述的外源基因表達盒中還可以含有綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。在外源基因表達盒插入位點的兩側小球藻硝酸還原酶基因片段的長度可以分別為3.6kb和3.0kb。例如，在外源基因表達盒插入位點的兩側小球藻硝酸還原酶基因的片段可以分別具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
在本發明的所述的轉化體系中，所述小球藻藻種可以為普通小球藻或者橢圓小球藻。
本發明還提供了一種用於構建小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的同源重組載體，該載體含有外源基因表達盒，並且該外源基因表達盒的兩端分別連有小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3，端的序列。
本發明的同源重組載體可以是以BluescriptSK(+/-)為骨架構建的。所述的外源基因可以為抗膀胱癌單鏈抗體的基因。所述的外源基因表達盒中還可以含有綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度分別為3.6kb和3.0kb。例如，所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度可以分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
因此，本發明提供了含硝酸還原酶基因同源序列片段和由PGK-NEO和CaMV35S-GFP作為標記基因的同源重組質粒pBCG35S，該質粒中可插入任何目的基因，在轉入小球藻細胞後獲得硝酸還原酶基因缺陷型同源重組轉化體。
本發明提供了已經在上述質粒中插入工程抗體基因(實例中用抗膀胱癌單鏈抗體基因)的質粒pBCG35Sab，該目的基因是在強有力的Ubiquitin啟動子驅動之下表達的。
本發明還提供了被pBCG35Sab轉化的藻株，該藻株可高效的生產出有抗原結合活性的工程抗體，實例中為抗膀胱癌單鏈抗體。
圖2.質粒pBCGP的物理圖。
圖3.硝酸還原酶基因(NR)基因5』端3.6kb和3』端3.0kb片段引物和接頭。
圖4.擴增硝酸還原酶(NR)基因片段的電泳圖。
圖5.質粒pBCGP3的物理圖。
圖6.質粒pBCGP35的物理圖。
圖7.質粒pBP35的物理圖。
圖8.質粒pBCGP35ab的物理圖。
圖9.小球藻生長曲線圖。


圖10.轉基因小球藻中的GFP在螢光顯微鏡的紫外線激發下的表達(細胞中黃色斑點)。
圖11.轉基因小球藻在不同氮源培養基上的生長狀況。
圖12.DNA斑點雜交結果。
圖13.轉基因小球藻可溶性蛋白質SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。
實施例(一)硝酸還原酶基因缺陷型同源重組質粒的構建以pBluescriptSK(+/-)為骨架質粒，構建一個內含不同啟動子驅動、轉錄方向不同的抗膀胱癌單鏈抗體(Anti-bladder carcinoma scFv)基因、綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)的表達質粒。在這三個基因的兩側分別是3.6kb、3.0kb、的小球藻硝酸還原酶基因(NR)的5`端和3`端序列的同源重組質粒。
根據質粒pBluescriptSK(+/-)上的酶切位點，不同基因的插入位點如下在該質粒的HindIII和EcoRI之間插入綠色螢光蛋白基因(GFP)，在EcoRI和SmaI之間插入新黴素磷酸轉移黴基因(neo)，以兩端相同的黏末端HindIII插入抗膀胱癌單鏈抗體基因，在HindIII和SalI之間，以及SmaI間連接上硝酸還原酶基因(NR)片段。
硝酸還原酶基因缺陷型同源重組質粒的構建程序如下1.CaMV35S-mGFP4片段插入質粒pBluescriptSK(+/-)質粒pBIN35S-mGFP4中載有綠色螢光蛋白基因(約735bp)，酶切圖譜顯示，它位於XbalI和SacI位點之間，5`端上遊為35S啟動子(約800bp)驅動，3`端下遊為NOS終止子(約260bp)。
從pBIN35S-mGFP4中用HindIII、EcoRI切下CaMV 35S-mGFP4片段，並以其粘末端插入質粒pBluescriptSK(+/-)，篩選得到重組子pBCG。HindIII、EcoRI雙酶切質粒pBCG，得到一條長約1.8kb的帶，證明插入成功(圖1)。
2.PGK-neo片段的插入質粒pPNT中PGK-neo片段與質粒pBCG缺乏合適的匹配位點，無法直接插入。因此首先用SmaI、SacI從質粒pPNT切下PGK-neo片段，連入質粒pUC19，建成質粒pUPN。然後利用質粒pUC19多克隆位點中的EcoRI，以EcoRI、SmaI雙酶切切下PGK-neo片段再插入質粒pBCG中，篩選得到重組子pBCGP(圖2)。
3.硝酸還原酶(NR)基因5』端3.6kb和3』端3.0kb片段的擴增和插入為了擴增硝酸還原酶(NR)基因5』端3.6kb和3』端3.0kb兩個片段，人工合成兩對引物(圖3)，以小球藻總DNA為模板，進行PCR擴增(圖4)。隨後，將NR基因3』端3.0kb片段以平端連入質粒pBCGP。篩選時，用MluI位點的有無來判斷其是否已經插入，用KpnI單酶切後各條帶的大小來判斷其插入方向。當其插入方向與CaMV 35S-mGFP4同向時，酶切後各帶大小分別約為3.0kb和6.6kb。當其插入方向與CaMV 35S-mGFP4反向時，酶切後各帶大小分別約為3.6kb和6.0kb。選擇插入方向與CaMV35S-mGFP4同向的重組子，定名為pBCGP3(圖5)。接著，將NR基因5』端3.6kb片段以兩匹配粘端HindIII和SalI連入質粒pBCGP3，篩選得到重組子pBCGP35並酶切鑑定(圖6)。
4.Ubi-scFv片段插入質粒pBCGP35Ubiquitin啟動子(Ubi)是真核生物中表達非常強的啟動子，用它來驅動單鏈抗體將會使其得到大量的表達。本發明用質粒pUbi-GUS作Ubiquitin啟動子的供體，用BamH1酶切該質粒去除GUS基因的編碼序列(約2.0kb)後，回收其大片段自連產物形成的質粒pUB。再從抗膀胱癌單鏈抗體(anti-bladder scFv)的載體質粒pWAI80上，用NotI、EcoRI雙酶切下的anti-bladder scFv片段，與一個帶有五個串聯組氨酸密碼子(His)5和終止密碼子的小分子接頭(圖4)相連，然後，用T4 DNA Polymerase將該連接片段處理為平端，並以平端方式插入pUB中Ubiquitin啟動子的下遊，經轉化E.coli篩選得到重組子pBP35。正確連接的重組子的鑑定，是根據在靠近Ubi啟動子處的BamH1位點缺失，而靠近35S PolyA的BamHI位點保留而得。因此若scFv插入方向正確，用EcoRI，BamHI分別單酶切重組子，可得到各約1.2kb和0.2kb的小帶。如果scFv基因的插入方向相反，用EcoRI和BamHI分別單酶切重組子，會得到各約0.5kb和0.2kb小帶。電泳結果顯示，scFv基因已以正確的方式插入Ubiquitin啟動子的下遊(圖7)。接著，用HindIII酶切下質粒pBP35中的Ubiquitin啟動子+anti-bladder scFv+(His)5+終止密碼子片段(Ubi-scFv)，以HindIII粘端插入質粒pBCGP35，EcoRI單酶切可鑑定重組子的插入方向若Ubi-scFv片段插入方向與CaMV 35S-mGFP4片段反向，EcoRI單酶切重組子將得到1.2kb、3.1kb和11.9kb三條帶；若Ubi-scFv片段插入方向與CaMV 35S-mGFP4片段同向，EcoRI單酶切重組子將得到1.2kb、1.6kb和13.4kb三條帶。選擇其插入方向與GFP基因啟動方向相反的重組子為最終質粒載體pBCGP35ab，圖8顯示其電泳結果。
(二).Ubi-scFv的硝酸還原酶基因缺陷型同源重組質粒在普通小球藻中的表達1.用作受體細胞的普通小球藻的選取用挑選單克隆藻落的方法，選出生長旺盛的藻落作受體藻株，轉化前的小球藻培養於以硝酸鹽為唯一氮源的培養基(MgSO40.20g/l；KH2PO40.67g/l；K2HPO43.50g/l；Na3C6H5O7·H2O 1.00g/l；1mol/l KNO320ml/l；微量元素母液10ml/l；50％Glucose 20ml/l；pH7.4。微量元素母液Fe(NO3)3·9H2O1000mg/l；FeSO4·7H2O 500mg/l；H3BO3300mg/l；MnSO4·H2O 150mg/l；ZnSO4·7H2O 22mg/l；CuSO4·5H2O 8mg/l；CoCl2·6H2O 2mg/l；(NH4)6Mo7O244mg/l)中，以保證被轉化前小球藻是NR基因野生型。選取對數生長期的小球藻用於基因槍轉化。從生長曲線(圖9)看，生長50-60hr的小球藻正處於旺盛的對數生長期，適於轉化。轉化後的小球藻培養於以氨鹽為唯一氮源的培養基上(即在上述培養基中用1mol/l NH4Cl取代1mol/l KNO3；用FeCl3取代Fe(NO3)3·9H2O)中，以確保發生同源重組的轉基因小球藻能夠存活下來。
2.基因槍轉化小球藻1).受體材料的製備轟擊前2-3hr，收集對數生長期小球藻藻液2ml(密度為2×108個/ml)，塗布於培養板的中心(直徑3cm)備用。
2).微彈(DNA-金粉懸液)的製備(參照Becker等的方法)稱取直徑1μm的60mg金粉於1.5ml的離心管中，加入lml無水乙醇，渦旋振蕩1-2min，重複振蕩後於10,000rpm離心1min。去上清，加入1ml dH2O充分混勻後再離心，去上清。重複上述步驟3次，將金粉懸浮於1ml dH2O中，4℃或室溫保存。
取上述金粉50μl(用前需渦旋振蕩)，加入10μl質粒DNA(0.5μg/μl)溶液。在3min內依次逐滴加入2.5mol/l的CaCl2·2H2O溶液(經高壓滅菌)50μl以及0.1mol/l的亞精胺溶液(經抽濾滅菌，宜現用現配，有效期1月)20μl，邊加邊渦旋振蕩。加入300μl無水乙醇，渦旋振蕩後靜置一會兒，10,000rpm離心10see，棄上清液。重新懸浮於100μl的無水乙醇中。可供5-10槍之用(10μl/槍)。
3.)基因槍轟擊小球藻細胞在無菌條件下，用70％乙醇對基因槍的表面及樣品室進行滅菌，同時將阻擋網、壓力膜(採用1100psi)、微彈載體及其固定器、固定工具用70％乙醇浸泡20min，置超淨工作檯內晾乾備用。將壓力膜固定蓋、微彈載體發射裝置用70％乙醇表面滅菌、吹乾備用。
使用固定裝置將微彈載體安裝在固定環上，確保其邊緣與固定環四周緊密接觸，吸取10μl充分懸浮的微彈DNA懸液均勻塗於微彈載體中央，乾燥1min左右(現用現配)。
安裝好可裂圓片、微彈載體後，將裝有受體材料的培養皿放置於樣品室支架上，安放於樣品室中合適的位置，關好樣品室。打開氦氣瓶閥們，使壓力穩定在比可裂圓片的耐受壓(1100psi)高約200psi的狀態。打開基因槍電源開關及真空泵開關，待真空度達到27英寸汞柱時，關閉真空泵閥門並啟動轟擊開關，使氦氣進入壓力室，待氦氣壓表升至可裂圓片最大耐受壓時圓片會破裂，此時應立即鬆開轟擊開關，將真空開關打至排氣檔，待真空度降為零時，即可取出樣品。
3.轉化後小球藻的篩選和克隆化經基因槍轟擊過的小球藻細胞孵育24hr後，鋪於含抗菌素G418 60μg/ml的以氨態氮作唯一氮源的培養基上篩選。15天後，陰性對照細胞死亡數達50％以上，並且與日俱增；轉化小球藻的死亡數相對較少。挑取抗性小球藻單克隆劃線於上述相同培養基上，反覆多次，以獲得來源於單個細胞的抗性藻落。為了進一步純化，本發明對初篩的抗性藻落繼續用兩種方法進行克隆化。一種同初篩一樣反覆挑抗性單克隆藻落劃線篩選；另一種方法是無限稀釋法。即先用含抗菌素的上述相同液體培養基將抗性藻落的細胞密度調至大約10個/ml，然後取100μl藻液加於96孔板的小孔中。理論上每個小孔中只有一個細胞，實際情況是大多數孔中含一個細胞，少數孔中沒有或含兩個細胞。96孔板置於35℃下培養，約5天後可見一薄層綠色小球藻細胞鋪於孔底部，而獲得純系。
4.轉基因小球藻的鑑定1.)GFP基因在轉化小球藻中的表達綠色螢光蛋白的特性是，在紫外線照射下發出綠色螢光。根據此特點，本鑑定在螢光顯微鏡下進行。在紫外線照射下，野生型小球藻呈現出鮮亮的紅色，這是葉綠體在紫外線作用下的表現，轉基因小球藻中GFP發綠色或黃綠色，在葉綠體的紅色背景下，顯現出黃色斑點(圖10)，說明綠色螢光蛋白基因已轉入小球藻。
2.)營養缺陷型表達測定成功轉化的小球藻由於含有上述質粒pBCGP35，是不能在以硝酸鹽為唯一氮源的培養基上生長的，因此，可以用不同氮源的培養板上的生長狀況對其進行鑑別。圖11顯示，大多數藻落能夠在以硝酸鹽為唯一氮源的培養基上生長的，只有L3克隆的生長受到抑制，說明其為硝酸還原酶基因缺陷型。
3.)斑點雜交鑑定將各單克隆藻落的總DNA點在尼龍膜上，以抗膀胱癌單鏈抗體基因片段為模板製備探針進行分子雜交。圖12顯示，質粒pBCGP35ab的DNA(陽性對照)雜交信號極強，野生型小球藻DNA(陰性對照)無雜交信號，若干轉化單克隆藻落有強的雜交信號，其中包括A14、B9、L3等克隆。
4).蛋白質SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳從上述單克隆藻落中提取蛋白，進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。結果顯示(圖13)在分子量為30kDa的附近，待測藻落中A14、B9和L3有特異條帶，與單鏈抗體分子量的大小相吻合。經掃描測定，表達量約為小球藻可溶性蛋白的1.1％。
(三)結論本發明構建的工程抗體基因小球藻同源重組質粒載體pBCGP35ab及其小球藻的轉化體系，在普通小球藻中高效表達了該單鏈抗體(Anti-bladder scFv)，其表達量可佔小球藻可溶性蛋白的1.1％。這一系統可用於單鏈抗體的生產。
序列表110中國科學院遺傳研究所北京安波特基因工程技術有限公司120小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法以及所構建的轉化體系130120012751602170PatentIn version 3.121012113588212DNA213Chlorella vulgaris4001atggctacag cacagaggca tcagcagcat cgccgcaagc acccgccgcc gagtgcggca 60aggcgccggt ggaggagccg ctgcagcccg gcactgacga gtacaagctg cacctgcccg120tcaccgaagt gctggacgca gacaagggca ccaaggacga gtggatcccc cggtgagctc180tccggctgcg gctcaagact gtgagccagg cggccggcgg ctgggctgcg gctggctccc240ccgtgcacct ctgctcatgc ctttctgcgt gggtgcagca gctctgccgc tgtgtgtcgg300cccggagatt gtgcatcttt gcagcagatg cgttcctcct ctgcaccttc ctggcccctc360acctgccggc gctgcaaaca cgtcgcacct ccttgcatgg ctgcacagcc tgcgtcgcct420cttgccaccc aacgcctccc cctgctgccc tgccccctgc aggcacccag accttgtgcg480gctcacaggg cggcatccct tcaacgtcga gcccatcccg tcccgcctct ttgagtcgta540catcacacca ccctccctgc actatgtccg caaccacgga gctgtaccgc agattaagtg600ggaggagcac cgcctggcag tcaacggtga gggggcgtgt atggctagct catagccagg660tagcgtgtct agctggctag ctatcgtgtc cagctagcct gcaagtgtac atggctagca720tggctgggcg ggcagcctcc acaacagcag 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1.一種小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法，包括a.將小球藻硝酸還原酶基因和外源基因表達盒進行連接，使該外源基因表達盒的兩端分別連有小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列，從而構建一種可以轉化小球藻的同源重組表達載體；b.使用所構建的小球藻硝酸還原酶基因同源重組表達載體轉化小球藻；c.篩選並繁殖發生了同源重組的小球藻。
2.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的可轉化小球藻的載體為pBCGP35，或者pBCGP35ab。
3.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的外源基因為抗膀胱癌單鏈抗體的基因。
4.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的外源基因表達盒中還含有綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。
5.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度分別為3.6kb和3.0kb。
6.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
7.按照權利要求1所述的方法，其中，所述小球藻藻種為普通小球藻或者橢圓小球藻。
8.一種小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系，其特徵在於，在該小球藻的基因組中編碼硝酸還原酶的基因中插入了一種外源基因表達盒。
9.按照權利要求8所述的轉化體系，其中，所述的外源基因為抗膀胱癌單鏈抗體的基因。
10.按照權利要求8所述的轉化體系，其中，所述的外源基因表達盒中還含有綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。
11.按照權利要求8所述的轉化體系，其中，在外源基因表達盒插入位點的兩側小球藻硝酸還原酶基因片段的長度分別為3.6kb和3.0kb。
12.按照權利要求8所述的轉化體系，其中，在外源基因表達盒插入位點的兩側小球藻硝酸還原酶基因的片段分別具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
13.按照權利要求8所述的轉化體系，其中，所述小球藻藻種為普通小球藻或者橢圓小球藻。
14.一種用於構建小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的同源重組表達載體，該載體含有外源基因表達盒，並且該外源基因表達盒的兩端分別連有小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列。
15.按照權利要求14所述的同源重組表達載體，其中，該載體是以BluescriptSK(+/-)為骨架構建的。
16.按照權利要求14所述的同源重組表達載體，其中，所述的外源基因為抗膀胱癌單鏈抗體的基因。
17.按照權利要求14所述的同源重組表達載體，其中，所述的外源基因表達盒中還含有綠色螢光蛋白基因(GFP)和新黴素磷酸轉移酶基因(neo)。
18.按照權利要求14所述的同源重組表達載體，其中，所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度分別為3.6kb和3.0kb。
19.按照權利要求14所述的同源重組表達載體，其中，所述的小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列長度分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
20.按照權利要求14所述的表達任何外源基因的同源重組表達載體，它是pBCGP35。
21.按照權利要求14所述的表達抗膀胱癌單鏈抗體基因的同源重組表達載體，它是pBCGP35ab。
全文摘要
本發明提供了一種小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的構建方法，包括將小球藻硝酸還原酶基因和外源基因表達盒進行連接，使該外源基因表達盒的兩端分別連有小球藻硝酸還原酶基因的5′端和3』端的序列，從而構建一種可以轉化小球藻的同源重組表達載體的步驟；本發明還提供了一種小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系和一種用於構建小球藻硝酸還原酶基因缺陷型穩定表達的轉化體系的同源重組表達載體。
文檔編號C12N15/63GK1414104SQ0113681
公開日2003年4月30日 申請日期2001年10月24日 優先權日2001年10月24日
發明者曾君祉, 熊英, 周志勇, 尹長城, 劉晶, 黃華樑 申請人:中國科學院遺傳研究所, 北京安波特基因工程技術有限公司