Bi-1基因在促進長春花細胞生長中的應用及方法
2023-06-06 21:43:46
Bi-1基因在促進長春花細胞生長中的應用及方法
【專利摘要】本發明提供了BI-1基因在促進長春花細胞生長中的應用，並提供一種促進長春花細胞生長、提高培養細胞產量（總生物量）的方法。實驗表明，通過在長春花細胞中過表達BI-1基因，可以促進長春花細胞的生長速度，提高培養周期內細胞的總生物量，在30天培養期內長春花細胞的總產量比非轉基因長春花細胞和轉基因對照細胞提高1.1倍。按照本發明方法，可提供可以快速生長的轉AtBI-1基因的長春花細胞系，這對於長春花細胞培養技術中提高長春花細胞總生物量具有重要的應用意義。
【專利說明】B1-1基因在促進長春花細胞生長中的應用及方法
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及B1-1基因在促進長春花細胞生長中的應用，以及利用擬南芥AtB1-1基因促進長春花細胞生長的方法。
(二)【背景技術】
[0002]長春花生物鹼是一類具有抗癌活性的天然產物。由於長春花生物鹼結構特殊，難以用化學方法進行人工合成，因此從天然長春花植物中提取長春花生物鹼是目前主要的生產方法。然而，由於長春花自然資源有限，研究探索不依賴和消耗自然資源的長春花生物鹼新型生產技術是國內外的重要發展趨勢之一。
[0003]長春花細胞離體培養法是近年來發展起來的一種生產天然抗癌物質的新型生物技術。細胞離體培養法具有不消耗自然資源、不佔用耕地、不受自然環境條件的影響等特點，因此受到國內外的廣泛重視。在細胞培養實踐中，細胞生長速度是決定培養細胞產量(生物量、細胞收穫量)的基礎，而培養過程中所獲得的細胞生物量是決定培養細胞中長春花生物鹼產量的基礎。由於植物細胞在離體培養過程中受培養環境和條件的限制，細胞生長速度慢，因此長春花細胞培養中生物量低是長期以來限制細胞培養法工業化生產長春花生物鹼技術大規模應用的主要原因之一。
[0004]細胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的一種細胞主動死亡過程，又稱為程序性細胞死亡(programmed cell death),是真核細胞的一種特殊的死亡形式。凋亡具有特定的形態特徵和生化標記。在動物體內，細胞增殖和細胞死亡的平衡維持對機體的發育與生命的維持至關重要。Baxinhibitor-1 (B1-1)是新發現的細胞凋亡抑制基因,其編碼產物是Bax調控的細胞死亡通路上的一個調控因子。B1-1最初以動物睪丸增強基因轉錄本而被克隆得到，是一個單拷貝，進化高度保守的基因。B1-1基因過表達與一些腫瘤發生有關係。細胞的增殖、分化和凋亡之間的平衡是細胞培養過程中一個重要特徵，也是生物體組織穩定性的先決條件。研究報導表明，B1-1過表達`是打破動物體組織穩定性，導致多種腫瘤發生的基礎。在離體培養的植物細胞中，由於不存在與動物腫瘤發生相類似的機制，因此從理論上講，B1-1過表達不可能將正常的植物細胞轉化為瘤細胞。
[0005]近年來研究發現，植物體內也具有和動物B1-1序列相似的基因。研究報導表明，植物B1-1基因在植物抗乾旱、耐鹽以及病原體侵染的耐受性等抵抗生物逆境和非生物逆境脅迫過程中起到重要作用。目前還未有利用植物B1-1基因促進長春花等植物細胞生長的研究報導。
(三)
【發明內容】
[0006]本發明目的是提供B1-1基因在促進長春花細胞生長中的應用，並提供一種促進長春花細胞生長、提高培養細胞產量(總生物量)的方法。
[0007]本發明採用的技術方案是:
[0008]B1-1基因在促進長春花細胞生長中的應用。實驗表明，通過在長春花細胞中過表達B1-1基因，可以促進長春花細胞的生長速度，提高培養周期內細胞的總生物量，在30天培養期內長春花細胞的總產量比非轉基因長春花細胞和轉基因對照細胞提高1.1倍。
[0009]優選的，所述B1-1基因為擬南芥AtB1-1基因。具體的，所述擬南芥AtB1-1基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本發明還涉及一種促進長春花細胞生長的方法，所述方法包括:將擬南芥AtB1-1基因連接到具有35S啟動子的表達載體質粒(如P⑶782、pCAMBIA1301等)，構建AtB1-1基因重組質粒，將AtB1-1基因重組質粒導入長春花細胞中，篩選穩定表達的陽性克隆並進行傳代培養，獲得可快速生長的轉基因長春花細胞。
[0011]所述傳代培養條件為:轉基因長春花細胞接種量0.04~0.06mg/mL,28°C ±2°C、130~150rpm黑暗培養；傳代培養所用的培養基為MS液體培養基+2.0mg/L NAA+2mg/LIAA+0.lmg/L CK，pH5.8±0.2。轉基因長春花細胞在上述培養條件下傳代培養5~6次(每15天按1:15體積比轉接一 次)，可獲得形態穩定的轉基因長春花懸浮細胞系。所得轉基因長春花懸浮細胞系培養條件同上述傳代培養條件。
[0012]所述MS液體培養基組成如下:硝酸銨1.65g/L、硝酸鉀1.9g/L、氯化鈣0.44g/L、硫酸鎂0.37g/L、磷酸二氫鉀0.17g/L、碘化鉀0.83mg/L、硼酸5.2mg/L、硫酸鎂22.3mg/L、硫酸鋅 3.6mg/L、鑰酸鈉 0.25mg/L、硫酸銅 0.025mg/L、氯化鈷 0.025mg/L、硫酸鐵 27.8mg/L、蔗糖30g/L，溶劑為水。
[0013]本發明的主要效果表現在:按照本發明方法，可提供可以快速生長的轉AtB1-1基因的長春花細胞系，這對於長春花細胞培養技術中提高長春花細胞總生物量具有重要的應用意義。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為轉基因長春花細胞中AtB1-1表達的RT-PCR檢測結果；
[0015]圖2為轉AtB1-1基因長春花細胞與非轉基因長春花野生型細胞和轉基因對照細胞的生長比較。
(五)【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此:
[0017]實施例1:轉AtB1-1基因長春花懸浮細胞系構建
[0018](I) AtB1-1 基因擴增:以含有 AtB1-1cDNA 序列的 pYX112-AtB1-GFP 質粒(該質粒由東京大學 Hirofumi Uchimiya 博士(uchimiyaOiam.u-toky0.ac.jp)提供。也可以使用其它含有AtB1-1cDNA序列的質粒，這些質粒可從已公開發表相關論文的作者處獲得，例如:Sanchez P, de Torres Zabala M, Grant M.AtB1-1, a plant homologue ofBax inhibitor-1, suppresses Bax-1nduced cell death in yeast and is rapidlyupregulated during wounding and pathogen challenge.Plant Journal.2000,21
(4):393-399.) DNA為模板，擴增回收AtB1-1。擴增引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成:
[0019]Pl:5』-CTGACTCGAGATGGACGGGTCCGGGGAGCAGCTT-3』[0020]P2:5』-CTGAACTAGTTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG-3』 。
[0021]PCR產物電泳後回收擴增的AtB1-1基因(SEQ ID N0.1)備用；
[0022](2)35S啟動子回收
[0023]在20 μ I反應體系中加入含有35S啟動子的P⑶782質粒(或其它含有35S啟動子的質粒，如PCAMBIA1301等)DNA5 μ g，2 μ IlOX相應酶切緩衝液(I XNE Buffer，上海生工生物工程技術服務有限公司)，1μ I限制性內切酶(XhoI/SpeI，7U)，用無菌水補至20μ 1，在最適溫度(37°C 土1°C)下反應3h，然後進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示切出了含有35S啟動子的大片段和GFP小片段，將含有35S啟動子的pCD782片段回收備用；
[0024](3) AtB1-1 酶切(Xhol/Spel)為粘性末端
[0025]為了保證連接的高效、穩定，將AtB1-1酶切為粘性末端，酶切體系和條件(2)，酶切產物回收備用；
[0026](4)將步驟(2)、(3)獲得的含有35S啟動子的pCD782片段和AtB1-1DNA連接。反應條件:16°C、過夜，連接後的產物將其命名為pER8-AtB1-l。
[0027]反應體系如下:
[0028]表1:pCD782、AtB1-1連接反應體系
[0029]
【權利要求】
1.B1-1基因在促進長春花細胞生長中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述B1-1基因為擬南芥AtB1-1基因。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述擬南芥AtB1-1基因序列如SEQID N0.1所示。
4.一種促進長春花細胞生長的方法，所述方法包括:將擬南芥AtB1-1基因連接到具有35S啟動子的表達載體質粒，構建AtB1-1基因重組質粒，以農桿菌侵染法將AtB1-1基因重組質粒導入長春花細胞中，篩選穩定表達的陽性克隆並進行傳代培養，獲得可快速生長的轉基因長春花細胞系。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述傳代培養條件為:轉基因長春花細胞接種量0.04~0.06mg/mL，28°C ±2°C、130~150rpm黑暗培養；培養基組成如下:2.0mg/LNAA，2mg/L IAA, 0.lmg/L CK，溶劑為 MS 液體培養基，ρΗ5.8±0.2。
【文檔編號】C12N5/10GK103740753SQ201310744930
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月28日 優先權日:2013年12月28日
【發明者】徐茂軍, 董菊芳, 金海紅, 孫麗娜, 朱雲, 阮家昭, 李夢雅 申請人:杭州師範大學