基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片方法和裝置與流程

2023-06-07 08:17:26 1

本發明涉及光學成像技術領域，具體涉及一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片方法和裝置，特別涉及環形偏離物鏡光軸照明樣品的離軸光束焦面共軛光學切片顯微術。

背景技術：

廣泛應用於生物醫學、材料學等領域的傳統寬場顯微鏡，由於具有較大的景深，較難獲取樣品內部三維結構的顯微圖像。光切片顯微術，是一種獲取樣品內部三維結構圖像的顯微術，進一步擴展了顯微鏡的應用範圍。光切片技術可分為螢光成像技術和非螢光成像技術，目前使用最多的是藉助於螢光成像的光切片技術，例如掃描共焦螢光顯微術、結構光照明螢光顯微術、選擇平面照明螢光顯微術。但是，對於非螢光樣品，只可利用樣品對照明光的散射光進行成像，由於信噪比相對較弱，比螢光成像的光切片技術更難實現。利用掃描共焦顯微術也可對非螢光樣品進行光切片成像。掃描共焦顯微術利用照明針孔和探測針孔的共軛物象關係，進行共焦的點照明和點探測成像，也就是使得來自照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所散射的光成像在探測針孔上，該點以外的任何散射光均被探測針孔阻擋，通過逐點掃描焦面處的樣品層，從而獲得比傳統顯微術更高的軸向解析度，實現光切片成像。顯然，逐點掃描的成像方式耗時，對動態物體成像非常不利，因此，對生物活體的光切片成像有局限性。結構光照明顯微術也可以對非螢光樣品進行光切片成像，但由於是採用結構光照明，照明裝置相對複雜。另外，利用螢光成像，需對樣品進行螢光標記，而螢光標記可能存在生物毒性，從而對樣品產生影響；激發螢光的激發光，波長較短，對樣品也可能存在光毒性。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是為了解決現有技術中的上述缺陷，提供一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片方法，可有效避免掃描共焦顯微術的逐點成像方式，提高光切片成像速度，以及避免螢光成像方法可能對樣品產生的生物毒性和光毒性。

本發明的另一個目的是為了解決現有技術中的上述缺陷，提供一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置。

本發明的第一個目的可以通過採取如下技術方案達到：

一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片方法，所述方法包括下列步驟：

一個大數值孔徑的物鏡和一個管鏡構成一個無限遠校正光學系統，物鏡的物方焦面與管鏡的像方焦面形成一對物象共軛面，非螢光樣品內的一個層面和物鏡的物方焦面重合，一環形分布光源發出的光束偏離物鏡光軸照明樣品，在管鏡的像方焦面處形成明視場圖像，通過一臺數位相機拍攝管鏡像方焦面處的圖像；

環形分布光源由m個子光源組成，每個子光源發出的光束均以傾角θ偏離物鏡光軸照明樣品；

每個子光源照明樣品在管鏡的像方焦面形成一幅圖像，點亮所有子光源同時照明樣品，將在管鏡的像方焦面形成由m個子光源單獨照明樣品的疊加圖像i(x,y)：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，相機拍攝該圖像，獲得樣品內一個層面的光切片圖像；

樣品臺在平移器的控制下，帶動樣品在物鏡的光軸方向移動，使得樣品內不同的層面和物鏡物方焦面重合，獲得樣品內多個層面的光切片圖像；

其中，m為整數，m≥4；傾角θ為照射樣品的光束與物鏡光軸之間的夾角，範圍為：30°≤θ＜90°；i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)分別為每個子光源單獨照明樣品時在管鏡像方焦面上形成的圖像，(x,y)為相機光敏面的像素點坐標。

進一步地，將環形分布光源的m個子光源分成n組，每次點亮其中一組光源照明樣品，相機依次拍攝每次照明樣品時所形成的圖像，將獲得的n幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、in(x,y)，利用這n幅圖像進行消除離焦像處理，獲得樣品內一個層面的光切片圖像i(x,y)，消除離焦像處理的算法，可優選：n幅圖像線性疊加算法i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+in(x,y)，或提取n幅圖像相同坐標像素點最大值算法i(x,y)＝max[i1(x,y),i2(x,y),…,in(x,y)]；其中n為範圍：2≤n≤m的整數，max[]為取最大值運算符。

進一步地，所述環形分布光源，由一個或幾個光源在一旋轉機構的控制下，繞物鏡4光軸旋轉形成，光源每旋轉一個方位角δφ，相機同步拍攝一幅圖像，將旋轉一周拍攝到的圖像進行線性疊加，獲得樣品內一個層面的光切片圖像；方位角δφ範圍：0＜δφ≤90°。

本發明的第二個目的可以通過採取如下技術方案達到：

一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置，所述裝置依次由環形分布光源、物鏡、管鏡和相機構成一無限遠校正光路，樣品置於樣品臺上，樣品臺在平移器的控制下可沿物鏡光軸平移；物鏡和管鏡的光軸相同，且通過環形分布光源的圓環中心；環形分布光源發出光束偏離物鏡光軸以傾角θ照射樣品，相機的光敏面和管鏡的像方焦面重合；計算機控制平移器的移動和相機的圖像拍攝。

進一步地，所述環形分布光源由m個子光源組成，且均勻分布形成一圓環形，每個子光源發出的光束均以傾角θ偏離物鏡光軸照明樣品。

進一步地，所述物鏡的數值孔徑na要足夠大，使得光源偏離物鏡光軸照明樣品時，在管鏡像方焦面處形成明視場圖像，範圍：0.75≤na＜2.0。

進一步地，所述環形分布光源與所述樣品之間設置有折射率匹配鏡，所述折射率匹配鏡為半球面平凸透鏡或圓錐透鏡，透鏡的底面和封裝有樣品的載玻片粘合在一起。

進一步地，所述環形分布光源由兩個設置在一個半圓環上的子光源組成，半圓環設置在一旋轉平臺上，旋轉平臺的轉軸和物鏡光軸重合，兩子光源對稱分布在所述物鏡的光軸兩側，在旋轉平臺的控制下，繞所述物鏡的光軸旋轉，形成環形偏離物鏡光軸照明樣品；

一臺計算機同時控制所述平移器的移動、所述旋轉平臺的轉動和所述相機的同步拍攝。

本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：

(1)掃描共焦顯微術是點對點的共焦成像，而本發明是面對面的共焦成像，成像速度更快，方便用於動態樣品成像。

(2)避免螢光成像可能對樣品產生的生物毒性和光毒性。

(3)相對結構光照明顯微術，本發明照明裝置簡單。

(4)操作簡單、方便實用。

附圖說明

圖1是實施例二中公開的基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置的結構示意圖；

圖2是焦面處樣品層在下側離軸光束照明下的成像示意圖；

圖3是焦面處樣品層在上側離軸光束照明下的成像示意圖；

圖4是焦面內離焦樣品層在下側離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖5是焦面內離焦樣品層在上側離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖6是焦面外離焦樣品層在下側離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖7是焦面外離焦樣品層在上側離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖8是實施例三中公開的基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置的結構示意圖；

圖9是實施例三中獲得的骨骼肌樣品的一個光切片圖像；

圖10是普通寬場顯微獲得的骨骼肌樣品的顯微圖像；

圖11是實施例四中公開的基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置的結構示意圖；

圖12是實施例四中獲得的肺支氣管樣品的一個光切片圖像；

圖13是普通寬場顯微獲得的肺支氣管樣品的顯微圖像；

圖中：1-環形分布光源，2-折射率匹配鏡，3-樣品臺，4-物鏡，6-管鏡，7-相機，8-平移器，9-計算機，10-旋轉平臺。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例一

傳統明視場光學顯微鏡，由於受到衍射的限制，軸向可分辨距離一般大於600納米，其參與成像的光束主要以物鏡光軸附近的近軸光束為主。為了提高顯微成像軸向解析度，獲取超薄光切片，本發明提出採用大數值孔徑物鏡，利用大傾角偏離物鏡光軸的光束進行成像。在各種傳統顯微成像系統中，參與成像的光束都以近軸光束為主，這是本發明與傳統顯微成像技術的最大區別。儘管暗場顯微鏡採用離軸照明方式，其目的是使得照明光束的直射光不能進入物鏡成像，保證背景是一個暗場來突顯微弱散射光所成的圖像，但這些用於成像的散射光仍然是以近軸光束為主。

本實施例公開了一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片方法，所述方法包括下列步驟：

一個大數值孔徑的物鏡4和一個管鏡6構成一個無限遠校正光學系統，物鏡4的物方焦面與管鏡6的像方焦面形成一對物象共軛面，非螢光樣品內的一個層面和物鏡4的物方焦面重合，一環形分布光源1發出的光束偏離物鏡4光軸照明樣品，通過一臺數位相機7拍攝管鏡6的像方焦面處的圖像；

其中，環形分布光源1由m個子光源組成，且均勻分布形成一圓環形，每個子光源發出的光束均以傾角θ離軸照明樣品；子光源為led光源或雷射光源，但不限於這兩種光源，子光源發出的光束可以直接照射樣品，也可先通過光纖傳輸再照射樣品。

每個子光源照明樣品在管鏡6的像方焦面形成一幅圖像，點亮所有子光源同時照明樣品，將在管鏡6的像方焦面形成由m個子光源單獨照明的疊加圖像i(x,y)：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，相機拍攝圖像，獲得樣品內一個層面的光切片圖像；

樣品臺3在平移器8的控制下，帶動樣品在物鏡4的光軸方向移動，使得樣品內不同的層面和物鏡物方焦面重合，獲得樣品內多個層面的光切片圖像；

其中，m為整數，m≥4；傾角θ為照射樣品的光束與物鏡光軸之間的夾角，範圍為：30°≤θ＜90°；i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)分別為每個光源單獨照明樣品時在管鏡像方焦面上形成的圖像，(x,y)為相機光敏面的像素點坐標。

物鏡4採用大數值孔徑的物鏡，物鏡4的數值孔徑na的範圍在0.75≤na＜2.0。

將環形分布光源的m個子光源分成n組，每次點亮其中一組光源照明樣品，相機依次拍攝每次照明樣品時所形成的圖像，將獲得的n幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、in(x,y)，利用這n幅圖像進行消除離焦像處理，獲得樣品內一個層面的光切片圖像i(x,y)，消除離焦像處理的算法，可優選：n幅圖像線性疊加算法i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+in(x,y)，或提取n幅圖像相同坐標像素點最大值算法i(x,y)＝max[i1(x,y),i2(x,y),…,in(x,y)]；其中n為範圍：2≤n≤m的整數，max[]為取最大值運算符。

將一個或幾個光源在一旋轉機構的控制下，繞物鏡4光軸旋轉，形成環形離軸照明，光源每旋轉一個方位角δφ，相機同步拍攝一幅圖像，將旋轉一周拍攝到的圖像進行線性疊加，獲得樣品內一個層面的光切片圖像；方位角δφ範圍：0＜δφ≤90°。

用載玻片封裝的樣品，環形分布光源1發出的離軸光束先透過一個折射率匹配鏡2再照射樣品。

對於一個無限遠校正光路系統，物鏡4的物方焦面與管鏡6的像方焦面具有物象共軛關係，相機7置於管鏡6的像方焦面，在環形大傾角的離軸光束照明樣品下，獲取物鏡4的物方焦面處樣品層的圖像，圖1為本發明的裝置示意圖。

根據阿貝相干成像理論，在相干照明模式下，照明光束照明到樣品後發生衍射，直透光方向為零級衍射光束方向(或零級角譜光束方向)。在物鏡光軸方向的照明光束其零級衍射光束仍然在光軸方向；在離軸光束照明下，其零級衍射光束也偏離光軸方向。零級衍射光束確定了成像系統對樣品在管鏡像方焦面所成像的位置。圖2、圖3、圖4、圖5、圖6和圖7分別給出了樣品層處於物鏡焦面和離焦面時，在管鏡像方焦面所成像的情況。圖2和圖3分別表示焦面處的樣品層在兩束對稱的離軸光束照明下，管鏡像方焦面所成像情況；圖4和圖5分別表示焦面內的離焦樣品層在兩束對稱的離軸光束照明下，管鏡像方焦面所成像情況；圖6和圖7分別表示焦面外的離焦樣品層在兩束對稱的離軸光束照明下，管鏡像方焦面所成像情況。從圖2和圖3可看出，對焦面處的樣品層，由於物鏡物方焦面與管鏡像方焦面的物象共軛關係，不同傾角的離軸光束照明所成像的位置是相同的，也就是，像是重疊的；從圖4和圖5、圖6和圖7可看出，對離焦樣品層，不論在焦面內還是在焦面外，其像面不在管鏡像方焦面，相機在管鏡的像方焦面拍攝到的像是模糊的，並且不同傾角的離軸光束照明所成像在管鏡像方焦面的位置是不相同的，也就是像是錯開的。離焦圖像的錯開方向和照明光束的方向有關；圖像錯開量與離軸光束的傾角有關，也和離焦距離有關，還和顯微放大倍數(或管鏡和物鏡的焦距比)有關：傾角越大，錯開量越大；離焦距離越大，錯開量越大；放大倍數越大，錯開量也越大。本發明根據這一成像特性，採用環形不同方向、大傾角的離軸光束照明樣品，對每個離軸光束所形成的圖像進行消除離焦像處理。例如，共有m個子光源構成的360度環形分布光源，每個子光源單獨照明所形成的圖像分別為：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，將這些圖像進行線性疊加，得到圖像i(x,y)：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，那麼疊加後的結果是，焦面處樣品層的圖像得到增強(因為不同方向照明的圖像位置相同)，而離焦處樣品層的圖像將會變得更加模糊甚至消失(因為不同方向照明的圖像位置錯開的)，這樣就可獲得一個更加清晰的焦面處樣品層圖像，軸向解析度得到提高，即i(x,y)為一個樣品層的光切片圖像；也可以提取這些圖像相同坐標像素點最大值i(x,y)＝max[i1(x,y),i2(x,y),…,im(x,y)]，重建一幅消除了離焦像的圖像i(x,y)，也即獲得了一個樣品層的光切片圖像。由於本發明採用的是焦面共軛成像，不像掃描共焦顯微術的焦點共軛成像，無需逐點掃描成像，相對於掃描共焦顯微術，本發明將大大提高成像速度。

需要說明的是，儘管是離軸照明，但仍然是明視場成像，故物鏡4的數值孔徑要足夠大，要保證照明光束的直射光能進入物鏡4參與成像。大數值孔徑物鏡4，可允許的離軸照明光束傾角θ越大，光切片效果就會越好。

使用折射率匹配鏡2的原因是，如果樣品封裝在載玻片和蓋玻片之間，光源發出的光束由空氣經載玻片再照明樣品，由於空氣和載玻片的折射率不匹配，儘管光束入射到載玻片的入射角很大，但光束進入載玻片後發生折射，使得離軸照明樣品光束的離軸傾角將大幅降低，不利於提高軸向解析度。通過使用折射率匹配鏡2，可以確保最終照明光束以一個較大的離軸傾角照射樣品。

實施例二

如附圖1所示，本實施例公開了一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置，依次由環形分布光源1、物鏡4、管鏡6和相機7構成一無限遠校正光路，環形分布光源1發出的離軸光束以傾角θ照射樣品，樣品置於樣品臺3上，樣品臺3位於環形光源1和物鏡4之間，樣品臺3在平移器8的控制下可沿物鏡4的z方向光軸平移；物鏡4和管鏡6的光軸相同，且通過環形分布光源1的圓環中心；相機7的光敏面和管鏡6的像方焦面重合；計算機9控制平移器8的移動和相機7的圖像拍攝。

環形分布光源1和樣品之間設置有折射率匹配鏡2，折射率匹配鏡2採用折射率匹配液和承載樣品的載玻片連接，環形分布光源1發出的離軸光束透過折射率匹配鏡2以傾角θ照射樣品。

折射率匹配鏡2為一平凸球面透鏡或圓錐透鏡，但不限於這兩種透鏡，透鏡的底平面與載玻片連接。

實施例三

如圖8所示，本實施例公開了另一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置，該裝置採用一個60倍、數值孔徑1.49的物鏡4和一個焦距200mm的管鏡6組成一個無限遠校正光學系統。由80個白光led光源均勻分布在一個直徑132mm的環形鋁合金內面組成一個環形分布光源1，每個led功率相同為0.15瓦。電源控制器將80個光源同時點亮，每個led光源發出的光束同時照明一個用作折射率匹配鏡2的半球面平凸透鏡，半球面平凸透鏡為k9玻璃材料、球面半徑為10mm。半球面平凸透鏡的底面通過香柏油和封裝有樣品的載玻片粘合在一起，固定在一個樣品臺3上。一個三維(x,y,z方向)平移臺和一個一維(z方向)納米平移臺構成平移器8，樣品臺3在平移器8的控制下，使得半球面平凸透鏡的中心軸和物鏡4光軸重合，並將樣品置於物鏡4的物方焦面處。調整環形分布光源1的位置，使得物鏡光軸通過環形分布光源1的圓環中心。樣品臺3在平移器8的控制下，在光軸z方向以納米級精度移動，使樣品中不同層面和物鏡物方焦面重合。一臺計算機9控制平移器8的移動和相機7的同步拍攝。調整好裝置後，點亮所有led光源，將樣品內的一個層面和物鏡的焦面重合，相機拍攝所成的圖像。圖9為利用這個裝置拍攝到的一個骨骼肌樣品的光切片圖像，作為對比，圖10給出了普通尼康倒置寬場顯微鏡拍攝到的圖像。比較圖9和圖10，可看出圖10中的一些離焦像在圖9中已消失，圖9的軸向解析度已大幅提高，獲得了光切片效果。

實施例四

如圖11所示，本實施例公開了另一種基於環形離軸照明焦面共軛的非螢光成像光切片裝置，該裝置採用一個60倍、數值孔徑1.49的物鏡4和一個焦距200mm的管鏡6組成一個無限遠校正光學系統。

二個功率分別為0.13瓦、波長520nm的led光源，設置在一個半圓環上，半圓環半徑為78.05mm，並對稱分布在物鏡4的光軸兩側，每個led光源發出的中心光線和物鏡光軸的夾角為71.3度，相交於物鏡4的光軸。半圓環設置在旋轉平臺10上，在旋轉平臺10的控制下，繞物鏡光軸旋轉，構成環形分布光源1，形成環形離軸照明。一個三維(x,y,z方向)平移臺和一個一維(z方向)納米平移臺構成平移器8，樣品臺3在平移器8的控制下，將樣品置於物鏡4的物方焦點處，並且可以控制樣品臺3在z方向以納米級精度移動，以拍攝樣品中不同層面的光切片圖像。一臺計算機9控制平移器8的移動、旋轉平臺10的轉動和相機7的同步拍攝。點亮的環形分布光源1在旋轉平臺10的帶動下，每旋轉一個方位角δφ，相機7同步拍攝一幅圖像，將旋轉一周拍攝到的圖像進行線性疊加，獲得樣品內一個層面的光切片圖像。圖12為利用這個裝置拍攝到的一個肺支氣管樣品的光切片圖像，作為對比，圖13給出了普通尼康倒置寬場顯微鏡拍攝到的圖像。對比圖13，圖12的切片效果明顯。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。