一種醯化高絲氨酸內酯類化合物及其環保應用的製作方法

2023-06-07 06:59:46 1

本發明屬於環境微生物技術領域，具體涉及抑制氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的化合物及其在減少酸性重金屬礦坑水產生方面的應用。

背景技術：

酸性礦坑水(acid mine drainage，AMD)主要是由於金屬硫化礦在空氣、水和微生物等的作用下，發生溶浸、氧化、水解等一系列物理化學反應而形成。目前，酸性礦坑水的汙染已經成為全世界最為嚴重的環境問題之一，酸性礦坑水具有極低的pH(pH≤2.0)和高濃度的重金屬離子，因此會對礦區周圍的生態環境造成嚴重的汙染。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，A.ferrooxidans)是酸性重金屬礦坑水環境中最為常見的浸礦細菌之一。當A.ferrooxidans以生物膜的形式存在於金屬硫化礦表面時，可以極大的促進金屬硫化礦的分解和金屬離子的溶出，導致大量含有高濃度重金屬離子的酸性礦坑水產生，因此A.ferrooxidans形成的生物膜在酸性礦坑水產生的過程中起著非常重要的作用。控制酸性礦坑水的方法大致可分為物理方法、化學方法以及生物方法三大類。其中最常用的是化學方法，即通過投放抑菌劑或殺菌劑抑制浸礦細菌的活性，從而防治酸性礦坑水的汙染，但是，這種方法並不能作為一種長期的控制方法。原因在於：細菌的再生使人們必須不斷的加入這些殺菌劑或者抑菌劑，這樣不僅會導致嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌耐藥性的產生，還會對礦區水體生物產生毒性，造成二次汙染。

本發明公開了一種能夠抑制嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的化合物，該化合物在不影響嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌正常生長的情況下，可以抑制該菌生物膜的形成，從而降低了嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌對硫化礦的侵蝕速度，顯著降低了硫化礦區酸性重金屬礦坑水的產生。

技術實現要素：

本發明的目的之一是克服現有技術中存在的缺點，提供一種醯化高絲氨酸內酯的類似物，該化合物可以作為氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的抑制劑。

本發明的另一個目的是提供醯化高絲氨酸內酯的類似物在抑制硫化礦區酸性重金屬礦坑水產生中的應用。

為了實現上述目的，本發明公開了一種醯化高絲氨酸內酯類化合物，其化學結構通式為：

其中n＝0或1或2或3或4或5；X＝F或Cl或Br或NO2或CF3或CH3或CH3O。

進一步地，本發明中用於抑制氧化亞鐵硫桿菌生物膜的醯化高絲氨酸內酯類似物是下述化合物：

N-(3-環丁內酯)-4-溴苯甲磺醯胺。

本發明公開的醯化高絲氨酸內酯類化合物可用於抑制嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成，所述醯化高絲氨酸內酯類化合物的使用量為1-1000μM，優選10-100μM。

本發明公開的醯化高絲氨酸內酯類化合物可用於抑制酸性重金屬礦坑水的產生，所述酸性重金屬礦坑水來源於金屬硫化礦礦區，所述的化合物的使用濃度優選100μM。

本發明的有益效果：

本發明合成的化合物對氧化亞鐵硫桿菌生物膜的形成具有較高的抑制活性，並且對於酸性重金屬礦坑水的產生同樣具有良好的抑制效果。此外，與現有技術相比，本發明是通過抑制氧化亞鐵硫桿菌生物膜的形成，減少細菌和礦石之間的相互作用，從而達到抑制酸性重金屬礦坑水產生的目的。該化合物與傳統的殺菌劑或抑菌劑相比，製備過程簡單，抑制作用長效，無二次汙染，不會產生由殺菌劑或抑菌劑引起的耐藥性。

附圖說明

圖1為本發明的化合物對氧化亞鐵硫桿菌Fe2+氧化百分率的影響，其中，細菌處理組；細菌+10μM化合物處理組；細菌+100μM化合物處理組。

圖2為本發明的化合物對氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的影響，其中，細菌處理組；細菌+10μM化合物處理組；細菌+100μM化合物處理組。

圖3為本發明的化合物對浸礦體系中鎳離子濃度的影響，其中，(□)無菌處理組；(■)細菌處理組；(◆)細菌+100μM化合物處理組。

圖4為本發明的化合物對浸礦體系中銅離子濃度的影響，其中，(□)無菌處理組；(■)細菌處理組；(◆)細菌+100μM化合物處理組。

圖5為本發明的化合物對浸礦體系中pH變化的影響，其中，(□)無菌處理組；(■)細菌處理組；(◆)細菌+100μM化合物處理組。

具體實施方式

以下提供具體實施例以實現本發明所述的技術方案，但不限於這些實施例。

實施例1氧化亞鐵硫桿菌生物膜抑制劑的合成

具體合成步驟為：

(1)在冰水浴條件下，將169mg(0.93mM)的(R)-(+)-α-氨基-γ-丁內酯鹽酸鹽和0.93mM的對溴苯甲烷磺醯氯置於10mL乾燥的CH2Cl2溶液中混合均勻，之後加入267mg(1.5mM)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和68mg(0.6mM)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，攪拌30min之後撤去冰浴，在室溫條件下繼續攪拌反應20h；

(2)反應後的溶液經CH2Cl2稀釋至終體積100mL，在分液漏鬥中用等體積的10％(v/v)的HCl溶液和飽和NaCl溶液分別洗滌上述溶液3遍。之後收集有機相溶液，加入無水MgSO4除去有機相中殘留的水分，經旋轉蒸發儀50℃乾燥後得到粗產物。粗產物經SiO2柱層析，TLC監測，乙酸乙酯：石油醚＝1.5:1洗脫，洗脫液經旋轉蒸發儀50℃旋蒸、油泵減壓抽濾之 後得到目的產物。

實施例2化合物對氧化亞鐵硫桿菌正常生長的影響

實驗材料：A.ferrooxidans ATCC23270購自American type culture collection(ATCC)。

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌在正常生長的過程中將Fe2+氧化為Fe3+獲取能量進行生長。通過重鉻酸鉀滴定法檢測溶液中Fe3+的含量，反映化合物對細菌Fe2+氧化能力的影響，從而保證用藥濃度不會影響細菌的正常生長。實驗方法如下：

(1)在250mL三角瓶中加入100mL pH 1.8的9K培養基(9K培養基配製方法：將3.0g(NH4)SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01g Ca(NO3)2，44.67g FeSO4·7H2O溶於1000mL蒸餾水中，並用稀硫酸調整pH至2.0，並過濾除菌)，然後將實驗分為三組，第一組以不加化合物作為空白對照組；第二組加入已經過濾除菌的終濃度為10μM的化合物；第三組加入終濃度為100μM的化合物。

(2)每個實驗組做三個平行，然後按照10％(v/v)的接種量接種連續培養20h的A.ferrooxidans ATCC23270，最後將三角瓶放入恆溫搖床中，150r/min，30℃振蕩培養；連續培養24h之後，用重鉻酸鉀滴定法測定培養基中Fe2+含量。吸取1mL培養液，用5mL蒸餾水稀釋，同時加入3mL混酸溶液(體積比為H3PO4：H2SO4：H2O＝15：15：70)來消除Fe3+對指示劑顯色的影響，再加入50μL二苯胺磺酸鈉指示劑，用0.01M的K2Cr2O7滴定樣品，樣品溶液從無色變為紫色即為滴定終點，記錄到達滴定終點消耗K2Cr2O7標準液的體積；

(3)最終通過計算溶液中剩餘Fe2+的含量，計算Fe2+氧化百分率，並用SPSS 13.0軟體進行統計學分析。數據採用mean±SD表示，組間比較採用單因素方差分析，以P<0.05認為差異具有統計學意義，結果如圖1所示。從圖1中可以看出，連續培養24h之後，與空白不加藥處理組相比，10μM和100μM濃度的化合物均未對細菌Fe2+氧化百分率產生影響，差異不具有統計學意義(P<0.05)，所以兩個用藥濃度均不會影響細菌的生長。

實施例3生物膜抑制劑抑制活性檢測

(1)9000r/min，10℃離心15min收集得到A.ferrooxidans ATCC23270菌體，用pH 2.0的稀硫酸溶液洗滌菌體兩遍，最後重懸於含2g/L Fe2+，pH 2.0的基礎鹽溶液(不含FeSO4的9K培養基)中，並且將細菌懸液的細菌密度調至1.0×108cells/mL；

(2)將上述細菌懸液分為三組，第一組以不加化合物作為空白對照組；第二組加入已經過濾除菌的終濃度為10μM的化合物；第三組加入終濃度為100μM的化合物。將細菌懸液加入96孔細胞培養板中，150μL/孔，每個實驗組做8個平行。然後將96孔細胞培養板放入恆溫培養箱中，30℃靜置培養48h，形成生物膜；

(3)48h之後，倒掉孔內菌液，每孔用無菌去離子水洗滌兩遍，洗去游離的細菌。每孔加入0.5％的結晶紫溶液150μL，室溫條件下染色15min。之後洗去殘留的結晶紫染料，每孔中加入150μL的33％的冰乙酸溶液，溶解生物膜-結晶紫混合物，用多功能酶標儀讀取570nm吸光度值；

(4)實驗數據用mean±SD表示，以P<0.05認為差異具有統計學意義，如圖2所示。從圖2中可以看出，與空白不加藥處理組相比，10μM和100μM濃度的化合物處理後，對A.ferrooxidans ATCC23270生物膜的形成具有明顯的抑制效果，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

實施例4化合物對酸性重金屬礦坑水產生的抑制作用

(1)9000r/min，10℃離心15min收集得到A.ferrooxidans ATCC23270菌體，用pH 2.0的稀硫酸溶液洗滌菌體沉澱兩遍，最後重懸於pH 2.0的基礎鹽溶液中，並且將A.ferrooxidans ATCC23270菌懸液的菌體密度調至1.0×108cells/mL。在250mL三角瓶中加入100mL菌懸液中，並且按照5％(w/v)的礦漿濃度，加入粒徑為50-100μm的鎳黃鐵礦顆粒粉末5g；

(2)鎳黃鐵礦的金屬溶出實驗分為3個實驗組，分別為：細菌處理組、100μM化合物+細菌處理組、以及無菌處理組，每組實驗組做三個平行。所有樣品於搖床150r/min，30℃培養，溶出過程持續44天，每2天用pH計測定樣品中的pH。此外，每隔一段時間取礦石浸 出液1mL，1000r/min低速離心5min後去除礦石殘渣，上清用pH 2.0的稀硫酸稀釋後，用原子吸收發射光譜測定樣品中Ni2+，Cu2+含量，結果如圖3所示。

(3)從圖3和4中可以看出，在沒有細菌存在的情況下，礦石中Ni和Cu的溶出過程十分緩慢，而在有細菌存在的情況下，溶液中可溶性Ni和Cu的含量要遠遠大於無菌對照組。而用100μM的化合物處理之後，溶液中可溶性Ni和Cu的含量雖然略高於無菌處理組，但是卻遠遠低於純細菌處理組。此外，如圖5所示，加藥處理之後浸礦體系的pH較純細菌培養組有所升高，說明浸礦體系中的產酸量有所減少，而且這種抑制作用可以持續60天以上。因此，該化合物可以抑制細菌對礦石中金屬的溶出作用，並且可以減少酸的產生，所以對AMD的產生具有一定的抑制效果。