表達傳染性囊病病毒vp2蛋白的重組t4噬菌體的構建及其應用的製作方法
2023-06-07 06:51:56 1
專利名稱：表達傳染性囊病病毒vp2蛋白的重組t4噬菌體的構建及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及表達雞傳染性囊病病毒結構蛋白的重組T4噬菌體的構建和應用。本發明進一步涉及重組T4噬菌體在傳染性囊病疫苗和傳染性囊病病毒抗體檢測中的應用。
背景技術：
傳染性囊病病毒(IBDV)屬於雙RNA病毒科(Birnaviridae)禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus)，它是雞傳染性囊病的病原。目前普遍認為IBDV具有4種成熟蛋白質VP1、VP2、VP3和VP4，分子量分別為90kDa、37-40kDa、32-35kDa和24-30kDa。其中VP2和VP3是主要的結構蛋白，分別佔病毒總蛋白的51％和40％。VP2分子量約為40kDa，它含有血清型特異性的能誘導中和抗體的抗原決定簇，是病毒的主要宿主保護性免疫原(Hudson et al，1986)。
自Azad et al(1986)首次在大腸桿菌中表達002-73株的結構蛋白以來，IBDV所有的結構蛋白，包括VP1、VP2、VP3和多聚蛋白前體，以及非結構蛋白VP5，先後在各種表達系統中進行了表達。特別是IBDV主要免疫原VP2，已先後在大腸桿菌、酵母、痘病毒、昆蟲杆狀病毒表達系統、腺病毒等表達系統中進行了表達。但還沒有用噬菌體表達IBDV結構蛋白的報導。
噬菌體表面展示技術(phage display)是1980年代發展起來的一項新的生物技術(Smith，1985)，它能將表達的外源多肽和蛋白質以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，並保持相對獨立的空間構象和生物活性。T4噬菌體屬於有尾噬菌體中A群A2亞群的典型成員，其基本形態結構是頭長徑約95nm，橫徑約為65nm。T4噬菌體衣殼由3種必需衣殼蛋白組成，主要的衣殼蛋白gp23和2個次要衣殼蛋白gp24、gp20。其中分子量為45kDa的gp23在每個病毒顆粒中有960個拷貝，而其餘2個次要衣殼蛋白拷貝數較少，gp24有55個拷貝，而gp20隻有12個拷貝。此外，在衣殼的外表面包被著2種非必需外殼蛋白分子量為9kDa的SOC和分子量為40kDa的HOC，二者相距7nm，以對稱的形式分布於噬菌體二十面體表面。SOC和HOC僅提供噬菌體額外的穩定能力，是在噬菌體衣殼裝配完成後才組裝到衣殼表面的，它們的缺失不影響T4噬菌體的繁殖和感染。將外源蛋白與T4噬菌體表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，從而可以獲得具有外源蛋白的重組T4噬菌體。採用這樣的方法，獲得了表達愛滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰質炎病毒VP1(Ren et al，1996)、腦膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白的重組T4噬菌體。
發明內容
本發明的目的在於獲得表達傳染性囊病病毒結構蛋白VP2的重組T4噬菌體，為傳染性囊病疫苗的研製和IBDV抗體的檢測提供一種新的抗原。
本發明提供的重組T4噬菌體是採用基因重組的方法獲得的。其構建方法是(1)將傳染性囊病病毒vp2基因的cDNA片段插入pR質粒(Renet al，1996)中，構建重組整合質粒pR-VP2，其操作步驟如下用EcoRI在37℃分別消化vp2基因的PCR產物和質粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的vp2的PCR產物和質粒pR。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α。經Ampr抗性篩選，獲得插入了vp2基因的重組子。然後用1對特異性引物SOC-S(5′-GAATCATATGGCTAGTCTCGCG G-3′)/VP2-A(5′-ATTTGAATTCCTATAGGCCCGAATTAGTCCTT-3′)進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LA培養基中，37℃，200r/m振搖培養16-20h，抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得重組整合質粒pR-VP2。
(2)用重組整合質粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren et al，1996)進行同源重組，獲得表達VP2蛋白的重組T4噬菌體，其操作步驟如下用整合質粒pR-VP2轉化大腸桿菌DH5α，獲得的大腸桿菌為E-VP2；在裝入500μL SC培養液的器皿中加入1μL氨卞青黴素(Amp)，然後加入10μL E-VP2，在37℃培養至光密度值OD600大約為0.5時，加入50μL T4-Z1，在35℃200r/m振搖培養至有細菌碎片出現，獲得的產物為未鑑定的重組T4噬菌體；在1個經過滅菌的器皿中加入培養超過12小時的大腸桿菌DH5α600μL，不加溶菌酶，將在2-10℃儲存的SC頂層培養基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45℃左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5α的器皿中，將混合液混勻，立即倒在平皿上，當瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養基上分別點10μL未鑑定的重組T4噬菌體，待吸收完畢後，放在37℃培養16小時以上如果E-VP2中的質粒與T4-Z1發生了重組，成功地將vp2基因轉入T4噬菌體中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑；再在平皿上鋪SC頂層培養基，用滅菌牙籤把生長出的噬菌斑在SC頂層培養基上點梅花斑，放在37℃培養12小時以上，生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩衝液中6小時；用特異性引物VP2-S(5 ′TGAAGAATTCTATGACGAACCTGCAA-3′)/VP2-A從陽性梅花斑浸泡液中擴增到特異性條帶，則說明表達VP2蛋白的重組T4噬菌體已獲得。
SC培養液按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone和5gNaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min後4℃保存。
SC底層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/LHCl和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻後倒平板，4℃保存。
SC頂層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％檸檬酸鈉.2H2O溶液，搖勻後備用。
表達傳染性囊病病毒VP2蛋白的重組T4噬菌體的特徵為(1)重組T4噬菌體具有序列表中序列1的核苷酸序列。序列1又稱為vp2基因，由1350個鹼基對組成，是IBDV主要結構蛋白VP2的編碼基因。序列1和T4噬菌體soc基因組成融合基因。該融合基因位於重組T4噬菌體溶菌酶基因(e)和den V基因之間。該序列採用PCR方法可以擴增出特異性條帶。
(2)重組T4噬菌體具有序列表中序列2的胺基酸序列。序列2又稱為VP2蛋白，是由序列1編碼的。其分子量約為40kDa，由450個胺基酸殘基組成，它含有血清型特異性的能誘導中和抗體的抗原決定簇，是IBDV的主要宿主保護性免疫原。VP2上的抗原決定簇為構象依賴性的，其誘導的中和抗體能被動地保護宿主免受IBDV的感染。該序列和T4噬菌體SOC蛋白組成融合蛋白，位於重組T4噬菌體頭部表面。採用抗SOC或抗VP2的特異性抗體，可以檢測到該融合蛋白。
(3)本發明提供的重組T4噬菌體還包括具有vp2等同基因的T4噬菌體。vp2等同基因，是與vp2基因的核苷酸序列或胺基酸殘基序列相比有一個或若干個核苷酸或胺基酸殘基的差別，包括鹼基或胺基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與vp2基因序列中的連續200鹼基以上的區段有85％以上的同源性。
本發明提供的重組T4噬菌體具有重要的應用價值。應用之一是將所述的重組T4噬菌體作為抗原，採用重組T4噬菌體直接免疫或將T4噬菌體與油佐劑配合後製成油乳化疫苗免疫雞，可以獲得抗VP2的特異性抗體。
本發明提供的重組T4噬菌體的另一個應用，是將所述的重組T4噬菌體作為抗原，應用於包括但不限於AGP(瓊脂擴散試驗)、ELISA(酶聯免疫吸附試驗)，檢測雞血清中的IBD特異性抗體。
本發明具有明顯的優點和效果。本發明提供的重組T4噬菌體易於純化，展示在T4噬菌體表面的VP2蛋白具有完整的空間構象。由於SOC位點在T4噬菌體頭部表面具有960個拷貝，所以與SOC融合表達的VP2蛋白的拷貝數高。由於VP2蛋白分布於T4噬菌體頭部表面，因而T4噬菌體本身充當了VP2蛋白的載體，當本發明提供的重組T4噬菌體作為抗原時，VP2的免疫原性比單獨的VP2蛋白強。作為疫苗的抗原、或者作為免疫檢測的抗原使用時，和其它的蛋白表達系統表達的VP2蛋白相比，本發明所述的重組T4噬菌體具有明顯的優點。
以下結合實施例和附圖對本發明提供的表達傳染性囊病病毒VP2的重組T4噬菌體的構建、特徵分析、應用途徑作具體說明。
圖1為重組整合質粒pR-VP2的構建示意圖。pR表示整合質粒，pR-VP2表示插入了vp2基因的重組整合質粒。Ampr表示氨卞青黴素抗性，Kpr表示卡那黴素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌體上的基因。EcoRI、BamHI、NdeI、HindIII、PstI、PvuI是質粒上的限制性內切酶位點。
圖2為VP2蛋白在重組T4噬菌體SOC位點展示模式圖。A為重組整合質粒pR-VP2；B為缺陷型T4噬菌體ΦT4-Z1；C、重組後攜帶有目的基因VP2的重組T4噬菌體ФT4-VP2。
圖3為在平板培養基上培養重組T4噬菌體。A為10-6稀釋的噬菌體，B為10-7稀釋的噬菌體，C為10-8稀釋的噬菌體，D為10-10稀釋的噬菌體，E為10-11稀釋的噬菌體，F為10-12稀釋的噬菌體。
圖4為重組T4噬菌體的PCR鑑定結果圖。泳道1-5是含有IBDV vp2基因的重組噬菌體的PCR產物，泳道M為分子量標記。
圖5為野生型T4噬菌體及重組T4噬菌體免疫電鏡圖譜。A為野生型T4噬菌體。B為與IBD陽性血清反應的野生型T4噬菌體。C為重組T4噬菌體。D為與IBD陽性血清反應的重組T4噬菌體。
具體實施例方式
1、整合質粒pR-VP2的構建採用pR質粒(Ren et al，1996)構建重組整合質粒pR-VP2。用EcoRI在37℃分別消化vp2基因的PCR產物和質粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的vp2的PCR產物和質粒pR。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α。轉化方法為CaCl2法。經Ampr抗性篩選，獲得插入了vp2基因的重組子。然後用1對特異性引物SOC-S/VP2-A進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LA培養基中，37℃，200r/m振搖培養16-20小時。採用E.Z.N.A.Plasmid Minipreps Kit抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得重組整合質粒pR-VP2。
2、表達VP2蛋白的重組T4噬菌體的獲得用重組整合質粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren et al，1996)進行同源重組，獲得表達VP2蛋白的重組T4噬菌體。
先用整合質粒pR-VP2轉化大腸桿菌DH5α，獲得的大腸桿菌為E-VP2。然後進行以下操作。
在裝入500μL SC培養液的試管中加入1μL Amp，然後加入10μLE-VP2，在37℃培養至OD600大約0.5時，加入50μL T4-Z1，繼續在35℃200r/m振搖培養至有細菌碎片出現，獲得的產物為未鑑定的重組T4噬菌體；在1個經過滅菌的器皿中加入培養超過12小時的大腸桿菌DH5α600μL，不加溶菌酶，將在4℃儲存的SC頂層培養基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45℃左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5α的器皿中，將混合液在旋渦震蕩器上混勻，立即倒在平皿上。等到瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養基上分別點10μL未鑑定的重組T4噬菌體，待吸收完畢後，放在37℃培養16小時以上，如果E-VP2中的質粒與T4-Z1發生了重組，成功地將vp2基因轉入T4噬菌體中，則在不加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑；在滅菌的平皿上鋪SC頂層培養基，然後用滅菌牙籤把生長出的噬菌斑在SC頂層培養基上點梅花斑，放在37℃培養12小時以上，生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩衝液中6小時；採用PCR篩選T4噬菌體轉化子。檢測vp2基因的PCR反應體系組成如下每25μL反應體系中含2.5μL 10×PCR緩衝液，2μL dNTPs，0.3μL Taq酶，0.5μL VP2-S(5′-TGAAGAATTCTATGACGAACCTGCAA-3′)，0.5μL VP2-A，1μL梅花斑浸泡液和18.2μL雙蒸水。將反應混合物混勻、離心後，在PCR儀上進行溫度循環。溫度循環程序如下首先94℃3min；然後94℃40sec、51℃40sec、72℃90sec，共循環30次；最後72℃10min。採用1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙啶)電泳對PCR反應產物進行檢測。如果觀察到特異性條帶，則說明已獲得了表達VP2蛋白的重組T4噬菌體。
SC培養液按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone和5gNaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min後4℃保存。
SC底層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 2％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻後鋪平板，4℃保存。
SC頂層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％檸檬酸鈉.2H2O溶液，搖勻後備用。
3、重組T4噬菌體的免疫電鏡觀察分別取野生型T4噬菌體、重組T4噬菌體和1/3體積IBD陽性血清混合，37℃放置1小時後，直接塗片。同時用不加陽性血清的上述噬菌體作對照。磷鎢酸負染，JEM-1010型透射電鏡觀察。比較與IBD抗血清反應前後的噬菌體形態，發現野生型T4噬菌體的形態不受IBD陽性血清的影響；而重組T4噬菌體的形態受IBD陽性血清影響明顯。未與IBD陽性血清反應的重組T4噬菌體的形態與野生型T4噬菌體形態相同，頭部為白色；而與抗血清作用之後的重組T4噬菌體頭部變黑。
4、重組T4噬菌體的ELISA檢測將重組T4噬菌體用包被緩衝液進行系列稀釋，然後在96孔聚乙烯酶標板上每孔加入稀釋的噬菌體200μL，4℃放置12小時以上。棄去溶液，用PBS緩衝液洗3次。接著每孔加入封閉液100μL，37℃保溫1小時。棄去溶液後，用清洗緩衝液洗3次。接著每孔加入100μL 1000倍稀釋的IBD特異性血清，37℃保溫1h。棄去血清後，用清洗緩衝液洗3次。然後每孔加入100μL 1∶2500稀釋的HRP標記的兔抗雞IgG，37℃保溫1h。棄去溶液後，用清洗緩衝液洗3次。再加入100μL反應底物，25℃保溫20min後，加入2％硫酸作為反應終止液。最後用Emax酶標儀於630nm波長讀數。結果表明，重組T4噬菌體與IBDV陽性血清呈特異性反應，當重組T4噬菌體1∶10000以內稀釋時，S/N均超過2.0。
反應底物的配製方法5gTMB溶於5mL無水乙醇，取4mL加0.2mol/LpH6.0的醋酸鈉溶液16mL，用時加等體積的0.03％的H2O2，現配現用。
5、重組T4噬菌體油乳化疫苗免疫雞的實驗效果重組T4噬菌體油乳化疫苗的製備方法如下先按以下配方製備油相。每100mL油相組成為4mL司本80，2mL司本85，94mL 10號礦物油，2g硬脂酸鋁。15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻待用。再按以下配方製備水相。每100mL水相組成為96mL噬菌體懸液，4mL滅菌過的吐溫80。3000r/m攪拌均勻。在組織搗碎機加入200mL油相，一邊慢速攪拌，一邊緩緩加入100mL水相。待混合均勻之後，10 000r/m快速攪拌2min。獲得的白色油乳劑即為重組T4噬菌體油乳化疫苗。將製備好的重組T4噬菌體油乳化疫苗置於4℃保存。
40隻1天齡SPF白來航雞隨機分成2組，每組20隻，飼養在隔離器中，飲水和飼料均經過滅菌消毒處理。飼養至28天時，進行皮下接種。第1組為空白對照組，不免疫；第2組為重組T4噬菌體免疫組，每隻雞的免疫劑量為2×109個噬菌體。42天齡時進行第2次免疫，分組處理及免疫劑量與28天齡時相同，免疫途徑為肌肉注射。
分別在第2次免疫後15天(57天齡)、30天(72天齡)採血，按常規方法分離血清，保存在-20℃，每組每次抽10隻雞採血。採用IDEXX公司的IBD ELISA試劑盒測定血清中IBD抗體，用S/P表示抗體水平。57天齡時對照組和實驗組S/P分別為0.18和0.53；72天齡時對照組和實驗組S/P分別為0.23和0.90。
6、用重組T4噬菌體作為抗原檢測雞血清中IBD抗體以重組T4噬菌體為包被抗原，建立檢測IBD抗體的ELISA方法。將重組T4噬菌體稀釋為1×108/ml，每孔加入100μL稀釋的重組T4噬菌體，4℃放置12小時以上。用清洗緩衝液(PBS，pH7.2，含0.05％吐溫20)洗3次後，每孔加入100μL5％的脫脂奶粉/PBS，37℃放置2h。用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100μL 1∶100稀釋的IBD陽性血清，37℃反應1h。再用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100μL適當稀釋的辣根過氧化酶標記的鼠抗雞IgG抗體，37℃反應1h。每孔加入反應底物100μL，室溫觀察顏色變化。在10-30min時達到顯色高峰。每孔加入100μL終止液(1mol/L H2SO4)，終止顯色反應，在酶標儀上讀取OD450值。該方法具有良好的特異性。用該方法檢測雞新城疫(ND)特異性血清、雞腦脊髓炎(AE)特異性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)特異性血清、雞傳染性喉氣管炎(ILT)特異性血清、禽流感(AI)特異性血清，無交叉反應性。對採自現場的92份IBD陽性血清的檢測結果與IDEXX公司的IBD ELISA試劑盒檢測結果的相關性為97.8％。
序列表序列數2序列1(1)類型DNA(2)長度1350鹼基對(3)序列atgacgaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg60ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480ggggaagggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660caagcaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720agcatcgggg gagaactcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaaca ttgtgattcc aaccagcgag 900ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggaggc 1020aactacccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggg 1080tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg 1200atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260gactttcgcg agtacttcat ggaggtggca gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320gcatttggct tcaaggacat aattcgggca 1350
序列2(1)類型蛋白質(2)長度450胺基酸殘基(3)序列MTNLQDQTQQ IVPFIRSLLM PTTGPASIPD DTLEKHTLRS ETSTYNLTVG DTGSGLIVFF 60PGFPGSIVGA HYTLQSNGNY KFDQMLLTAQ NLPASYNYCR LVSRSLTVRS STLPGGVYAL 120NGTINAVTFQ GSLSELTDVS YNGLMSATAN INDKIGNVLV GEGVTVLSLP TSYDLGYVRL 180GDPIPAIGLD PKMVATCDSS DRPRVYTITA ADDYQFSSQY QAGGVTITLF SANIDAITSL 240SIGGELVFQT SVQGLILGAT IYLIGFDGTA VITRAVAADN GLTAGTDNLM PFNIVIPTSE 300ITQPITSIKL EIVTSKSGGQ AGDQMSWSAS GSLAVTIHGG NYPGALRPVT LVAYERVATG 360SVVTVAGVSN FELIPNPELA KNLVTEYGRF DPGAMNYTKL ILSERDRLGI KTVWPTREYT 420DFREYFMEVA DLNSPLKIAG AFGFKDIIRA 450
權利要求
1.含有傳染性囊病病毒VP2蛋白的重組T4噬菌體的構建方法，其特徵在採用基因重組的方法獲得的，其方法是用EcoR I在37℃分別消化vp2基因的PCR產物和質粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的vp2的PCR產物和質粒pR，用連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經Ampr抗性篩選，獲得插入了vp2基因的重組子，然後用1對特異性引物SOC-S/VP2-A進行PCR篩選；對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LA培養基中，37℃，200r/m振搖培養16-20小時，抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得含有傳染性囊病病毒vp2基因的重組整合質粒pR-VP2；用重組整合質粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌體T4-Z1進行同源重組，獲得表達VP2蛋白的重組T4噬菌體。
2.含有傳染性囊病病毒VP2的重組T4噬菌體，其特徵在於(1)重組T4噬菌體具有序列表中序列1的核苷酸序列，由1350個鹼基對組成，是IBDV主要結構蛋白VP2的編碼基因，序列1和T4噬菌體soc基因組成融合基因，該融合基因位於重組T4噬菌體溶菌酶基因(e)和den V基因之間，該序列採用PCR方法可以擴增出特異性條帶；(2)重組T4噬菌體具有序列表中序列2的胺基酸序列，是由序列1編碼的。其分子量約為40kDa，由450個胺基酸殘基組成，它含有血清型特異性的能誘導中和抗體的抗原決定簇，是IBDV的主要宿主保護性免疫原，VP2上的抗原決定簇為構象依賴性的，其誘導的中和抗體能被動地保護宿主免受IBDV的感染，該序列和T4噬菌體SOC蛋白組成融合蛋白，位於重組T4噬菌體頭部表面，採用抗SOC或抗VP2的特異性抗體，可以檢測到該融合蛋白；(3)重組T4噬菌體還包括具有vp2等同基因的T4噬菌體，vp2等同基因，是與vp2基因的核苷酸序列或胺基酸殘基序列相比有一個或若干個核苷酸或胺基酸殘基的差別，包括鹼基或胺基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與vp2基因序列中的連續200鹼基以上的區段有85％以上的同源性。
3.含有傳染性囊病病毒VP2蛋白的重組T4噬菌體的應用，其特徵在於應用之一是將所述的重組T4噬菌體作為抗原，採用重組T4噬菌體直接免疫或將T4噬菌體與油佐劑配合後製成油乳化疫苗免疫雞，可以獲得抗VP2的特異性抗體；應用之二是將所述的重組T4噬菌體作為抗原，應用於包括但不限於AGP、ELISA，檢測雞血清中的IBD特異性抗體。
全文摘要
本發明提供了一個表達雞傳染性囊病病毒結構蛋白VP2的重組T4噬菌體，該重組T4噬菌體具有傳染性囊病病毒VP2基因的核苷酸序列和VP2蛋白的胺基酸殘基序列。本發明還涉及重組T4噬菌體在傳染性囊病疫苗免疫和傳染性囊病病毒抗體檢測中的應用。
文檔編號C12N15/73GK1554749SQ20031011751
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月25日 優先權日2003年12月25日
發明者曹永長, 畢英佐, 史泉城, 馬靜雲 申請人:華南農業大學