一株毒殺植物寄生線蟲的黑麴黴真菌及其製備方法和應用的製作方法
2023-06-06 21:11:51
專利名稱：一株毒殺植物寄生線蟲的黑麴黴真菌及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物農藥技術領域，具體涉及一種毒殺植物寄生線蟲的真菌及其製備方法 和應用。
背景技術：
植物寄生線蟲在世界上許多國家和地區發生和為害，種類多種多樣。在全球範圍內，植 物寄生線蟲的發生與危害隨著農林業的發展和耕作栽培制度的變化日益嚴重，據Esser統計， 到1990年為止全世界已報導發現植物寄生線蟲207屬4832種(劉維志，段玉璽.2000.植物 病原線蟲學.北京中國農業出版社，pl-2)。據估計，植物寄生線蟲造成世界主要農作物的 年損失率為12.3%，超過1000億美元，而實際的損失遠遠超過估計，理由是許多線蟲造成 的危害因沒有田間可見症狀或專化性特徵而未引起注意(王壽華.果樹線蟲學.北京中國農業 科技出版社，1994. P. 1-5)，此外，世界範圍內對線蟲為害的新發現還在不斷增加，而且一些 更新的農業栽培體制使線蟲問題更加突出，再者，線蟲與其它生物相互作用而對植物產生的 直接或間接影響還在急劇增加。從這種意義上說，線蟲造成的危害較其它生物更加隱蔽！根 結線蟲是農業上為害最大的一類線蟲，病害發生後， 一般減產10%左右，嚴重的高達75%以 上，甚至絕收(A. G. Whitehead, 1998. Plant Nematode Control. ISBN0851991882 CAB International)。目前，植物寄生線蟲的防治仍以化學防治為主，但近年來，化學殺線劑的 應用浪費大，汙染環境，選擇性差，滅生性強，破壞土壤生物區系等弊端日益為人們所重視 (張克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和細菌在線蟲生防中的作用及其研究進展.殺蟲微生 物.3:55-66)， 21世紀稱為環保世紀， 一些有效的化學殺線劑的應用逐步受到限制，因此對植 物寄生線蟲的生物防治研究自然成為熱點問題。本發明正是基於上述理論，以植物寄生線蟲 為靶標，從真菌代謝產物中尋找具有高效殺線蟲活性物質，擬為研究開發新型生物殺線蟲劑
尋找新的資源。
發明內容
本發明的目的是選擇對根結線蟲具高活性的真菌菌株，將菌株按常規液體發酵培養後， 從代謝產物中提取具殺線蟲活性物質的有效成分，開發殺線蟲生物農藥，其中，所述的根結 線蟲優選是南方根結線蟲。
本發明篩選到的一株具有殺線蟲活性的真菌菌株是J5p"gz7/船m'gwY-61，保藏單位中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 2631。 AY-61是從大量土壤真菌菌株中篩選出的一株對南方根結線蟲具有良好殺線蟲活性的真
菌菌株。保藏日期是2008年8月7日。保藏地址是中國北京朝陽區大屯路。 本發明通過研究發現，土壤真菌有很多株真菌都具有較高的殺線蟲活性，從這些真菌中
篩選出一株性狀相對最好的真菌菌株A w扭r Y-61進行了進一步的研究。
本發明還涉及用於防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，其是由本發明的真菌菌株A
Y-61經過常規的液體發酵培養後提取製備的。
本發明的真菌菌株A "/ger Y-61是通過試管種培養後，再經擴大發酵培養來製備，其具 體方法如下
1. 試管種培養
培養基配方為馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基，即馬鈴薯200g;葡萄糖20g;瓊脂17g;蒸餾 水lOOOmL。
2. 液體發酵培養
其中液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有麥芽糖1.6%-2.4%、葡萄糖0.6 %-1.4%、蛋白腖O. 06%-0. 14%、酵母膏0. 06%-0. 12% 、 KH2P04 7H20 0. 06%_0. 14%、 MgSO4 0. 03-0. 07%， Cacl2 2H2O0. 15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H200. 0002% ，餘下為蒸餾 水，pH為6-7，優選pH為6. 5。
將試管種接種到500mL三角瓶(每瓶裝125mL)液體培養基中，25。C 28。C下，搖床轉速 以220r min—t 240r min-1、發酵168h。
本發明還涉及一種殺線蟲製劑，其包含本發明所述的真菌菌株A Y-61本身或其代
謝物作為有效活性成分。
本發明的真菌菌株A Y-61或其代謝物具有殺線蟲活性物質，可用於植物寄生線蟲
的生物防治，特別是根結線蟲(ife"jWogK/7e spp.)。
具體實施例方式
為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。 首先對A Y-61菌株進行發酵培養，然後對發酵培養後的代謝產物進行殺線蟲活性
試驗，確定其對線蟲的作用。
實施例1:菌株A "扭/" Y-61的培養
將A w/ger Y-61的菌絲體接種到試管瓊脂培養基上，培養基配方為PDA培養基，即馬鈴 薯200g;葡萄糖20g;瓊脂17g;蒸餾水1000mL。 25'C培養7d,獲得試管種。
再將試管種接種到500mL三角瓶(每瓶裝125mL)液體培養基中，培養基配方為(重量百分比)麥芽糖(2.4%)、葡萄糖(0.8%)、蛋白腖(0.06%)、酵母膏(0.06%) 、 KH2P04 .7H20
(0.14%)、 MgS04 (0.04%) ， Cacl2*2H20 0.15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H20 0. 00 02%, 餘下為蒸餾水，pH 6.5。 25。C 28。C下，搖床轉速以220r rain_1 240r min—'、發酵168h。 將發酵液配成不同的倍數進行殺線蟲藥效試驗。
實施例2:菌株A w扭r Y-61的培養
基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為
液體培養基配方為麥芽糖(1.6%)、葡萄糖(0.6%)、蛋白腖(0.08%)、酵母膏(0. 12 %) 、 KH2P04*7H20 (0.10%)、 MgS04 (0.04%) ， Cacl2 2H20 0.15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H20 0. 0002%， pH 7。
實施例3:菌株A m'gw Y-61的培養
基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為
液體培養基配方為麥芽糖(2.2%)、葡萄糖(0.8%)、蛋白腖(0.12%)、酵母膏(0. 14 %) 、 KH2P04 7H20 (0.10%)、 MgS04 (0.07%) ， Cacl2 2H20 0.15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H20 0.0002%， pH 6。
實施例4:菌株A "z'gw Y-61的培養
基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為
液體培養基配方為麥芽糖(2.0%)、葡萄糖(0.6%)、蛋白腖(0.12%)、酵母膏(0.06 %) 、 KH2P04 *7H20 (0. 12%)、 MgS04(0. 03%) ， Cacl2 *2H20 0. 15%、 Fecl30. 098%、 ZnS04 '7H20 0.0002%， pH 6.5。
實施例5:菌株A m'gw Y-61的殺線蟲活性
將發酵液依次稀釋5倍、10倍、濃縮5倍和10倍獲得不同濃度的發酵液，分別處理南 方根結線蟲2齡幼蟲。
1. 製備試驗用製劑
按前述液體發酵培養方法製備的真菌菌株A "z'ger Y-61，用不同倍數的發酵液進行殺線 蟲活性試驗。
2. 製備試驗用線蟲
(1)製備南方根結線蟲卵囊及2齡幼蟲
在溫室中盆栽感病的番茄品種L402上繁殖南方根結線蟲。將番說種子播種在育苗床中， 待番茄苗長到3葉期，稍顯粗壯時移為盆栽。接種南方根結線蟲2齡幼蟲，大約55d後，根
5部會產生大量卵囊。將根取出並洗去泥土，用鑷子挑取卵囊置於培養皿中，用0.5%的次氯酸 鈉處理3min，再用無菌水衝洗三次，置於25'C培養箱中進行孵化。3d左右就會孵化出很多2 齡幼蟲，吸到滅菌的三角瓶中，置於4'C的冰箱中備用。
3.試驗方法
3.1 A "扭r Y-61代謝物對線蟲的作用在經滅菌的40孔組織培養板中加入不同濃度的 試驗用發酵液各100 y L，以加100u L無菌水作為對照，然後分別向處理和對照中各加入100 PL線蟲懸浮液(約含線蟲20. 11. 士2.06條)，放入25'C培養箱中，24h後記錄線蟲死亡率， 計算校正死亡率即為殺線蟲藥效。每處理重複4次。
死亡線蟲數 觸死亡率(%)=I^^X100
校正死亡率(%)=處理線，:率:，線玄蟲死亡率x則
l一對照線蟲死匸率 3. 2 A "&er Y-61代謝物對南方根結線蟲卵囊孵化的作用
在每個無菌的直徑為6cm的塑料培養皿中放入3個表面消毒的發育較一致的卵囊，分別 加入3mL不同濃度的試驗用發酵液，以加入3mL無菌水作為對照。試驗在25'C下進行，將各 處理塑料培養皿用封口膜封嚴，以減少汙染以及液體蒸發。7d後鏡檢各處理卵囊孵化情況。 計算卵囊孵化線蟲數和卵囊孵化的相對抑制率。每處理重複4次。
相對抑制率《),照孵，S，線蟲數x觸
對照孵化線蟲數
試驗3. 1和3.2的操作均在無菌環境下進行，儘量避免環境和人為因素對試驗結果的影
響<
4.試驗結果
(1 ) A Y-61代謝物對南方根結線蟲2齡幼蟲的殺線蟲效果
表1 AY-61發酵液不同稀釋倍數對南方根結線蟲2齡幼蟲的影響
稀釋倍數 2齡幼蟲的平均死亡率(％)~~校正死亡率(％)
10x46.99dD 44.46
5x 75.47cC 74.30
80.73cBC 79.81
5x 89.64bAB 89.19
10x 97.78aA 97.67
4.55eE -
82.28cBC 81.44
77.44cC 76.36
注CK1:無菌水處理；CK2: 10 u g/nil 1.8%阿維菌素乳油處理；CK3: 10ug/ral 10%克線丹顆粒劑處理 結果表明，各稀釋濃度的發酵液和無菌水對照之間差異顯著，其濃縮5x和濃縮IOX液均
釋釋液縮縮1 2 3
稀稀原濃濃g g g與阿維菌素和克線丹差異顯著，而其原液和稀釋5x與阿維菌素和克線丹相當，差異不顯著。 (2) A Y-61代謝物對南方根結線蟲卵囊孵化的作用
表2 A Y-61發酵液不同稀釋倍數對南方根結線蟲卵囊孵化的影響
稀釋倍數卵囊平均孵化線蟲數(條)相對抑制率(％)
釋10x61.33bB49-87
稀釋5x53.33cB56.40
原液20扁C83.66
濃縮5x楊eD96.73
濃縮10x1.33eD98.9〗
CK1122.33aA"-
CK22.33eD98.10
CK32.67eD97.82
注CK1:無菌水處理；CK2: 10u g/ml 1. 8%阿維菌素乳油處理；CK3: 10u g/ml 10%克線丹顆粒劑處理
結果表明，各稀釋濃度的發酵液和無菌水對照處理的卵囊之間，對線蟲孵化影響差異顯
著，特別是10倍液幾乎不能孵化，其濃縮5x和濃縮10x液與阿維菌素和克線丹差異不顯著。 通過以上兩種對線蟲活力和卵囊孵化的抑制作用試驗結果表明，AY-61是一株極具有應
用價值的真菌，特別是對南方根結線蟲的殺線蟲作用和對其卵囊孵化的抑制作用，顯示出其良 好的應用開發前景。
實施例6:菌株A m'ge/" Y-61的溫室盆栽試驗殺線蟲活性
採用液體發酵獲得的發酵液經不同濃度處理後，在溫室盆栽防治番茄根結線蟲
(ifeJca't/ogy"e //7C。卵"3)， 效果如下 供試材料和方法
番茄品種為L402
線蟲南方根結線蟲臉7o油gJ77e J.77C。狎'Z^
每株番茄定植後第5d接種根結線蟲5000粒卵，接種後第3d用發酵液進行灌根處理，每 株灌藥液40tnl。正常田間管理，分別在45d和80d調査根結數。灌注清水為對照CK1、阿維菌 素為CK2、克線丹為CK3。
結果如下表
處理45d根結 數45d (%)防治效果80d根結數80d (%)防治效果
稀釋Ox96aA5. 88213bcBC39. 14
稀釋5x52bAB49.20163cdCD53.43
原液43bAB57.84llObB68.57
濃縮5x18bcB82.3566dDE81. 14
濃縮10xlcB99.0210e伍97. 14
CK1皿aA—301aA—
CK23cB97. 0617e伍95. 14
CK3lcB99.02l伍99. 71
7注CK1:無菌水處理；CK2: 10 U g/flll 1. 8%阿維菌素乳油處理；CK3: 10ug/ml 10%克線丹顆粒劑處理 結果表明，該發酵液在沒有任何助劑填加的條件下，濃縮至5X至濃縮IOX液防治根結線 蟲的效果可以達到80%_90%，該濃度已經達到產業化開發利用的濃度要求。
權利要求
1、保藏號為CGMCC No.2631的菌株。
2、 真菌代謝物，其特徵在於，是由權利要求l所述的菌株經過液體發酵提取製備而成。
3、 根據權利要求2的真菌代謝物，其特徵在於，所用的液體發酵培養基配方為以重量百分 比計，含有麥芽糖1.6%-2.4%、葡萄糖0.6%-1.4%、蛋白腖0.06%-0. 14%、酵母膏 0.06%-0. 12% 、 KH2P04 7H20 0. 06%-0. 14%、 MgS(X 0. 03-0. 07%, Cacl2 2H200. 15%、 Fecl3 0. 098%、 ZnS04 7H20 0. 0002%，餘下為蒸餾水，pH為6-7。
4、 根據權利要求3的真菌代謝物其特徵在於，液體發酵培養基配方的pH為6.5。
5、 製備殺線蟲製劑的方法，根據權利要求1所述的菌株經過常規的液體發酵後製備而成，其 特徵在於該真菌的液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有麥芽糖1.6%-2.4%、 葡萄糖0.6%-1.4%、蛋白腖0.06%-0. 14%、酵母膏O. 06%-0. 12% 、 KH2P04 7H20 0. 06 %-0. 14%、 MgS040. 03-0. 07%， Cacl2 2H200. 15%、 Fecl30.098%、 ZnS04 7H20 0. 0002 %，餘下為蒸餾水，pH為6-7。
6、 根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，pH為6.5。
7、 一種殺線蟲製劑，其特徵在於，包含權利要求1所述的真菌或權利要求2所述的真菌代謝 物。
8、 權利要求1所述的真菌或權利要求2所述的真菌代謝物或權利要求5所述的殺線蟲製劑的 應用。
9、 根據權利要求8的應用，其特徵在於應用防治植物寄生線蟲。
10、 根據權利要求9的應用，其特徵在於，所述的植物寄生線蟲為根結線蟲(ifeJwV^y/7e spp.)。
全文摘要
本發明涉及一株具毒殺植物寄生線蟲作用的真菌的培養方法及其代謝物製備方法和應用，屬於微生物農藥技術領域。本發明涉及的真菌菌株Aspergillus niger Y-61，已於2008年8月7日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2631。Y-61的分類地位是有絲分裂孢子菌類，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，麴黴屬，黑麴黴。通過液體發酵培養製備，其代謝物對植物寄生線蟲，特別是對根結線蟲具有毒力高，殺線蟲效果明顯的突出特點，室內測定本菌株發酵液對南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)2齡幼蟲和卵囊孵化的影響。不同稀釋濃度發酵液的處理和無菌水處理有顯著差異，發酵液的5倍液以上濃度與10μg/ml克線丹的防效相當。具良好的應用開發前景。
文檔編號C12N1/14GK101445785SQ20081018826
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者霆 劉, 劉偉成, 劉建華, 劉德文, 盧彩鴿, 裘季燕 申請人:北京市農林科學院