一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應用的製作方法

2023-06-07 11:19:31 2

專利名稱：一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應用，特別涉及一株 Sphingobium japonicum菌株及其在降解丙體六六六中的應用。
背景技術：
六六六(Hexachlorocyclohexane，HCH)是一種廣譜性的有機氯殺蟲劑，主要有 α、β、Y和δ (甲體、乙體、丙體、丁體)等4種異構體，其異構體的相對持久性與氯原子 在環己烷結構上的排列方式有關，持久性順序為β-HCH > δ -HCH > Y -HCH > α-HCH。由 於六六六的低水溶性和高氯狀態，在環境中非常穩定。在斯德哥爾摩公約中，六六六已經被 列為12種持久性有機汙染物之一。在這4種異構體中，只有丙體六六六(γ-HCH，又稱為林 丹)具有殺蟲活性，主要用來防治農作物害蟲。六六六由於其毒性大，難分解，分布廣，危害重，在大量使用的同時也給環境造成 難以修復的危害，加之由於其脂溶性大的特點，通過食物鏈的富積對人類自身的影響正在 逐漸的顯現出來並加大。隨著人們認識的加深和替代品的出現，20世紀80年代後，大部分 發達國家包括一些發展中國家禁止生產和使用混合六六六，六六六的總含量明顯降低。20 世紀90年代後，六六六的主要來自印度。同時，相當數量的未使用的混合六六六存在自然 界中，包裝容器的損壞和滲漏給人類和野生生命造成了嚴重的威脅。中國曾是生產和使用 六六六的大國，自20世紀60年代初開始生產有機氯農藥，到1983年停止生產，產量呈逐年 持續增長趨勢。這一時期六六六的大量使用造成了該類農藥在土壤和農作物中的大量積 累，在沒有使用過農藥的地區，如西藏南迦巴瓦峰土壤和西藏庫拉崗日峰地衣、苔蘚中都檢 測到了六六六。自1983年禁止生產六六六後，食物中的殘留量有了明顯降低，但這並不意 味著六六六的危害不存在了。據對水體中的農藥檢測，黃河部分河段、白洋澱地區端村水域 生態系統、珠江三角洲地區都檢測到了一定濃度的六六六。研究表明，六六六為環境內分泌幹擾物，具有類雌激素行為，幹擾體內正常內分泌 物質的合成與代謝，可導致生殖和發育障礙，殘留的六六六對人類和動物的健康構成了嚴 重的威脅。但目前對於已經施用過六六六的環境綜合治理，一直未見有比較成熟的技術。

發明內容
本發明的目的本發明的目的在於針對環境保護和生產實踐中的實際問題和需求， 提供一種從長期受農藥汙染土壤中篩選分離的，能以林丹為唯一碳源和能源生長，並可以 高效降解丙體六六六(林丹)的菌株。本發明所提供的菌株，是Sphingobium japonicum HZ-Al0Sphingobium japonicum HZ-Al已於2009年12月28日保藏於中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC N2 3539。本發明的Sphingobium japonicum HZ-A1，是從長期受六六六和滴滴涕等有機氯農藥汙染的土壤中分離篩選的。HZ-Al的形態和生理生化特徵為在LB平板上30°C培養4 天后形成黃色扁平的.具有清晰邊緣、不透明的菌落該菌有極生鞭毛，G—，直或彎杆狀，具有 接觸酶和氧化酶活性，產黃色色素.菌體周圍產莢膜，能利用葡萄糖、半乳糖、海藻糖和阿 拉伯糖氧化產酸。Sphinobium japonicum HZ-Al CGMCC Na 3539在降解六六六中的應用也屬於本 發明的保護範圍。所述應用中，所述六六六為丙體六六六。其中，所述降解六六六的方法是將所述 Sphingobium japonicum HZ-Al CGMCC Ns . 3539接種到含有六六六的體系中培養。所述培養的溫度為15-45 °C，優選為30°C。所述Sphingobium japonicum HZ-AICGMCC Na 3539 的接種量為 105cfu/g 以上，優選為 105_106cfu/g。該菌能以林丹為唯一碳源和能源生長，並可以在12小時內完全降解20mg/l的林 丹。實驗證明，使用PH值為7的無機鹽培養液按10%接種量接種本發明的六六六降解菌， 在30°C對10 100mg/l的林丹有良好的降解效果。實驗室內的土壤修復實驗表明該菌在 30天內可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對汙染的土壤中有良好的降解效果，具有應用於 田間修復六六六汙染的土壤和水體的潛力。


圖1為菌株HZ-Al對20mg/l γ -六六六的降解曲線2為菌株HZ-Al降解Y-六六六的產物的色譜和質譜圖(Α:色譜圖；B:l，2， 4-TCB質譜圖；C γ -PCCH質譜圖)圖3為PH值對菌株HZ-Al降解、-六六六的影響圖4為溫度對菌株HZ-Al降解γ -六六六的影響圖5為底物濃度對菌株HZ-Al降解γ -六六六的影響圖6為HZ-Al在土壤中對Y-HCH(20mg/kg)的降解曲線圖( -接菌的燻蒸樣品；■-接菌的未經燻蒸樣品；▲-未接菌的燻蒸樣品；χ-未接菌的未燻蒸樣品)
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1、Sphingobiumjaponicum HZ-AICGMCC Na 3539 的分離、純化及鑑定。本發明的發明人從長期受六六六和滴滴涕等有機氯農藥汙染的土壤中分離篩選 一株對Y-HCH具有降解作用的菌株，具體步驟如下將從北京宋家莊地區附近採集的長期 受六六六和滴滴涕等有機氯農藥汙染的活性土樣接種以到以Y_HCH(50mg/l)作為唯一碳 源的無機鹽溶液中振蕩培養。轉接培養6次後，菌懸液以10倍梯度稀釋接種到含Y-HCH 的無機鹽固體培養基上，30°C恆溫箱培養。選取生長快，菌落規則，傳代穩定的菌落，純化 2 3次後得到純菌株；將分離出的5株菌作為復篩菌株在LB培養基中擴大培養至相同的 OD600nm值1. 0，以10% (105cfu/g)的接種量接入含有20mg/l y -HCH的無機鹽培養基中， 於30°C，ISOrpm搖床培養48h，以不接菌的培養基作為對照，用氣相色譜(GC-EOT)定量測 定降解率(降解率(％ )=(對照組六六六含量一樣品組六六六含量)/對照組六六六含量X 100)，最終篩選到降解效率最高的一株菌，將該菌株命名為HZ-A1，轉入牛肉膏蛋白腖 斜面保存。
上述無機鹽培養液是按下述比例配製的在IOOOml水中，K2HPO4,1. 5g/l ；KH2PO4,
0.5g/l ； (NH4)2S04，0. 5g/l ；NaCl，0. 5g/l ；MgSO4, 0. 2g/l ；CaCl2,0. 05g/l ；FeSO4, 0. 02g/l ； 酵母粉，0.002g/l，ρΗ7.0，12 高壓滅菌20min。無機鹽固體培養基是將上述無機鹽培養 液加入佔無機鹽培養液總重量的1. 5 2. 0% (g/Ι)的瓊脂。上述LB培養基與文獻(微生物學實驗[M]，北京，高等教育出版社，1988，75-78) 中相同。上述所用的氣相色譜的檢測條件為惠普5890II型氣相色譜(Hewlett-Packard 5890series II)，ECD 檢測器，毛細柱為 0V-1701，柱長 25m，內徑 0. 32mm,膜厚 0. 25 μ m，檢 測器溫度300°C，進樣口溫度250°C，柱溫210°C，載氣為氮氣，柱壓7. 7psi，柱流速5. 4ml/ min。在這些檢測條件下，Y-HCH的保留時間分別為4. 7min。將測得的每個樣品對應的峰 面積代入預先建立的峰面積_濃度標準曲線，就可以計算出Y -HCH的濃度。採用安捷倫公司的氣質聯用儀(GC 6890N-MSD 5973N)分析Y-HCH的降解產物。 色譜條件色譜柱J&W HP-5石英毛細柱(30mX0. 25mmX0. 25μπι)；升溫程序；80°C保持
1.5min,以 20°C /min 升至 190°C，保持 Omin，以 5°C /min 升至 230°C，保持 Omin，以 25°C / min升至290°C，保持Omin ；載氣(He)流速1. OmL/min,進樣量2 μ L，進樣口溫度250°C。質 譜條件電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV ；傳輸線溫度280°C ；離子源溫度230°C ；四 級杆溫度150°C。將HZ-Al採用美國BIOLOG微生物分類鑑定系統對降解菌進行分類鑑定。將純化 的HZ-Al菌株在Biolog培養基上培養16-24h ；採用幹管法以GN/GP-IF製備菌懸液，調整 濁度52% T ；菌懸液以每孔150 μ 1接種於GN-Microplate鑑定板，測定每個孔的吸光度 值，測定的結果與資料庫比對，由軟體自動給出鑑定結果。經BIOLOG技術鑑定該菌株為 Sphingobium japonicum。Sphingobium japonicum HZ-Al已於2009年12月28日保藏於中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微 生物研究所)，保藏登記號為=CGMCC Na . 3539。本發明提供的Sphingobium japonicum HZ-A1的形態和生理生化特徵為在LB平 板上30°C培養4天後形成黃色扁平的.具有清晰邊緣、不透明的菌落該菌有極生鞭毛，G-, 直或彎杆狀，具有接觸酶和氧化酶活性，產黃色色素.菌體周圍產莢膜，能利用葡萄糖、半 乳糖、海藻糖和阿拉伯糖氧化產酸。本發明提供的六六六降解菌HZ-Al的代謝特性為該菌能以林丹為唯一碳源和能 源生長，並可以在12小時內完全降解20mg/l的林丹。使用pH值為7的無機鹽培養液按 10% (ν/ν)接種量接種本發明的六六六降解菌，在30°C對10 100mg/l的林丹有良好的降 解效果。實驗室內的土壤修復實驗表明該菌在30天內可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對 汙染的土壤中有良好的降解效果，具有應用于田間修復六六六汙染的土壤和水體的潛力。實施例2、對本發明提供的六六六降解菌HZ-Al的降解性能進行測定。一、六六六的降解和菌株生長實驗HZ-Al的單菌落先在LB培養基中30°C擴大培養16h，培養至OD6tltlnm值為1. 5，培養物4°C、6000rpm離心5min，用無菌的無機鹽培養液(成分如實施例1中所述)洗滌菌 體沉澱，並用無機鹽培養液配置成菌懸浮液，以10%的接種量(1.5 XlO5CfVg)分別接入 含有 20mg/l y -HCH 的無機鹽培養基(K2HPO4,1. 5g/l ；KH2PO4,0. 5g/l ； (NH4) 2S04，0. 5g/l ； NaCl,0. 5g/l ；MgSO4,0. 2g/l ；CaCl2,0. 05g/l ；FeSO4,0. 02g/l ；酵母粉，0. 002g/l ；其餘為 水，pH7. 0，121°C高壓滅菌20min)中，於30°C，180rpm搖床培養12h，每隔2h取樣一次，用氣 相色譜(GC-ECD)定量測定降解率(檢測條件同實施例1)，用DU 800分光光度計測定培養 物在600nm的光密度，來表徵細胞的生長。液體培養基中農藥的萃取過程如下10ml液體培 養基中加入等量正己烷，劇烈振蕩，混合物在4°C、3000rpm離心IOmin分層，小心收集上層 有機相。此有機溶劑萃取過程重複3次。抽提液中加入無水硫酸鈉乾燥後，用正己烷適當 稀釋，然後抽提液用氣相色譜分析。在降解實驗中，未接種菌株HZ-Al的培養基(含20mg/ 1 Y -HCH)作為對照。上述實驗表明，在無機鹽培養基中HZ-Al對林丹的降解能力，從圖1中可以看出在 12小時之內，隨著培養基中的六六六作為菌體生長的碳源被利用，培養液的細胞密度也相 應增長，HZ-Al可以完全降解20mg/l林丹。在降解過程中，隨著氯離子的不斷釋放，有PCCH 和1，2，4-TCB等中間產物生成(圖2. B和C)。相比之下，在未接種菌株HZ-Al的培養基中沒 有檢測到六六六的降解、和細胞的生長。圖1中， 為未接種HZ-Al的培養基中Y-六六六 的濃度，·為接種HZ-Al的培養基中Y-六六六的濃度，▲為接種HZ-Al的培養基中菌株的 生長速度(以OD6tltlnm表示)。圖2為菌株HZ-Al在含Y -六六六的培養基中培養6小時取 樣的色譜和質譜圖。二、不同因素對菌株HZ-Al降解特性影響的研究2. IpH值對菌株HZ-Al降解、-六六六的影響HZ-Al的單菌落先在LB培養基中30°C擴大培養16h，培養至OD6tltlnm值1. 5，培養 物。C、6000rpm離心5min，用無菌的無機鹽培養液(成分如實施例1中所述)洗滌菌體沉 澱，配置成菌懸浮液，以10%的接種量(1. 5X105cfu/g)分別接入含有20mg/l Y-HCH的無 機鹽培養基中，分別將初始培養液的PH值分別調為5. O、5. 5、6. O、6. 5、7. O、7. 5、8. O、8. 5， 並以不接菌作為對照，每個樣品兩個平行。在30°C下、200rpm培養30h。用GC測定培養基 中六六六的濃度，計算降解率(方法同實施例1)，萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結果如圖3所示，該菌株在pH6. 5 8. 5的範圍內生長和降解效果均較好，其中在 PH7.0時的降解能力最強。2. 2溫度對菌株HZ-Al降解、-六六六的影響HZ-Al的單菌落先在LB培養基中30°C擴大培養16h，培養至OD6tltlnm值1. 5，培養物 4°C、6000rpm離心5min，用無菌的無機鹽培養液洗滌菌體沉澱，配置成菌懸浮液，以10%的 接種量(1.5X105cfU/g)分別接入7份含有20mg/l γ-HCH的無機鹽培養基中(pH7. 0)，分 別將培養溫度分別調為15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C，200rpm培養30h，並以不 接菌的培養基在與上述相同條件下放置作為對照，每個樣品兩個平行。用GC測定培養基中 六六六的濃度，計算降解率(方法同實施例1)，萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結果如圖4所示，從圖4中可以看出，菌株在25 35°C時的降解效率都比較高，其 中在30°C時降解速度最快。2. 3菌株HZ-Al對不同濃度的Y -六六六的降解
HZ-Al的單菌落先在LB培養基中30°C擴大培養16h，培養至OD6tltlnm值1. 5，培養物 4°C、6000rpm離心5min，用無菌的無機鹽培養液(成分如實施例1中所述)洗滌菌體沉澱， 配置成菌懸浮液，以10%的接種量(1. 5X105cfu/g)分別接種於IOml含不同濃度(10，20， 50，80，120和15011^/1) Y -六六六的無機鹽培養基中，在30°C下、200rpm培養7天。並以不 接菌作為對照，每個樣品兩個平行。用GC測定培養基中六六六的濃度，計算降解率(方法 同實施例1)萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結果如圖5所示，結果表明，當外加Y -六六六的濃度在10 50mg/l時，菌株可 以在一周內將其完全降解。然面，當外加Y-六六六的濃度超過80mg/l時，則表現出明顯 的底物抑制效應，Y-六六六的降解速度明顯減慢。三、HZ-Al對六六六汙染土壤的生物修復在校園中採集土壤樣品，樣品用直徑2mm的濾網過濾，除去土壤中的顆粒物質。土 壤樣品存放於4°C冰箱。取一部分土壤樣品，用氯仿燻蒸法對土壤進行消毒處理。先將氯 仿加入盛有土壤的容器中，密閉容器，使其散發為氣態，滲入土壤樣本以殺死所有微生物， 再開啟容器使土樣中殘餘氣態氯仿全部散發。將Y-六六六加入到IOOg 土壤中，使其終濃 度為20mg/kg，攪拌混合均勻。將HZ-Al的細胞懸液以每g 土壤IO6個細胞接種量加入到 IOOg燻蒸和未燻蒸的土壤中，攪拌混合均勻。未接種HZ-Al的燻蒸和未燻蒸的土壤作為對 照。土壤置於30°C培養箱中培養15d。在整個培養期間，不斷噴灑添加無菌的去離子水，以 保持土壤的含水量在50%附近。測定HZ-Al在土壤中是否對Y-HCH具有降解作用，同時研 究HZ-I在有額外的碳源存在下與土壤中其他微生物的相互關係，本研究中分別將HZ-I接 種到燻蒸土壤和未燻蒸土壤兩種處理中，未接種的燻蒸土壤和未接種的未燻蒸土壤作為對 照，每個對照和處理都重複三次。結果表明，在24天內，兩種對照中的Y -HCH的濃度幾乎都沒有變化。從圖6中可 以看出，Y-HCH在經燻蒸的土壤中的降解速率明顯比在未燻蒸土壤快，在燻蒸的土壤中18 天基本可以完全降解，而在未燻蒸土壤中需要24天。24天後HZ-Al能從未經燻蒸的土壤中 分離出來，這說明在該土壤中的降解作用主要由HZ-Al完成。以上結果說明，HZ-Al菌株在施入土壤中後，沒有出現不產生降解或降解率急劇下 降的現象，它的降解性能仍然穩定和優良，這就為該菌株作為受六六六汙染的土壤修復劑 提供了科學的試驗依據。本實驗表明該菌對六六六汙染的土壤有良好的修復能力，為該菌 的大規模應用奠定了基礎。
權利要求
Sphingobium japonicum HZ-A1，其保藏登記號為CGMCC № 3539。
2.Sphingobium japonicum HZ-Al CGMCC Na 3539 在降解六六六中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述六六六為丙體六六六。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於所述降解六六六的方法是將所述 Sphingobium japonicum HZ-Al CGMCC Na 3539接種到含有六六六的體系中培養。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述培養的溫度為15-45°C，優選為 30 "C。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於所述SphingobiumJaponicumHZ-Al CGMCC Na 3539的接種量為105cfu/g以上。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述Sphingobiumjaponicum HZ-AICGMCC Na 3539 的接種量為 105_106cfu/g。
全文摘要
本發明公開了一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應用。該菌株為Sphingobium japonicum HZ-A1，其保藏登記號為CGMCC № 3539。本發明的菌株可以在12小時內完全降解20ppm的林丹。該菌在30天內可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對汙染的土壤中有良好的降解效果，具有應用于田間修復六六六汙染的土壤和水體的潛力。
文檔編號B09C1/10GK101805714SQ201010130739
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月22日 優先權日2010年3月22日
發明者喬傳令, 崔峰, 張衡, 江紅 申請人:中國科學院動物研究所